«Газово-хроматографический анализ степени биодеградации адамантана и его производных бактериальной ассоциацией ags10»

Селифанова Мария Витальевна 10 «Н» СУНЦ МГУ

Руководитель:

Канатьева Анастасия Юрьевна, кандидат химических наук,

Институт нефтехимического синтеза
Место выполнения:
Лаборатория хроматографии
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Ордена Трудового Красного Знамени
Институт нефтехимического синтеза им. А. В. Топчиева
Российской академии наук

Москва 2015

Введение

Сегодня проблема загрязнения окружающей среды отходами нефтепереработки и другими органическими отходами производства стоит довольно остро. В настоящее время существуют различные методы решения этой проблемы, среди которых одним из наиболее перспективных является биологическая очистка. Метод биологической очистки основан на процессах биодеградации органических соединений микроорганизмами. Кроме того, разработка месторождений приводит к нарушению их стерильности, что также требует исследования процессов биодеградации углеводородов различного состава и строения. Однако наиболее легко биодеградации подвергаются насыщенные неразветвленные углеводороды, поэтому исследование биодеградации органических соединений более сложного строения является актуальной задачей.

Таким образом, цель работы – оценить степень биодеградации адамантана бактериями из серных карт АГК, ассоциации Ags10

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

1. 
   провести три последовательных пересева культуры на один и тот же субстрат (адамантан, метиладамантан, диметиладамантаны);
   
2. 
   подготовить контрольный стерильный образец, прошедший те же стадии пробоподготовки, что и рабочие пробы;
   
3. 
   провести жидкость-жидкостную экстракцию контрольных и рабочих проб;
   
4. 
   провести газохроматографический анализ контрольных и рабочих проб;
   
5. 
   сравнить полученные результаты газо-хроматографического анализа.
   

Пространственное расположение атомов углерода в молекуле адамантана повторяет расположение атомов в кристаллической решётке алмаза. Уникальность молекулы адамантана заключается в том, что она является жёсткой и практически свободной от напряжений одновременно.» [5]

рис.1

Практическая значимость работы определяется результатами, которые будут характеризовать способность аэробной бактериальной ассоциации AG_S10 к окислению адамантана и его метил- и диметил- производных.

Обзор литературы

Исследование [3] было посвящено проблеме накопления большого числа хвостохранилищ и отработанных технологических вод, которые представляют угрозу экологическому состоянию местности (из-за наличия токсичных органических кислот и сложных смесей циклоалифатических и алкилзамещенных ациклических карбоновых кислот, присутствующих в нефти). К возникновению этой проблемы привела добыча битума из нефтеносных песков (крупнейшие одиночные скопления нефти в мире находятся в виде частично биодеградированных месторождений нефтяных песков в провинции Альберта (Канада) и Восточной Венесуэле). Хотя ароматические нафтеновые кислоты составляют небольшой процент от некоторых смесей, они могут увеличивать их общую токсичность. С этой проблемой борются с помощью методов биологической очистки. Исследования показали, что эффективность биодеградации технологических вод Pseudomonas putida и Pseudomonas fluoriscents составляет больше 95%. Эти данные позволили ученым, занимающимся проблемой, предположить, что Pseudomonas putida (далее Р. putida) может успешно использоваться для биодеградации нафтеновых кислот. Был проведен ряд экспериментов по деградации н-BPBA ((4'-n-butylphenyl)-4-butanoic acid) и трет-BPBA ((4'-t-butylphenyl)-4-butanoic acid) с использованием P. putida линии KT2440. После целого ряда действий, производные (деградировавшие) образцы отделили с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). В качестве газа-носителя был использован гелий. Далее был проведен статистический анализ.

рис.2 А и В [3]

Также был исследован эффект увеличения концентрации субстрата на деградацию н-BPBA P. putida KT2440. Результаты позволили предположить, что при более высоких концентрациях, н-BPBA имеет большее токсическое действие. В результате исследования было выявлено, что: в то время как н-BPBA легко разлагается в течение нескольких дней с помощью бета-окисления алкановой кислоты боковой цепи, P. putida KT2440 не смогла усвоить т-BPBA. Был идентифицирован основной метаболит (н-BPEA), который был подготовлен в ходе деградации н-BPBA. Кроме того, повышение концентрации п-BPBA привело к уменьшению дегенеративных способности P. putida KT2440 и уменьшению количества клеток. Информация, полученная из этого исследования, очень важна, так как она позволила бы выявить функциональные гены и метаболические пути, участвующие в ароматической деградации нафтеновых кислот, и тем самым содействовать биоремедиации этих токсичных ароматических соединений в окружающей среде.

Можно привести ещё один пример исследований, посвященных биодеградации как способу очистки окружающей среды от органических загрязнителей.

Для аэробной деструкции применяется обратная зависимость между молекулярной массой углеводорода и его склонности к деградации (чем выше сложность, тем меньше степень разложения). Большинство исследователей договорились о четкой преемственности в микробном истощении структурных групп в аэробных условиях, в порядке убывания биодеградации: н-алканы -> I-алканы -> ароматические низкомолекулярные алканы -> с высокой молекулярной массой ароматические и циклические алканы. Это понятие используется для возрастной датировки разливов нефти и в оценке возникновения биодеградации. Для этих целей были разработаны различные математические модели. Также известно, что разветвленные алканы деградируют при более низких скоростях, чем линейные алканы с примерно аналогичным числом атомов углерода.

Целью этого исследования стало охарактеризовать протекание биодеградации отдельных составных частей сырой нефти с кислородом, нитратом и сульфатом.

Первый эксперимент был проведен с очищенной почвой с примесью парафинов. Была проведена хроматография, результаты сведены в таблицу.

Результаты: в сульфатредуцирующих условиях наблюдались более высокие темпы деградации соединений с высокой молекулярной массой. В меньшей степени это наблюдалось в условиях восстановления нитратом. Небольшой прирост свободной энергии Гиббса (ΔG °) уменьшается за счет удлинения н-алканов или за счет того, что энергия вкладывается в активацию алкана. Первое свидетельствует о преимущественной деградации алканов в сульфатных восстановительных условиях. В то время, как идентификация основных механизмов требует дальнейшего углубленного исследования, они могут сильно повлиять на отношение к эффективности алканов по отношению к мерам, используемым в настоящее время для устранения нефтяных загрязнений.

В своем исследовании, мы обращаем внимание на обитателей серной карты Астраханского газоперерабатывающего комплекса — это ацидофильные термотолерантные бактериальные ассоциации. На сегодняшний день проведено лишь два исследования этих интересных организмов. Первое [2] было проведено в 2012 году. Тогда была выделена наиболее стабильная бактериальная ассоциация AG17, были исследованы ее свойства, способности к биодеградации н-алканов (при помощи метода газовой хроматографии). Подробнее остановимся на результатах недавних исследований [1]: была выявлена необычная способность новой аэробной ацидофильной (pH 1.3-4.5) бактериальной ассоциации AGs10 из серных карт Астраханского газоперерабатывающего комплекса (АГК) к окислению не только широкого спектра нормальных (C10-C20) и изо-алканов и некоторых других веществ, но и сильноразветвленного насыщенного углеводорода 2,2,4,4,6,8,8-гептаметинонана. Данная культура особенно привлекла наше внимание, так как разветвленные углеводороды часто являются загрязнителями окружающей среды, но не подлежат биодеградации, а ее способность к биодеградации в экстремальных условиях среды является уникальной. Исследование было посвящено «изучению способности аэробной бактериальной ассоциации AGs10 к окислению углеводородов разного химического строения, молекулярно-биологическому анализу ее микробного разнообразия и поиску генов биодеградации н-алканов при росте в средах с экстремально низкими значениями pH». В результате исследования были выявлены фенотипические характеристики культуры (неподвижные, прямые и слегка изогнутые неспороносные палочки, размером 0.4-0.6 Х 1.6-2.5 мкм, были выявлены и другие характеристики культуры), был выявлен диапазон температуры и pH для роста культуры (20-45 гр. С, 1.3-4.5). Культуры высевались на среды различных углеводородов. Выяснилось, что активный рост за счет аэробной деструкции характерен для культуры только в жидкой среде.
Рис.3 [1]

Т

огда как на плотной среде колоний обнаружено не было. В ходе исследования была составлена таблица биодеградации различных углеводородов ассоциацией Ags10:

Также была произведена оценка биоразнообразия представителей бактериальной ассоциации на основе анализа последовательностей фрагментов гена 16s рРНК (метод ПЦР-ДГГЭ анализа).

1. 
   органические соединения различного строения по-разному подвержены биодеградации;
   
2. 
   аэробная бактериальная ассоциация AG_S10 является перспективной с точки зрения биодеградации углеводородов разветвленного строения в кислой среде;
   
3. 
   в литературе практически отсутствуют работы по биодеградации каркасных соединений.
   

Для проведения практической части исследования институт микробиологии РАН предоставил нам экспериментальные образцы, который в дальнейшем подвергались газовой хроматографии. Бактериальная ассоциация, являющаяся объектом нашего исследования была отобрана в астраханском серном хранилище.

В исследовании [7] был проведен анализ библиотеки клонов генов 16S рРНК исследуемой культуры AGS10 с помощью универсальных эубактериальных праймеров показал доминирование микобактерий в ее составе. Поэтому, для более детального ее изучения нами были разработаны специальные системы праймеров, специфичных для микобактерий, а именно, для структурного гена 16S рРНК и двух функциональных генов, ответственных за биодеградацию углеводородов, alkB и сyp153. Согласно филогенетическому анализу, выявленные нами микобактериальные нуклеотидные последовательности были идентичны между собой и на филогенетическом дереве генов 16S рРНК медленно растущих микобактерий образовывали компактный кластер вместе с последовательностями двух некультивируемых микроорганизмов, обнаруженных ранее другими исследователями в экстремально кислых экосистемах, при этом уровень сходства с геном наиболее близкого вида Mycobacterium florentinum составлял 98%.

Деструкция предоставленных образцов осуществлялась методом ГЖХ (газовый хроматограф Shimadzu). Хроматограф снабжен пламенно-ионизационным детектором. Газ-носитель — гелий. 50 С (5 мин) --> 5 С/мин --> 250 С Каждый из экспериментов проводился три раза, затем высчитывалось среднее значение.

В первую очередь были проанализированы смеси и индивидуальные соединения, использовавшиеся в качестве питательных субстратов. Результаты приведены на рисунках 4(1-метиладамантан), 5(1,3-диметиладамантан), 6(газовый конденсат Т1), 7(газовый конденсат Т3) и в табл.3. Для оценки абиотического изменения профиля были проведены контрольные стерильные эксперименты, (результаты которых представлены, например на рис.8)

Рис.4 Хроматограмма разделения раствора 1-метиладамантана в гексане. Газ-носитель гелий, детектор ПИД, температура инжектора 250 ⁰С, коэффициент деления потока 1:30, температура детектора 250⁰С, объем пробы 0,2 мкл.

Температура колонки: 50⁰С (1 минута)  5⁰С/мин  250⁰С
Рис.5 Хроматограмма разделения раствора 1,3-диметиладамантана в гексане. Газ-носитель гелий, детектор ПИД, температура инжектора 250 ⁰С, коэффициент деления потока 1:30, температура детектора 250⁰С, объем пробы 0,2 мкл.

Температура колонки: 50⁰С (1 минута)  5⁰С/мин  250⁰С

Температура колонки: 50⁰С (1 минута)  5⁰С/мин  250⁰С

Рис.7 Хроматограмма газового конденсата T1. Газ-носитель гелий, детектор ПИД, температура инжектора 250 ⁰С, коэффициент деления потока 1:30, температура детектора 250⁰С, объем пробы 0,6 мкл.

Температура колонки: 50⁰С (1 минута)  5⁰С/мин  250⁰С

Рис.8 Хроматограмма контрольного образца газового конденсата T3 и газового конденсата Т1 в гексане. Газ-носитель гелий, детектор ПИД, температура инжектора 250 ⁰С, коэффициент деления потока 1:5, температура детектора 250⁰С, объем пробы 0,6 мкл.

Температура колонки: 50⁰С (1 минута)  5⁰С/мин  250⁰С

30 дней
Результаты анализа рабочих проб показаны в табл.4 . Мы выяснили, что абсолютная площадь пиков производных адамантана уменьшается, что указывает на то, что биодеградация происходит. При этом относительное количество каждого из исследуемых соединений увеличивается, следовательно другие компоненты смеси (газового конденсата) потребляются быстрее, чем каркасные соединения.

Для проверки возможности P. Putida потреблять адамантаны в виде индивидуальных соединений, а не в результате соокисления, были проведены эксперименты по изучению поглощения индивидуальных 1-метиладамантана и 1,3-диметиладамантана, результаты представлены на рис. И рис. , а так же в табл. . Из этого видно, что потребление происходит и его минимальная величина для 1-метиладамантана составляет 54%.
Рис. 9. Хроматограммы гексановых экстрактов проб 6к и 5к, 4 мл гексана на флакон, деление потока 1:5, 0,6 мкл.

Рис. 10. Адамантаны в составе газового конденсата в гексановых экстрактах проб 6к и 5к, 4 мл гексана на флакон, деление потока 1:5, 0,6 мкл. 1 – адамантан, 2 – 1-метиладмантан, 3 – 1,3-диметиладамантан.

Коэффициент потребления (Х) рассчитывается по формуле:

где

S раб – средняя площадь пика в рабочей пробе

S контр – средняя площадь пика в контрольном образце

k раб –коэффициент деления потока в рабочей пробе

k контр –коэффициент деления потока в контрольном образце

V раб – объем рабочей пробы

V контр – объем контрольной пробы

Vг. раб – объем гексана в рабочей пробе

Vг. контр – объем гексана в контрольной пробе

Рис. 12. Совмещенные хроматограммы гексанового экстракта проб 1,3-метиладамантана контрольной (4к) и рабочей проб (4а). 10 мл гексана на флакон, деление потока 1:5, 0,6 мкл.

1) на основании проведенных экспериментов можно заключить, что потребление адамантана и его производных, ранее обнаруженное в газовом конденсате, не является артефактом;

2) адамантан и его метил- и диметил- производные могут потребляться как в составе сложной смеси, так и в виде индивидуальных соединений. Минимум потребления для ГК составляет 14%, для индивидульаных соединений 54%;

3) рост относительного количества исследуемых соединений в рабочих пробах газового конденсата говорит о том, что потребление каркасных соединений в этом случае происходит медленнее, чем потребление других компонентов смеси.

Автор выражает благодарность к.б.н. Ивановой А.Е. (Институт микробиологии им. Виноградского РАН) за помощь в проведении эксперимента с бактериальной культурой и д.х.н. Пурыгину П.П. (СамГУ) за предоставленные образцы производных адамантана.

2). Иванова А. Е., Кизилова А. К., Канатьева А. Ю., Кравченко И. К., Курганов А. А., Беляев С. С. Окисляющая углеводороды ацидофильная термотолерантная ассоциация бактерий из серных карт / / Микробиология. – 2013. – Т. 82. – № 4. – С. 464-472.

3).Richard J. Johnson, Ben E. Smith, Steven J. Rowland, Corinne Whitby. Biodegradation of alkyl branched aromatic alkanoic naphthenic acigs by Pseudomonas putida KT2440//International Biodeterioration and Biodegradation.-2013.-Т.81.-С.3-8.

4). Marion Hasinger, Karstin E. Scherr, Nserennyam Lundaa, Leopold Brauer, Clemens Zach, Paul Loibner. Changes in iso- and n-alkane distribution during biodegradation of crude oil under nitrate and sulphate reducing conditions// Journal of Biotechnology.-2012.-Т.157.-С.490-498

5). Адамантан, Википедия, 19.08.2014

6). Курбатова С.В. Хроматография адамантана и его производных//Самара, Самарский гос. ун-т, 2006 -247 с. ил. -ISBN 5-86465-406-X