Цикл наукових праць «кальцій-залежні клітинні механізми та їх роль в патологічних станах»

1. 
   БІЛАН Павло Володимирович - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, завідувач Лабораторії молекулярної біофізики Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
   
2. 
   ВОЙТЕНКО Нана Володимирівна - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, завідувач Лабораторії сенсорної сигналізації, заступник директора Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
   
3. 
   ГОРДІЄНКО Дмитро Валерійович - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, завідувач Лабораторії молекулярної фармакології та біофізики клітинної сигналізації Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
4. 
   ДОСЕНКО Віктор Євгенович - доктор медичних наук, професор, провідний науковий співробітник відділу загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
5. 
   ІСАЄВ Дмитро Сергійович - кандидат біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
6. 
   ІСАЄВА Олена Валентинівна - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, старший науковий співробітник відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
7. 
   КОПАЧ Ольга Володимирівна – кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник лабораторії сенсорної сигналізації Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
8. 
   МАКСИМЮК Олександр Петрович – кандидат біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
9. 
   ПІВНЕВА Тетяна Андріївна - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, провідний науковий співробітник відділу цитології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
   
10. 
    СКИБО Галина Григорівна - доктор медичних наук, професор, завідувач відділу цитології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
    

ВСТУП

Наукова новизна даного циклу робіт полягає у встановленні закономірностей молекулярних шляхів виникнення функціональних патологій, що викликані порушенням механізмів кальцієвої регуляції, а також у розробці новітніх методів фармакологічного/генетичного впливу, що спрямовані на корекцію цих порушень, та, відповідно, стану організму в цілому. Зокрема, авторами досліджено просторову організацію та молекулярні механізми регуляції кальцієвої сигнальної системи у різних типах клітин на субклітинному рівні, порушення якої пов’язано з такими патологіями як цукровий діабет, панкреатит, артеріальна гіпертензія, запальні та онкологічні захворювання, інсульт, патологічний біль різної етіології, ішемія та епілепсія. Виявлено нове сімейство кальцій-проникних каналів, панексинів, що забезпечує внутрішньо  та міжклітинну кальцієву сигналізацію. Авторами вперше ідентифіковано спеціалізовані інтерстиціальні клітини в стінці кровоносних судин, що виконують пейсмекерну функцію. Авторами розроблено нові біофізичні методики, що дозволяють кількісно реєструвати вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул, а також визначати кількість кальцію, звільненого або захопленого клітинами та клітинними органелами внаслідок функціонування їх кальцій-регулюючих систем. Авторами вперше показано, що окремі секреторні гранули є внутрішньоклітинними кальцієвими депо. Вперше описані молекулярні механізми виникнення хронічного болю, що опосередковані глутаматними рецепторами.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

Цукровий діабет є одним із чинників, що обумовлюють розвиток дегенеративних змін у центральній та периферичній нервовій системі. Авторами були досліджені зміни мембранних та внутрішньоклітинних білкових структур, що виникають при експериментальному цукровому діабеті в нейронах, що приймають участь в проведенні больових сигналів до центральної нервової системи. Експериментальний діабет призводив до істотних змін у кальцієвій регуляції в нейронах дорсального рогу (ДР) і дорсально-корінцевих гангліїв (ДКГ) – нейронах входу соматосенсорної ноцицептивної системи, які саме і беруть участь у передачі больових сигналів. Ці зміни включали у себе стійке підвищення цитозольної концентрації Ca²⁺, зниження амплітуди сигналів внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію ([Ca²⁺]_i), викликаних деполяризацією мембрани або дією нейромедіаторів, а також збільшення часу відновлення [Ca²⁺]_i транзиєнтів. Важливість цієї роботи полягала у тому, що корекція функціонування білкових структур, що відповідальні за регуляцію [Ca²⁺]_i могла призвести до розробки нових методів боротьби з дегенеративними змінами у центральній та периферичній нервовій системі.

Спроби корекції метаболічних порушень, що виникають при цукровому діабеті на молекулярному та клітинному рівнях - новий крок в лікуванні діабетичних ускладнень. Блокатори кальцієвих каналів виявились найбільш природнім вибором в якості ліків для усунення багатьох діабетичних порушень. Широко відомим блокатором кальцієвих каналів є німодипін. Він відносно легко проходить крізь гемато-енцефалічний бар’єр, внаслідок чого цей член сімейства дигідропіридинів найчастіше використовується для вивчення дії блокаторів кальцієвих каналів на нейрональний кальцієвий гомеостаз і функціонування нейронів. У циклі робіт авторами було показано, що німодипін діє не лише як блокатор кальцієвих каналів, але й позитивно регулює інші системи кальцієвого гомеостазу, функція яких знижена при діабеті. Більше того, в останніх роботах авторами було показано, що тривале лікування німодипіном ефективно нормалізувало порушений кальцієвий гомеостаз в нейронах ДКГ і ДР тварин, хворих на діабет, разом зі значним зменшенням ступеню викликаної діабетом термічної гіпоалгезії та полегшенням інших симптомів діабетичної нейропатії. (Рис. 2).

Рис. 2. Коригуюча дія німодіпіну при цукровому діабеті. Німодіпін нормалізував як параметри регуляції внутрішньоклітинних іонів кальцію (А і Б – амплітуди ) у периферичних та центральних нейронах, що відповідають за термічну чутливість так і термічну чутливість тварин уражених діабетом (В).

Анатомічні і фізіологічні особливості мозку дитини зумовлюють підвищену здатність нервової тканини до генерації епілептичної активності. З використанням експериментальних моделей епілепсії було проведено детальне дослідження механізмів виникнення епілептичних нападів у ранньому віці. Показано, що мозок на перших етапах постнатального розвитку є надзвичайно чутливим до дії проепілептичних агентів, внаслідок несинхронізованих змін гальмівної та збуджуючої синаптичної систем. З використанням експериментальних моделей неонатальних судом було проведено комплексне дослідження короткотривалих і хронічних наслідків епілептичних нападів на нервову активність кори головного мозку. Встановлено, що епілептичні напади призводять до порушень механізмів залучених у формування емоцій та консолідації пам'яті. Продемонстровано, що неонатальні напади в ранньому віці призводять до хронічних змін балансу збудження/гальмування в корі головного мозку, що збільшує вірогідність до рецидивного розвитку судом. Епілептичні напади часто є клінічною ознакою внутрішньомозкового крововиливу (ВМК) в результаті черепно-мозкової травми, інсульту, церебрального атеросклерозу та ін. Проведено масштабне дослідження механізму проепілептичної дії тромбіну на клітинному рівні. Показано, що тромбін викликає деполяризацію мембранного потенціалу внаслідок впливу на ТТХ чутливі постійні натрієві струми. Цей вплив є опосередкованим активацією протеїнкінази С внаслідок впливу на тромбін-чутливі рецептори. Клітинні механізми, відповідні за виникнення нападів під час потрапляння компонентів крові у нервову тканину описані в даній роботі мають важливе значення для розробки належної медичної допомоги під час ВМК.

Близько 30% пацієнтів з діагнозом епілепсія є нечутливими до будь-яких відомих протиепілептичних препаратів, тому пошук нових терапевтичних стратегій залишається пріоритетним напрямком розвитку протиепілептичних препаратів. Авторами вперше запропонований і детально досліджений принципово новий підхід для контролю збудливості нервової мережі - вплив на поверхневі заряди зовнішньоклітинної мембрани. Продемонстровано, що зниження рівня поверхневого заряду за рахунок зниження рівня негативно-заряджених сіалових кислот нейрамінідазою призводить на клітинному рівні до збільшення порога активації потенціалкерованих натрієвих каналів та порога потенціалу дії; на рівні нервової мережі і цілого організму справляє потужну протиепілептичну дію на гострих та хронічних експериментальних моделях епілепсії; не викликає загибелі клітин мозку і не призводить до змін у поведінці піддослідних тварин.

Нещодавні дослідження у галузі молекулярних механізмів розвитку та підтримання запального хронічного болю, проведені співавторами роботи, показали, що функціонування екстрасинаптичних AMРA рецепторів у сенсорних нейронах спинного мозку зазнає драматичних змін функціонування при больових станах, викликаних тривалим периферичним запаленням. Подібні зміни спостерігались також у функціонуванні синаптичних АМРА рецепторів нейронів спинного мозку. Загалом, кальцієва провідність AMPA рецепторів у синапсах та екстрасинаптичній мембранах істотно зростає у нейронах дорзального рогу спинного мозку при тривалому периферичному запаленні. Авторами з’ясовано молекулярний механізм, який лежить в основі такого збільшення. Доведено критичну роль активації протеїн кінази С підтипу α для запуску інтерналізації GluR2 субодиниць AMPA рецепторів із синапсів і вбудовування GluR1 субодиниць AMPA рецепторів у екстрасинаптичні мембрани (Рис.3). При чому інгібування протеїн кінази С призводило до зменшення больової чутливості при тривалому запаленні (Рис. 3). Вищеназване призводить до збільшення кількості Ca²⁺-проникних AMPA рецепторів у синапсах та позасинаптичних мембранах сенсорних нейронів спинного мозку та зростання їх частки у загальній кількості всіх AMPA рецепторів. Такі зміни функціонування синаптичних та екстрасинаптичних AMРA рецепторів є одними із ключових механізмів центральної сенситизації, ф
еномену, який, вважається, опосередковує розвиток та підтримання больових синдромів.

З’ясування причин нейродегенеративних захворювань та їх наслідків і розробка способів запобігання їх розвитку є принципово важливими завданнями сучасної неврології. Одним з найпоширеніших представників згаданої групи захворювань є розсіяний склероз (PC). Перспективним напрямком при лікуванні РС є дослідження речовин, котрі здатні впливати на стан мієлінових оболонок. Уперше виявлено протекторну дію екстракту з гриба Hericium erinaceus на процес міелогенезу in vitro. Цей екстракт має захисні властивості відносно цілісності мієлінової оболонки аксонів і значно зменшує ступінь її деструкції під час дії сироваток крові пацієнтів з розсіяним склерозом, що дозволяє характеризувати його як біопрепарат, що перешкоджає руйнуванню мієлінових оболонок та/або сприяє їх відновленню.

Гліальні клітини є складовою частиною комунікаційних мереж мозку. Астроцити можуть розглядатися, як партнери нейронів внаслідок їх динамічної взаємодії з синапсами шляхом виділення і поглинання нейротрансмітерів, а також участі у внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації. Вперше показано наявність синаптичних входів до астроцитарних клітин гіпокампа, що свідчить про те, що обробка інформації в структурах мозку, що мають синапс, є функцією не тільки виключно нейронів.

Відомо, що мікрогліальні клітини залучені до реорганізації нейронів, та є основними імунокомпетентними клітинами в ЦНС. Вони відіграють ключову роль у розвитку різних патологічних станів мозку. Уперше показано, що відсутність хемокінових рецепторів CXCR3 у мікрогліальних клітин призводить до розладів їх функцій в умовах антероградної дегенерації аксонів нейронів енторинальної кори в гіпокампі мишей і порушує здатність мікроглії до міграції в зону ушкодження. Вперше показано, що порушення міграції мікрогліальних клітин у зону ушкодження внаслідок дефіциту рецепторів СXСR3 обумовлює пригнічення фагоцитарної функції мікроглії і тим самим сприяє анормальному збереженню деградованих дендритів нейронів.

Р
ис. 4. Нейропротекторна дія діетилового ефіру 2,4-піридинкарбоксильної при експериментальному ішемічному ураженні мозку

Серед причин, що несуть загрозу виникнення незворотних структурних ушкоджень нервової тканини і ризику розвитку з часом нейродегенеративних захворювань головного мозку лідирують гострі порушення мозкового кровообігу. Мозковий інсульт як прояв цереброваскулярної патології – серйозна енергетична і метаболічна катастрофа, сукупність уражень із різноманіттям патофізіологічних механізмів загибелі уражених нейронів. При моделюванні патологічних станів головного мозку авторами було досліджено клітинні та молекулярні механізми розвитку нейродегенеративних захворювань.

Встановлено, що короткочасна церебральна ішемія в модельних системах (як in vitro, так і in vivo) обумовлює розвиток деструктивних морфологічних та функціональних змін нейральних клітин та синаптичного апарату в СА1 зоні гіпокампа, структури головного мозку, яка відповідальна за процеси формування пам’яті та навчання. Показано, що короткотривала ішемічна дія, яка не спричиняє швидкої загибелі нейронів, викликає значні структурні перебудови адаптивного характеру у синаптичному апараті, що свідчить про високу пластичність структур мозку (Рис. 4). Уперше проведено на світловому та електронно-мікроскопічному рівнях комплексне імуногістохімічне дослідження реакцій гліальних клітин гіпокампа і вивчено динаміку їх структурних змін після глобальної ішемії-реперфузії головного мозку.

Актуальність пошуку ефективних ліків для профілактики інсульту та корекції його наслідків і необхідність розробки нових терапевтичних засобів є безумовно очевидними. Нещодавно було показано, що блокада протон-керованих каналів ASIC1а типу може суттєво зменшити пошкодження, що викликане ішемічним інсультом. Нами розроблений ряд позитивно заряджених похідних кумарино-3-карбоксиамідинів, що в наномолярних концентраціях пригнічують активність ASIC1а каналів в центральних нейронах щурів. Більш того, це пригнічення є залежним від рівня pH, і досягає максимуму при значеннях, що спостерігаються під час ішемічного інсульту (pH ~ 6.8). При більш низьких значеннях pH ступінь пригнічення зменшується майже на 3 порядки. Таким чином, нами знайдено хемотип, що у наномолярних концентраціях пригнічує патологічну активацію ASIC1а каналів, не впливаючи при цьому на молекулярні механізми навчання, почуття страху та пам’яті та ін., що пов’язують з активацією ASIC каналів значними змінами pH у синапсах у процесі вивільнення нейромедіаторів. Подальші дослідження показали що кумарино-3-карбоксиамідини мають потужний нейропротекторний потенціал. Найбільш активна синтезована сполука має концентрацію половинного пригнічення IC50=27 нМ/л, для ASIC1а каналів людини. Таким чином, кумарино-3-карбоксиамідини можуть слугувати прообразом для новітніх високоефективних препаратів проти інсульту (Рис. 5).

Рис.5. Антагоністи ASIC1a каналів - інноваційні препарати проти ішемічного інсульту.

Використовуючи комплекс фармакологічних, електрофізіологічних, оптичних, імуноцитохімічних та молекулярно-біологічних методів автори провели дослідження на субклітинному рівні просторової організації та молекулярних механізмів регуляції кальцієвої сигнальної системи у гладеньком’язових та епітеліальних клітинах у нормі та патології. За допомогою розроблених ними алгоритмів комп’ютерного аналізу цифрових зображень автори зробили картографію локальних подій вивільнення Ca²⁺, та провели аналіз просторової організації та об’єму саркоплазматичного ретикулуму в живих гладеньком’язових клітинах. Автори вперше в світі провели пряме вимірювання продукування NO ендотеліальними клітинами та Na⁺ струмів в цих клітинах; дослідили властивості протонних каналів еозинофілів людини; продемонстрували синергізм між Ca²⁺ та інозитол-1,4,5-трифосфатом у регуляції рецептор-керованих катіонних каналів і Ca²⁺-індуковане вивільнення Ca²⁺ через інозитолтрифосфатні рецептори в різних типах гладеньком’язових клітин; встановили, що важливим механізмом порушення регуляції кровообігу нирки при первинній гіпертензії є атенюація P2X – опосередкованих Са²⁺ сигналів; показали, що у хребетних тварин нове сімейство протеїнів, панексини, не просто дублюють функцію конексинів, але й забезпечують додаткові шляхи для внутрішньо- та міжклітинної кальцієвої сигналізації; ідентифікували інтерстиціальні клітини Кахаля в стінці ворітної вени та довели їх пейсмекерну роль; показали, що при низькому рівні стероїдів вітамін D3 стимулює проліферацію ракових епітеліальних клітин передміхурової залози шляхом збільшення експресії ТRPV6 каналів, які опосередковують вхід кальцію в клітину; дослідили молекулярні механізми регуляції ТRPМ8 його малими ізоформами та довели роль цього протеїну як каналу вивільнення Са²⁺ з ендоплазматичного ретикулуму, який приймає участь у процесах канцерогенезу епітеліальних клітин передміхурової залози, таких як проліферація та апоптоз.

Автори: