Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма-донора для живых гриппозных вакцин а/краснодар/101/35/59(H2N2) 03. 02. 02 вирусология

ТЕРЕХОВ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ АТТЕНУАЦИИ

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2014

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Маркушин Станислав Георгиевич; кандидат биологических наук Цфасман Татьяна Михайловна

Официальные оппоненты: заведующий лабораторией этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России	доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна
заведующий лабораторией биотехнологии ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН	доктор биологических наук Шевелев Алексей Борисович

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ.
Защита диссертации состоится 26 июня 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5А.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан «___» мая 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Ирина Владимировна Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает наибольшей эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. Следует отметить, что в отличие от инактивированных гриппозных вакцин живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами. В настоящее время для получения живой ХА гриппозной вакцины в России используют ХА штамм А/Ленинград/134/17/57(Н2N2) [Александрова, Климов 1994], а в США – ХА штамм А/Энн Арбор/6/60(H2N2) [Herlocher et al.,1996]. Эти штаммы–доноры аттенуации получены путем пассажей при пониженной температуре и их генетические маркеры были хорошо изучены [Гендон, 2011]. Однако, применяемый в России ХА штамм-донор А/Ленинград/134/17/57 оказался генетически гетерогенным [Киселева и сотр.2005] и обнаружил повышенную реактогенность для маленьких детей [Александрова, Климов 1994]. Учитывая это обстоятельство в НИИВС им. И.И. Мечникова был получен новый ХА штамм–донор аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки [Гендон Ю.З. и сотр, 2013]. Данный штамм обладал приемлемыми фенотипическими характеристиками. Однако до настоящего времени остается неясным, какие гены штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) содержат ключевые генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию данного штамма (ts и att фенотип). Эту проблему мы попытались решить с помощью создания панели одногенных и полигенных реассортантов, используя методы обратной генетики, с последующим изучением фенотипических и генотипических характеристик сконструированных реассортантов.

Также под вопросом остается возможность получения ХА реассортантов – кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2), которые обладают хорошими защитными свойствами, необходимыми для живых гриппозных вакцин. Всестороннее изучение биологических свойств реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А, является необходимым условием для реальной оценки перспективности данного штамма как эффективного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение генетических основ аттенуации холодоадаптированного штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2), а также исследование возможности ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) образовывать при скрещивании с эпидемическими штаммами вируса гриппа ХА реассортанты, которые могли быть использованы по своим характеристиками в качестве живых гриппозных вакцин.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. 
   Получить ХА реассортанты путем классического скрещивания ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) c эпидемическими штаммами вируса гриппа А - А/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1).
   
2. 
   Изучить фенотипические характеристики ХА реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и эпидемических штаммов A/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1).
   
3. 
   Проанализировать антигенную специфичность и иммуногенность полученных ХА реассортантов.
   
4. 
   Провести анализ генома полученных ХА реассортантов с помощью метода секвенирования.
   
5. 
   Исследовать защитную эффективность ХА реассортантов, полученных между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и эпидемическим штаммом А/Берн/07/95(Н1N1).
   
6. 
   Заклонировать все 8 генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в плазмиду рНW2000.
   
7. 
   Получить с помощью трансфекции наборы одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(Н1N1).
   
8. 
   Исследовать ts и са фенотип одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и А/WSN/33(H1N1).
   
9. 
   Изучить att фенотип одногенных и полигенных реассортантов, полученных между вирулентным штаммом вируса гриппа А/WSN/33 и ХА штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59(Н2N2).
   

Впервые исследованы генетические основы аттенуации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 – нового донора аттенуации для живых гриппозных вакцин. Показано, что РВ1 и NS –гены данного штамма содержат ключевые детерминанты, определяющие его ts и att фенотип.

Анализ полученных нами реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att- фенотип, в составе генома реассортантов. Это говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.

Показано, что ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) является перспективным штаммом-донором аттенуации для ХА реассортантов, кандидатов в живые гриппозные вакцины.

Создана панель праймеров, позволяющая определять наследование генов у реассортантов вируса гриппа А сероподтипов Н2N2, H3N2 и H1N1.
Практическая значимость.

Доказана возможность использования ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) в качестве штамма-донора для живых рекомбинантных гриппозных вакцин.

Разработаны основные элементы плазмидной технологии для получения живых реассортантных гриппозных вакцин на базе клонированных 6 генов, кодирующих «внутренние» белки ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и 2-х клонированных генов, кодирующих поверхностные белки от любого эпидемического штамма вируса гриппа типа А. Это позволит в более короткие сроки получать вакцинные штаммы вируса гриппа, минуя трудоемкую стадию анализа генома реассортантов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. 
   Все исследованные реассортанты, полученные нами при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентных штаммов А/Берн/07/95(Н1N1) и A/Кумамото/102/02(H3N2), обладают генетическими и фенотипическими маркерами, необходимыми для рекомбинантных живых гриппозных вакцин.
   
2. 
   ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) можно рассматривать как перспективный донор аттенуации при получении ХА реассортантов для живой гриппозной вакцины.
   
3. 
   Анализ одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью обратной генетики между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33, свидетельствует о том, что ключевые детерминанты, ответственные за ts и att фенотип, локализованы в РВ1- гене и NS – гене штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2).
   
4. 
   Анализ полученных нами реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(Н1N1) указывает на доминирование генов, содержащих генетические детерминанты, ответственные за att фенотип, в составе генома реассортантов. Этот факт говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.
   

Материалы диссертации доложены на конференциях молодых учёных ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН (Москва, 2011, 2012, 2013), Young scientist workshop «Methods to study Influenza virus» (Berlin, Germany, 2011), первой всероссийской научной конференций молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), V Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012).

Апробация диссертации состоялась 17 октября 2013 г. на научной конференции отдела вирусологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Материалы диссертации изложены на 92 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 2 рисунками. Библиография включает 95 отечественных и зарубежных источников.

Для определения инфекционного титра вирусов в ЭИД₅₀ и накопления вирусов для последующих опытов куриные эмбрионы заражали по стандартной методике 10-кратными разведениями вируса в аллантоисную полость [Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я., 1954]. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией эритроцитов кур. Инфекционный титр вируса в ЭИД₅₀/0,2 мл расcчитывали по методу Кербера. Для определения ts и ca фенотипа исследуемых штаммов проводили титрование одновременно при оптимальной, пониженной и повышенной температуре. Разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разных температурах выражали величиной RCT (reproductive capacity at different temperatures), которая определяется как разница между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 34˚С и титром при исследуемой температуре, измеряемым в lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Для получения реассортантов на основе ХА штамма вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и эпидемических штаммов A/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1) применяли метод рекомбинации (кросс-реактивации) описанный Полежаевым с сотрудниками (1978) и модифицированный в нашей лаборатории. Вируссодержащую аллантоисную жидкость разводили средой МЕМ 1:10 и вносили в чашки Петри. Инактивацию вируса осуществляли с помощью УФ-установки, снабженной УФ-лампой G8W T5, Germicidal,288 mm. Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 18 час. при 32˚С. Затем аллантоисную жидкость отсасывали и пассировали дважды в куриных эмбрионах в присутствии анти-сыворотки к сероподтипу Н2N2 при 26˚С. Полученные реассортанты клонировали в куриных эмбрионах методом предельных разведений.

Для определения репродукции вируса в лёгких мышей [Неведомская Г.Н. и др., 1992] группы cамок беспородных мышей или самок мышей линии Balb/c (по 5-10 штук на группу) заражали интраназально под лёгким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 10^7,5 ЭИД₅₀/0,2мл (по 50 мкл на мышь). Через 72 часа после заражения у мышей извлекали легкие. Инфекционный титр вируса в 10% суспензии лёгких мышей определяли на куриных эмбрионах и выражали в ЭИД₅₀/0,2мл.

Для определения защитной эффективности ХА реассортантов группы мышей иммунизировали под лёгким эфирным наркозом реассортантами в инфекционном титре 10^6,5 ЭИД₅₀/0,2мл (по 50 мкл на мышь). Затем через 21 день мышей повторно иммунизировали теми же штаммами. По прошествии 10 дней мышей заражали дикими, вирулентными штаммами и через 3 дня из мышей извлекали лёгочную ткань и определяли репродукцию вируса в легких.

Для изучения нейровирулентности реассортантов для мышей-сосунков использовали несколько модифицированную методику Сугиуры [Sugiura A. et al, 1979]. В экспериментах использовали мышей-сосунков из пометов самок беспородных белых мышей. Вируссодержащую жидкость в дозе 10^4,° ЭИД₅₀/50мкл вводили интрацеребрально. Наблюдение за инфицированными мышами проводили в течение последующих двух недель.

В экспериментах использовали плазмиду рHW2000 [Hoffmann et al., 2000], разработанную для получения вируса гриппа методом обратной генетики. Плазмида рHW2000, а также плазмиды со вставками генов штамма вируса гриппа А/WSN/33были любезно предоставлены доктором Вебстером (Мемфис, США). Для накопления плазмид использовали штамм E.coli DH5alpha. Работа с бактериями, рестрикция и лигирование проводились по стандартным методикам [Маниатис и др., 1984] или в соответствии с рекомендациями производителя для соответствующих ферментов (Т4-лигаза, рестриктазы Esp31 и Eco311).

Компетентные клетки были созданы по методике Ханаана [Ханаан, 1998].

Секвенирование.

Для секвенирования использовались ПЦР-продукты, очищенные на колонках Wizard («Promega», США). Секвенирование проводилось фирмой Евроген на автоматическом секвенаторе MegaBAСE-500. Для анализа нуклеотидных последовательностей, а также для подбора праймеров для ПЦР и секвенирования, использовали пакеты программ VectorNTI 10.0. Синтез праймеров осуществлялся фирмой «Литех» (Москва).

Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen) либо в кокультуру клеток 293Т и MDCK по методике, описанной ранее [Hoffmann et al.,2000], либо в однодневный монослой клеток 293Т (плотность клеточного монослоя около 70%) в соответствии с методикой, прилагаемой к реагенту Lipofectamine LTX.

Статистическая обработка проводилась с использованием среднего квадратического отклонения и коэффициента Стьюдента.

На первых этапах работы были исследованы ts и ca фенотип партнеров по скрещиванию. ХА штамм А/Краснодар/101/35/59 полностью утратил способность размножаться при 40°С и 38°С, но хорошо размножался при 34°С и 26°С. При заражении куриных эмбрионов ХА штаммом инфекционные титры вируса при 34°С составляли 10^7.5 ЭИД₅₀/0.2мл, при 26°С - 10^5.5 ЭИД₅₀/0.2 мл, и при 38°С - менее 10^1.° ЭИД₅₀/0,2 мл. В то же время, титры вирулентного штамма А/Кумамото/102/02 (H3N2) составляли 10^6.5 ЭИД₅₀/0,2мл при 40°С, а при 26°С этот штамм не размножался. Другой эпидемический штамм А/Берн/07/95 активно размножался при 38°С (титр – 10^6.5 ЭИД50/0,2мл), при 34°С (титр - 10^7.5 ЭИД₅₀/0,2 мл) и так же не размножался при 26°С (Табл. 1).