Эмбриология

Современные представления о механизмах регуляции синтезов специфических белков.

Возможные уровни регуляции: уровень соматических мутаций, транскрипционный, трансляционный, посттрансляционный. Что дают опыты по пересадкам клеточных ядер для суждения об уровнях регуляции?

Дифференциальная экспрессия генов, ее основные пространственные закономерности у зародышей насекомых и позвоночных. Химические и физические регуляторы клеточной дифференцировки.

Клеточная дифференцировка основана на синтезе специфических белков, т.е. клетки, дифференцированные в разных направлениях, отличаются друг от друга хотя бы по одному специфическому белку. Специфичность здесь понимается в совершенно определенном химическом смысле как специфичность последовательности аминокислот (первичной структуры) белковой молекулы. Обычно постулируется, что вторичная, третичная и четвертичная (если она есть) структуры белковой молекулы однозначно выводятся из первичной.

Специфичные белки иногда еще называют «белками роскоши», поскольку они требуются не для самого существования клетки, а связаны с выполнением ею определенной специализированной функции. Перечислим некоторые типы специфических белков («белков роскоши»), которые синтезируются в дифференцированных клетках: фибробласты синтезируют коллаген; клетки покровного эпителия — кератин; миобласты — миозин; фоторецепторы — опсин («зрительный белок»); эритроидные клетки (впоследствии превращающиеся в эритроциты) — гемоглобин; клетки эпителия пищеварительного тракта —- пепсин и трипсин (пищеварительные ферменты); В-лимфоциты различных клонов как уже говорилось, миллионы специфичных антител.

Синтез специфических белков далеко не исчерпывает всего, что связано с дифференцировкой. Дифференцированная клетка менее всего похожа на бесформенный мешок с белками. Еще первые гистологи и цитологи отмечали удивительно сложную структурную организацию многих дифференцированных клеток. В наибольшей мере это относится, пожалуй, к рецепторным клеткам. Сложной архитектурой обладают и другие типы клеток, например эпителиально-мышечные клетки кишечнополостных, выполняющие одновременно опорные, сократительные и иногда чувствующие функции.

Исследования недавнего времени позволили установить молекулярные и надмолекулярные основы столь сложной клеточной организации. Надмолекулярная организация клетки связана прежде всего со структурами их плазматических мембран и с элементами цитоскелета.
Основное свойство плазматических мембран дифференцированных клеток — наличие специфических мембранных рецепторов. Они представляют собой встроенные в липидный матрикс мембран молекулы гликопротеинов (комплексов белков с углеводами). На внешних, обращенных в межклеточное пространство концах рецепторов расположены строго определенные последовательности остатков углеводных молекул, изменяющих свою конформацию при связывании с эффекторами — молекулами гормонов, медиаторов, витаминов, вирусов, антигенов и других факторов, действующих извне на клетку. Эти конформационные изменения передаются по молекуле рецептора сквозь мембрану в субмембранные слои клетки, где начинаются каскады внутриклеточных реакций, осуществляющихся благодаря активации так называемых вторичных посредников— циклических нуклеотидов, звеньев инозитолфосфатной системы и др. В ряде случаев первым звеном, на которое оказывает влияние возбужденный (связанный с молекулой эффектора) внутриклеточный рецептор, является активация фермента аденилатциклазы, синтезирующего циклическую аденозинмонофосфорную кислоту (цАМФ).

Кроме специфических мембранных рецепторов в плазматическую мембрану встроены специальные «белковые машины», обеспечивающие транспорт ионов либо по градиентам их концентрации (ионные каналы), либо против градиентов (ионные помпы, или насосы). Из последних для жизнедеятельности клеток особое значение имеет Na⁺, К⁺-насос (или Na⁺, К⁺-АТФаза), откачивающий, при затрате энергии АТФ, ионы натрия и клетки во внешнюю среду, а ионы калия — внутрь клетки.

Мембранные рецепторы, ионные каналы и насосы — подвижные образования. Они могут перемещаться, концентрироваться или диспергироваться в плоскости плазматической мембраны (явление латеральной подвижности), а также выходить из плоскости мембраны, деградировать и заменяться новыми. Например, в миобластах каждую минуту деградирует и заменяется новыми молекулами примерно 1 мкм² поверхности. Латеральная подвижность и деградация элементов плазматической мембраны связаны между собой и имеют определенную направленность: у ползущего фибробласта элементы мембраны постоянно встраиваются на переднем конце движущейся клетки, перемещаются по поверхности фибробласта назад и деградируют (интернализуются) на заднем конце клетки. Встраивание элементов мембраны связано с процессами экзоцитоза, а деградация — с процессами эндоцитоза. Надмолекулярная организация плазматической мембраны и клетки в целом имеет динамический характер.
В поддержании полярности дифференцированных клеток важную роль играют микротрубочки. При искусственном разрушении микротрубочек клетка, как правило, деполяризуется. Микротрубочки способствуют также определенному расположению в цитоплазме аппарата Гольджи и осуществляют направленный транспорт ряда белков. Микротрубочки — высоколабильные образования, способные разрушаться и вновь собираться в течение нескольких минут.

Существенную роль в поддержании характерной формы клетки, а также в передвижениях внутриклеточных органелл и мембранных пузырьков играют сократительные волоконца — микрофиламенты, состоящие из белка актина и других, связанных с ним белков (в первую очередь миозина). Микрофиламенты также способны быстро собираться, разбираться и перемещаться по клетке. Ряд сложных клеточных дифференцировок (всасывающие клетки эпителия почек и кишечника, рецепторные клетки) связан со сборкой мощных пучков актиновых микрофиламентов, образующих структурную основу микроворсинок, размеры и структура которых весьма точно регулируются. Например, в глазах головоногих моллюсков над поверхностью каждой клетки сетчатки плотно упакованы сотни тысяч микроворсинок, причем в соседних клетках ряды ворсинок взаимно перпендикулярны, что позволяет животным распознавать плоскость поляризации света. Еще более точно организованы микроворсинки на поверхности волосковых клеток внутреннего уха: в пределах каждой клетки имеются микроворсинки различной длины, расположенные в строгой последовательности. Таким образом, в ходе дифференцировки волосковой клетки должны регулироваться число, длина и расположение микроворсинок.

Особо сложные типы клеточных дифференцировок осуществляются путем координированной активности многих внутриклеточных образований — мембраны, микротрубочек (и центров их организации, связанных с центриолями), аппарата Гольджи и ряда других. Один из замечательных примеров такой цитодифференцировки — образование стрекающих клеток (нематоцист) кишечнополостных из тотипотентных интерстициальных клеток. Процесс начинается с того, что поблизости от аппарата Гольджи (вероятно, из его цистерны) формируется капсула, содержащая мелко гранулированный материал. Затем размеры капсулы увеличиваются, она удлиняется и по форме становится похожей на тыкву. Ее удлинение на этой стадии явно контролируется микротрубочками, которые образуют спиральный пучок, обволакивающий верхушку капсулы. После этого на верхушке капсулы ее внутренняя стенка начинает вворачиваться, образуя длинную свернутую нить. В непосредственном окружении нити формируется серия «шипов», образующих вооружение нематоциста; у некоторых видов нематоцист кроме шипов формируется еще и мощный стилет. Центриоль нематоцисты дает начало чувствующему волоску — книдоцилю, в основе которого лежит пучок микротрубочек. Книдоциль представляет собой механорецептор стрекательной клетки, в ответ на возбуждение которого происходит ее разрядка, представляющая собой быструю эвагинацию (выворачивание наружу) содержимого стрекательной капсулы — сначала стилета, а затем шипов и нити: «катапультирование» стилета осуществляется менее чем за 10 мс, причем за это время стилет развивает ускорение в 40 ООО g и достигает средней скорости 2 м/с. Предполагается, что движущей силой этого процесса является сброс высокого осмотического давления внутри капсулы.
Уровни регуляции клеточной дифференцировки:

1. Уровень соматических мутаций. Предположим, что в разных клетках зародыша произошли различные изменения в первичной структуре ДНК— выпадения, повторы, повороты (инверсии) или перемещения отдельных ее участков (генов). Эти изменения будут наследоваться в соматическом потомстве (клоне) данной клетки. Поэтому такие события можно назвать соматическими мутациями.

Разберем немногочисленные, но важные исключения из общего правила эквивалентности геномов соматических клеток. Одно из них — явление амплификации генов. Мы уже говорили об амплификации рибосомных генов в оогенезе многих видов животных. Установлено, что амплифицироваться могут и нерибосомные гены, например гены, кодирующие структуру белков хориона яйца у дрозофилы. Другие случаи амплификации генов в нормальном развитии неизвестны, однако амплификация описана при злокачественном росте.

Другой яркий пример клеточной дифференцировки на основе соматических мутаций — дифференцировка В-лимфоцитов, продуцирующих антитела. В эмбриональном развитии при дифференцировке клонов В-лимфоцитов в тех участках их генома, которые кодируют белки антител (иммуноглобулины), происходят перемещения (транслокации) определенных групп генов.

Иммуноглобулины состоят из так называемых легких и тяжелых аминокислотных цепей. Гены для легких цепей содержат 2вариабельных сегмента ДНК— V и J — и константный сегмент С. Сегмент V содержит около 300 различных нуклеотидных последовательностей, а сегмент J — 4-5 таких последовательностей. На нитях ДНК еще недифференцированных клеток участки V, J и С пространственно разделены. В ходе дифференцировки промежуточная ДНК элиминируется, и любая из V-последовательностей может сблизиться с любой из J- последовательностей, а их комбинация — с константным С-сегментом. Таким образом, возникает 300*5 = 1500 различных комбинаций генов. Гены для тяжелых цепей содержат вариабельные сегменты V, D и J, состоящие соответственно из 200, 10-15 и 4 последовательностей, а также константный участок С. Их комбинирование добавляет еще примерно 200*10*4 = 8000 вариантов. Произведение 1500 * 8000 = 10 млн достаточно велико, чтобы обеспечить потребности организма в различных типах антител.

Близкое к соматическим мутациям явление — инактивация одной из половых (X)-хромосом у эмбрионов самок млекопитающих (у самок мыши такая инактивация наступает на 3-6-й день эмбрионального развития). Для установления необходимого генетического баланса должна быть инактивирована одна из имеющихся Х-хромосом, причем выбор между инактивацией материнской или отцовской хромосомы осуществляется в каждой соматической клетке случайно. Инактивированная хромосома обнаруживается под микроскопом в виде плотного скопления хроматина — тельца Барра, присутствие которого используется для установления пола эмбриона.

Дифференцировка путем соматических мутаций наблюдается у фотосинтезирующих бактерий Anabaena, образующих многоклеточные колонии. Если эта бактерия живет в условиях избытка азотистых соединений, во всех клетках происходит фотосинтез, и все они похожи друг на друга. Но когда азота начинает не хватать, появляются специализированные клетки - гетероцисты, лишенные хлорофилла, но синтезирующие фермент нитрогеназу, с помощью которой атмосферный азот превращается в усвояемую форму. Оказалось, что при формировании гетероцист в них происходит перестройка ДНК, в результате которой возникает последовательность нуклеотидов, кодирующая одну из субъединиц нитрогеназы. Последнее позволяет предположить, что дифференцировка клеток путем соматических мутаций — эволюционно древний способ, который в дальнейшем ходе эволюции оказался почти полностью вытесненным другими способами, обеспечивающими большую пластичность клеточного состава организмов и легче доступных пространственно-временному управлению.

Клетки эукариот обладают широкими возможностями регуляции активности структурных генов. Для этого у них имеются обширные области ДНК, называемые контролирующими районами. В них различают промоторы — участки ДНК, непосредственно примыкающие к данному структурному гену и связывающие РНК-полимеразу, а также более удаленные и обширные участки ДНК, называемые энхансерами. Один структурный ген может

иметь несколько энхансеров. Это обозначается как многомодульная регуляция. Энхансеры связываются с обширными комплексами белков (так называемыми гетеромультимерами), которые в зависимости от своего состава могут либо усиливать, либо подавлять действие данного структурного гена. Многомодульная регуляция и переход от стимуляции данного структурного гена к его подавлению даже при небольшом изменении состава белкового гетеромультимера способствует разнообразию клеточных дифференцировок, столь характерному для эукариот. Воздействие энхансера на данный структурный ген осуществляется благодаря изгибу расположенного между ними участка ДНК, в результате чего комплекс энхансер-белки устанавливает непосредственный контакт со структурным геном. Изгиб возможен благодаря тому, что при связывании энхансера с белками изменяется структура (происходит деконденсация) всего достаточно обширного участка ДНК, расположенного между энхансером и контролируемым им структурным геном.

К процессам, регулирующим активность генов на уровне транскрипции, относится также метилирование-деметилирование различных участков ДНК по цитозину. Метилирование блокирует, а деметилирование деблокирует активность данных генов. Как правило, в ходе раннего развития зародышей происходит деметилирование ДНК, в результате чего и происходит активация генов. Позже, по ходу дифференцировки, уровень метилирования может снова возрасти, оказаться специфическим для данного типа клеток и способствовать поддержанию устойчивости его дифференцировки.

Другой недавно обнаруженный фактор, влияющий на активность и, возможно, на специфичность транскрипции — размер доменов (петлеобразных участков) ДНК, возникающих при ее прикреплении к ядерному матриксу. Этот размер, как правило, увеличивается по ходу развития.

Первыми результатами в пользу гипотезы дифференциальной активности генов были цитологические данные, показавшие, что способность к синтезу мРНК не распределена равномерно по всей хромосоме, а в ней существуют более и менее синтетически активные участки. Мы уже знакомы с этим на примере хромосом ооцита: синтез мРНК идет там только на выпетлившихся участках «ламповых щеток», а синтез рибосомальной РНК и амплификация генов — на других участках хромосом.

Аналогичные синтетически активные, вздутые участки хромосом (пуфы) обнаружены в ядрах клеток слюнных желез дрозофилы. Мощность и расположение пуфов изменяются под воздействием гормонов. Пуфы, как и «ламповые щетки», представляют собой расплетенные, деконденсированные участки хромосом.

Открытие пуфов явилось исторически первым свидетельством того, что гормоны непосредственно влияют на активность действия генов. Но приведенные выше данные в пользу дифференциальной активности генов являются все же косвенными. Прямыми данными были бы лишь сравнения различных типов дифференцированных клеток по составу молекул только что транскрибированных предшественников мРНК — пре-мРНК. Такие сравнения проводят методом молекулярной гибридизации молекул РНК с комплементарными им ДНК (кДНК), синтезированными на соответствующих молекулах мРНК методами генетической инженерии с использованием обратной транскриптазы — фермента, синтезирующего ДНК по матрице мРНК. Гибридизацию можно проводить как in vitro, в биохимических пробах, содержащих извлеченную из изучаемых клеток фракцию РНК, так и на образцах целых организмов или на гистологических срезах. В последнем случае, если наносить на срез ДНК, меченную каким-либо изотопом, можно получать карты-автографы экспрессии определенных генов. Этот метод получил название гибриди­зации in situ.

Впервые подробные исследования с применением этого метода были выполнены на яйцеклетке дрозофилы. Установлено, что у зародышей дрозофилы белки, кодированные ранее включенными генами, являются активаторами для последующих групп генов. Так, места экспрессии генов группы gap определяются концентрацией белка bicoid, а места экспрессии генов группы pair-rule — соотношением ко­центраций белков, кодированных генами группы gap. При этом используется многомодульная регуляция структурных генов.

Надо, однако, заметить, что такой «прямолинейный» путь активации последующих генов белками, кодированными на ранее работавших генах, является скорее исключением, чем правилом: в яйцеклетке дрозофилы он может действовать благодаря ее синцитиальному строению, допускающему свободную диффузию продуктов. При обычных типах дробления, когда бластомеры с самого начала разгораживаются клеточными мембранами, активация генов осуществляется через посредство трансмембранной сигнализации. Интересно, что даже в яйцеклетке дрозофилы «концентрационный» путь регуляции полос экспрессии, по-видимому, не является единственным. Недавно было обнаружено, что градиент концентрации белка bicoid даже в нормальном развитии (и тем более — в экспериментально измененных условиях) может быть весьма изменчивым, а локализация полос генов группы gap тем не менее весьма точной. Таким образом, должны существовать дополнительные к концентрационным градиентам факторы регуляции, которые пока неизвестны.

В целом участие уровня транскрипции в регуляции клеточной дифференцировки не вызывает сомнений. По-видимому, это один из основных уровней регуляции. Надо только иметь в виду, что дифференциально экспрессируются, как правило, не отдельные гены, а целые группы (блоки) генов. По представлениям некоторых авторов, активность этих блоков («генных сетей», по Кауффману) является самоподдерживающейся.

Будучи один раз активированными, они затем спонтанно поддерживают свою активность на определенном уровне. Этим может быть объяснена высокая устойчивость дифференцированного состояния многих типов клеток.

— Альтернативный сплайсинг. Как известно, только что транскрибированная молекула мРНК (пре-мРНК) состоит из экзонов и некодирующих «вставок» - интронов. Еще в процессе транскрипции интроны удаляются из новосинтезированной мРНК. Оставшиеся экзоны могут сливаться в различных комбинациях, в результате чего из одной молекулы пре-мРНК может образоваться несколько типов более коротких молекул мРНК, кодирующих различные белки.

Регуляция на уровне альтернативного сплайсинга была показана, например, для первичного транскрипта гена альфа-тропомиозина мыши. Путем различных сшивок он может продуцировать мРНК для гладких скелетных мышц, а также фибробластов и клеток мозга, то есть участвовать в дифференцировке совершенно различных типов клеток. Особенно широко представлен альтернативный сплайсинг у насекомых. В одном (правда, исключительном) случае ген дрозофилы, называемый DSCAM, может кодировать путем сплайсинга 38 ООО различных белков! Альтернативный сплайсинг контролируется макромолекулярным комплексом (так называемой сплайсосомой), состоящей из белков и малых молекул РНК. Некоторые авторы склонны считать данный уровень регуляции едва ли не самым важным.

— Регуляция транспорта мРНК из ядра. Например, у млекопитающих лишь около 5% синтезированной РНК покидает ядро и идет в трансляцию.

Устранение блока трансляции после активации яйцеклетки достигается добавлением большого количества адениловых групп на 3-конце молекул мРНК. В дальнейшем по ходу дробления материнская мРНК вступает в трансляцию также не сразу повсеместно, а по определенной пространственно-временной программе. Это характерно, например, для яйцеклеток моллюсков. Фактор, регулирующий скорость трансляции, связан у них с полярной лопастью.

Существенные задержки в начале трансляции уже заготовленных мРНК отмечены также при дифференцировке эритроидных, сперматогенных и других специализированных типов клеток. Известны и обратные примеры: при дифференцировке клеток хрусталика куриного зародыша на 6-е сут. инкубации на 1 молекулу мРНК синтезируется в 5 раз больше соответствующего белка (а-кристаллина), нежели на 19-е сут. развития.

Регуляция на уровне трансляции имеет место в синтезе такой важной биологической молекулы, как гемоглобин. Как известно, каждая молекула гемоглобина состоит из 2 а-глобиновых цепей, 2 бета-глобиновых цепей и 4 относительно небольших молекул гема. Любое отклонение синтеза составных частей гемоглобина от данных соотношений приводит к тяжелым нарушениям.

Правильные количественные соотношения между компонентами гемоглобина регулируются следующим образом. Во-первых, избыток гема ингибирует ключевой фермент, ответственный за его же синтез. Во-вторых, этот же избыток активирует синтез глобинов. Данная активация и осуществляется на уровне трансляции: гем (или его окисленная форма гемин) ингибирует фермент протеинкиназу, который фосфорилирует (и тем самым ингибирует) фактор инициации трансляции глобина. Ингибиция ингибитора означает активацию; таким образом, избыток гема подавляет собственное производство и активирует на уровне трансляции синтез глобина, поддерживая тем самым нормальные соотношения компонентов гемоглобина.

Трансляционная регуляция синтеза гемоглобина имеет еще один аспект. Известно, что в диплоидной клетке имеются 4 активных альфа-глобиновых и только 2 активных бета-глобиновых гема. Если бы каждый ген транскрибировался и транслировался с одинаковой скоростью, то на 1 молекулу бета-глобина приходились бы 2 молекулы а-глобина. Между тем уже отношение концентрации бета:альфа мРНК не 1:2, a 1:1,4, а отношение концентрации самих белков в точности равно 1:1. Совершенно очевидно, что темпы синтеза обоих глобинов регулируются как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Регуляция на последней стадии осуществляется, очевидно, в результате конкуренции обеих мРНК за факторы инициации трансляции.

Недавно был открыт новый способ регуляции на уровне трансляции, основанный на так называемой РНК-интерференции. Он действует в ходе развития круглого червя Caenorhabditis elegans. Для нормального развития этого организма необходимо подавлять деление стволовых клеток на определенных стадиях развития — иначе, например, будут возникать «лишние» клетки покровов тела. Подавление происходит ввиду того, что на требуемых стадиях развития благодаря активности определенных генов и последующему сплайсингу возникают короткие молекулы РНК (размером 22 нуклеотида). Они комплементарны тем молекулам мРНК, которые перед этим были вовлечены в трансляцию. Связывание комплементарных молекул (это и есть РНК-интерференция) приводит к подавлению трансляции, а иногда и к деградации перед этим активных мРНК. РНК-интерференция обнаружена также в эмбриональных стволовых клетках мышей. Имеются указания на возможность РНК-интенференции в половой цитоплазме яйцеклетки насекомых.