Генді жасушаға тікелей енгізу тәсілдері

76
байланысып, бір бөлігі жасушаға енбей қалады. ДНҚ-ын 15-90%-ға дейін 
жасушалар қабылдайды. Бірнеше тәуліктен кейін енгізілген жасушалардың 
аз мөлшері ғана бөтен гендердің экспрессиясын жүргізе алады, бірақ одан 
кейін экспрессия дәрежесі күрт төмендеп, тұрақты трансформацияға 10
-3
- 10
-5
жасуша ғана ұшырайды. 
Трансфекция 
үшін 
ДНҚ-ын 
адсорбциялайтын 
ДЭАЭ-декстран 
қолданылады. Оны қолданған кезде жасушаға ену тиімділігі жоғары және 
экспрессиясы тезірек, алайда стабильді трансформация жиілігі кальций 
преципитатын қолданған кезбен салыстырғанда төменірек. Трансфекция 
жиілігін глицеринді шок (HEPES-буферіндегі глицериннің 15%-дық 
ерітінісінде 4 минут ұстау) жоғарылатады.
Жасушаға кез келген генді енгізуге болады, ол үшін мақсатты генге 
алдын ала клондалған селективті маркерді тігіп қою қажет. Алайда, ары 
қарай жүргізілген зерттеулер селективті маркерлерді жасушадан тыс жерде 
тігу міндеттілігін жоққа шығарды. Селективті генді қабылдайтын жасушалар 
онымен бірге кальций преципитатындағы басқа ДНҚ-ын да қабылдайтыны 
анықталды. Осылайша, трансформация әдісін қолдана отырып, ДНҚ-ның кез 
келген сегментін эукариоттардың өсіріліп жатырған жасушаларына енгізуге 
болады. Ол үшін ДНҚ-ын селективті маркермен бірге кальций преципитатын 
түзуге арналған ерітіндіге қосу қажет.
Трансфекция үшін хромосомаларды немесе олардың фрагменттерін 
қолдануға болады. Донор жасушалар митоз сатысында бұғатталады. 
Митоздық хромосомалар осмостық шок немесе гомогенизация әсерінен 
босатылып шығады. Оларды дифференциалды центрифугалау арқылы
тазартады. Хромосомаларды жасуша бетінде кальций хлориді арқылы 
тұндырады да, бірнеше сағаттан кейін мембраналарды перфорациялайтын 
реагенттермен (мысалы, глицерин) өңдейді.
Реципиент жасушаларды өңдеу мақсатында нашар тазартылған 
хромосомалар препараттарын қолданады, өйткені сол кезде хромосомаларға 
зақым аз келеді. Бір жасушадағы өңделетін хромосома саны шектеулі 
болады. Бір жасушада саны 20-дан аспайтын хромосоманы өңдеген абзал, 
өйткені егер хромосомалардың концентрациясы жоғары болған кезде, олар 
агглютинацияланып кетеуі мүмкін. Реципиент жасушаның құрамына енген 
донорлық ДНҚ фрагменттері өз беттерімен репликациялана алады. Енгізілген 
фрагменттерде көбінесе делециялар байқалады.
Жасушалардың барлығы бірдей геномның трансформациясына ұшырай 
бермейді. Мысалы, адамның фибробласттары плазмидалық ДНҚ-ын тиімді 
әрі жақсы қабылдайды да, бірақ геномдық ДНҚ-ын қоспайды.
Сүтқоректілердің жасушасына ДНҚ микроинъекциясын қолдану 
диаметрі 
0,1-0,5 
микрондық 
микропипеткаларды 
және 
микроманипуляторларды жасайтын құрылғының пайда болуының арқасында 
мүмкін болды. Осылайша, құрамында тимидинкиназа (ТК) гені және pBR322
герпес вирусының фрагменті бар плазмиданы ТК-жасушаларға енгізген 
кезде, олардың ТК-ген ядроға еніп, қалыпты репликацияланғандары 
байқалды. Микроинъекция арқылы ДНҚ-ын енгізу әдісін 70-ші жылдары 

77
Андерсон мен Диакумакос жасап шығарды. Жалпылап айтқанда, сенімді 
құрылғылар болған жағдайда, 1 сағаттың ішінде 500-1000 жасушаға 
инъекция жасауға болады, және олардың 50%-ында ДНҚ-ның тұрақты түрде 
енгізіліп,олардың экспрессиясы байқалған.
Сипатталған әдістің артықшылығы – кез келген ДНҚ-ын кез келген 
жасушаға енгізуге болатындығында және енгізілген генді жасушаның ішінде 
сақтап қалу үшін ешқандай қысымның қажеті жоқ.
24 сурет. Гендерді жасушаға микроинъекция әдісімен енгізу. 
Электропорация тоқтың жоғары кернеуінің биомембраналардың 
өткізгіштігінің қайтымды жоғарылауына негізделген. Электропорацияға 
арналған қоректік ортаға жасушалар мен оларға енгізілетін ДНҚ 
фрагменттері енгізіледі. Қоректік орта бойымен жоғары вольттық кернеу 
өткізілген кезде ( кернеу – 200-350В, импульстың ұзақтығы 54 мс), 
цитоплазмалық мембрананың бойында поралар пайда болады, олардың 
үлкендігі мен пада болу ұзақтығы осмостық күштердің әсерінен ДНҚ 
фрагменті сияқты макромолекулалардың енуіне жеткілікті. Ол кезде 
жасушаның мөлшері үлкейеді. Тірі қалатын жасушалардың ДНҚ 
фрагменттерін тиімді енгізіп алуы үшін, электрлік кернеу күші, оның 
ұзақтығы, 
трансформацияланатын 
ДНҚ 
мен 
жасушалардың 
концентрациясын тәжірибе арқылы таңдайды. Электропорация әдісі арқылы 
трансформациялан тірі жасушалардыфң мөлшері 80%-ға дейін жететіні 
көрсетілген.
Электропорация – биохимиялық емес, физикалық әдіс болғандықтан, 
кеңінен қолданылып келеді. Көптеген зерттеулердің нәтижесінде ДНҚ 
молекулаларын 
жануарлардың, 
қарапайымдылардың, 
ашытқылардың, 
бактериялардың және протопласттардың құрамына сәтті енгізуге болатыны 
дәлелденді. 
Жоғары кернеулі тоқтың электропорациялаушы әсері оның қисықтығы 
радиусына тәуелді деп болжанады. Сондықтан, мысалы, бактериялар 
жасушалары айтарлықтай жоғары (10 кВ және одан да жоғары) кернеу 
ДНҚ-ы бар 
микропипетка 

78
болғанда ДНҚ фрагменттерін жұтса, ірі жануарлар мен өсімдіктерге небары 
1-2 кВ/см кернеу жеткілікті. 
Электропорация – ДНҚ молекусын жавсушаға енгізудің ең қарапайым, 
тиімді де нәтижені қайталап алуға мүмкіндік беретін әдісі болып табылады. 
Алайда, қазіргі кезде зертханаларда жаппай жасалып шығарылатын 
құрылғылар – электропораторлардың, жоқтығы осы әдісті кеңінен қолдануға 
кедергі болып отыр. Осындай құрылғылардың пайда болуы мен жетілдірілуі 
болашақта әртүрлі жасушаларға қолданылатын генетикалық инженериялық 
әдістің кеңінен қолданылуына жағдай жасауы әбден мүмкін.
25 сурет. Гендерді жасушаға электропорация әдісімен енгізу. 
«Мини-жасушалар» донор жасушаларды колцемид арқылы бұғаттау 
арқылы алынады. Ұзақ уақыт бойы колцемидпен өңдеген кезде, 
жасушалардағы хромосомалардың айналасында жаңа яяролық мембрана 
түзіледі. Жасушаларды цитохалазин В-мен өңдеу және центрифугалау 
цитоплазмалық мембранамен қапталған микроядро түріндегі мини-
жасушалардың пайда болуына әкеледі. 
Алынатын жасушалар әртүрлі сыртқы әсерлерге сезімтал болғандықтан, 
электропорация үшін қолайлы да, жұмсақ жағдайлар жасауға тырысады. 
Қорыта келе, бұл әдіс қиын, күрделі және тиімділік дәрежесі төмен – 10
-6
– 
10
-7
. 
Липосомаға қаптау экзогенді генетикалық материалды зақымдаушы 
рестрикатазалардың әсерінен сақтау үшін қолданылады.
Липосома – фосфолипидтерден тұратын сфералық қабықшалар. Оларды 
су және липидтерден тұратын ерітіндіні өте жылдам шайқау немесе, 
фосфолипидтер эмульсиясын ультрадыбыспен өңдеу арқылы алады. 
Фосфатидилсерин мен холестериннен тұратын липосомалар жануарлар мен 
өсімдіктердің жасушасына ДНҚ молекуласын енгізу үшін ең тиімділердің 
ДНҚ-ы бар ерітінді 

79
бірі. Липосома арқылы тасымалдаушы жүейелер жасушалар үшін 
токсикалылығы төмен болып табылады.
Биологиялық баллистика (биолистика) қазіргі кезде өсімдіктерді, 
әсіресе дара жарнақты өсімдіктерді, трансформациялауға арналған әдістердің 
бірі болып отыр.
Әдістің мәні мынада: диметрі 0,6-1,2 мкм болатын вольфрам 
бөлшектеріне құрамында қажетті гендік ақпараты бар векторлық ДНҚ 
шашыратылады. 
Бетіне жабысқан ДНҚ молекулалары бар вольфрам бөлшектері 
целлофанды төсенішке жағылады да, оларды биологиялық зеңбірекке 
салынады.
Каллус немесе супензияны агарланған қоректік ортасы бар Петри 
табақшасына 
жағылады 
да 
зеңбіректен 
10-15 
см 
қашықтықта 
орналастырылады. Зеңбіректегі вакуумды сорғы қысымды 0,1 атм.-ге дейін 
сығады. Сығылған қысым босаңсыған уақытта, вольфрам бөлшектері 
зеңбіректен айтарлықтай үлкен қысыммен лақтырылып, жасушалардың 
мембраналарын жыртып, жасуша цитоплазмаға немесе ядроға енеді. 
Әдетте, орталық аймақта орналасқан жасушалар оларға лақтырылған 
вольфрам бөлшектерінің үлкен мөлшері мен қысымының әсерінен тіршілігін 
жояды және орталықтан 0,6-1 см қашықтықта орналасқан жасушалар тәуір 
трансформацияланады. Одан соң, жасушаларды әрі қарай өсіру және 
регенерациялау үшін ақырындап қоректік ортаға көшіреді.
Биолистикалық зеңбірек арқылы жүгері, күріш, бидай, арпа сияқты дара 
жарнақты өсімдіктер трансформациялаған кезде, жағдайлары жақсы өсімдік-
трансформанттар алынды. Сәтті алынған трансгенді дара жарнақты 
өсімдіктерден басқа, биолистикалық трансформация эмбриогенді тозаңқапқа 
ДНҚ молекуласын тікелей тасымалдау селекциялық жұмыстарда маңыздығы 
жоғары трансгенді дигаплоидты өсімдіктерді алу мақсатында да 
қолданылады. Қазіргі кезде осы әдіспен темекі өсімдігінің трансформациясы 
жасалды 
және 
гаплоидты 
өсімдік 
регенерациясынан 
кейін 
сау 
трансформанттар алынды. 

жүктеу/скачать 1.81 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: