Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием пцр в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией hrm
РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
жүктеу/скачать 3.31 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИАнализ данных на приборе Rotor-Gene Q Следует проверять графики на Rotor-Gene Q во всех реакциях. Изредка наблюдается усиление флуоресцентного сигнала отрицательного контроля без матрицы (ОК) и в отрицательных пробах. При встрече с подобной ситуацией и при наличии значения CT пользователю нужно отличить истинный случай усиления сигнала, который указывает на загрязнение отрицательного (ОК) от истинной амплификации и от линейного роста флуоресценции, который может возникнуть из-за флуоресцирующего артефакта.
Рис. 8.1 и 8.2 показывают два примера поведения отрицательных контролей (ОК) с инструкциями, как следует обращаться с данными графиков этих типов. На Рис. 8.1 видна нелинейная, т.е. истинная амплификация, возникшая из-за загрязнения: этот анализ следует отбросить, а пробы протестировать повторно. На Рис. 8.2 видна линейная амплификация отрицательного контроля. При данных обстоятельствах должна проверяться исходная флуоресценция: соответствующий график исходной флуоресценции показан на Рис. 8.3, демонстрируя линейный рост флуоресценции, а не истинное событие амплификации. Данные анализа могут быть использованы при условии, что прошли положительный и внутренний контроли. По сравнению с рис. 8.3, рис. 8.4 показывает исходные данные флуоресценции, где присутствует истинная амплификация. При этих обстоятельствах нужно отказаться от данных, образцы должны быть повторно проверены, поскольку это указывает на наличие контаминации. 
Рис. 8.1. Загрязнение ОК в анализируемом анализе 
Рис. 8.2. Пример линейного роста флуоресценции в пробирке с ОК. 
Рис. 8.3. Исходная флуоресценция. 
Рис. 8.4. Исходные данные флуоресценции, показывающие, что в пробирке с ОК амплификация происходит правильно.
Рис. 8.5 и 8.6 показаны два примера амплификации в реакциях с пробами, с инструкциями, указывающими на то, как следует обращаться с данными этих типов графиков. На Рис. 8.5 представлен анализ с правильной амплификация в пробирке с пробой. Если анализ показывает такой тип сигмоидальной амплификационной кривой, то это истинная амплификация, и данные этого анализа могут быть использованы при условии, что прошли положительный и внутренний контроли. Рис. 8.6 показывает линейную амплификацию в реакции с пробой. При этих условиях должны проверяться исходные данные флуоресценции: соответствующий график исходной флуоресценции показан на Рис. 8.7, указывая, что линейный рост на Рис. 8.5 соответствует линейному росту исходной флуоресценции. При условии, что прошли положительный и внутренний контроли, могут быть получены результаты проб для этих анализов. 
Рис. 8.5. Истинная амплификация в гнезде с пробой в анализируемой группе. 
Рис. 8.6. Пример линейного роста флуоресценции в двух гнездах с пробами. 
Рис. 8.7. Исходная флуоресценция.
1. Используя программное обеспечение Rotor-Gene Q series (2.0.2), откройте соответствующий файл. 2. Пометьте пробы. 5. Находясь на странице исходного канала для каждого детектора/канала, щелкните “Options” («Возможности») и введите “Crop start cycles” («Урезать стартовые циклы»). На странице с “Remove data before cycle” («Удалить данные перед циклом») введите 15 и щелкните “OK”. 4. Щелкните “Analyse” («Анализировать»). На странице анализа щелкните “Cycling A (from 15), Yellow” (Амплификация А (с 15), Желтый»), чтобы проверить канал HEX. 5. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните “Slope correct” («Выправление наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»). 6. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT. 7. На странице анализа щелкните “Cycling A (from 15), Green” («Амплификация А (с 15), Зеленый»), чтобы проверить канал FAM. 8. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните “Slope correct” («Выправление наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»). 9. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT.
1. Определите значения CT для ОК, чтобы удостовериться в отсутствии контаминации, дающей положительную амплификацию в сигнале FAM (CT меньше 45). См. п. 8.3 Анализ данных на Rotor-Gene Q. В пробирках с ОК сигнал HEX анализа внутреннего контроля должен давать положительный результат во всех 8 образцах (CT ≤35.00). Если в канале FAM есть положительная амплификация, а в сигнале HEX амплификация >35.00, результат должны быть исключены. 2. То же для всех других образцов; проверьте, чтобы каждая проба давала сигнал HEX от внутреннего контроля. Возможны 3 варианта: 2a. Если исследование внутреннего контроля дает положительный результат, (CT между 31–35), продолжите с анализ. 2b. Если внутренний контроль оказался неудачным(CT >35.00), но реакция FAM идет хорошо, продолжайте анализ, так как реакция FAM вытеснила реакцию внутреннего контроля. Это верно для реакций с положительным контролем FFPE-образцов. 2c. Если реакции в канале FAM и внутренний контроль не прошли, данные должны быть отброшены, поскольку в реакционной смеси могли присутствовать ингибиторы, приведшие к ложным отрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, но следует отметить, что ДНК также окажется разбавленной. 3. Значения CT контроля должны быть> 24.25 во избежание перегрузки анализа. Если значения CT контроля > 30.00–35.00, данные должны интерпретироваться с осторожностью. Если значения CT контроля > 35.00–40.00, то имеется только несколько копий амплификации. Анализ пробы: положительный контроль 1. В положительном контроле (BRAF) значения CT канала FAM должны лежать в интервале 24.13–30.13 2. Вычислите значение ΔCT следующим образом, удостоверившись в том, что значения CT как мутации, так и контроля от одной и той же пробы:
Таблица 4. Ожидаемые программой Rotor-Gene Q (2.0.2) значения положительного контроля (ПК) ΔCT
Анализ проб: образцы пациентов 1. Вычислите значение ΔCT убедившись, что мутационное и контрольное значение CT от одной и той же пробы. [мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT 2. В спорном случае сравните значение ΔCT для пробы с точкой отсечения для анализа (Таб. 5), удостоверившись, что для каждого анализа применена правильная точка отсечения. Точка отсечения это расположенная выше точка, в которой положительный сигнал мог быть благодаря фоновому сигналу праймера ARMS для ДНК дикого типа. Если значение ΔCT пробы выше точки отсечения, оно классифицируется как отрицательное или за пределами чувствительности набора. Если значение ΔCT выше точки отсечения, это классифицируется как отсутствие мутации в образце или недостаточной чувствительностью набора. Если значение ΔCT ниже точки отсечения, это классифицируется как наличие мутации в образце. Таблица 5. Усеченные значения программы Rotor-Gene Q (2.0.2)
Номера COSMIC взяты из Каталога соматических мутаций при раке (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Таблица 6. Перечень мутаций и номера по COSMIC
1. Добавить по 25 мкл воды без нуклеаз в пробирки. 2. Поместите пробирки в 72 – луночной ротор прибораRotor-Gene Q . Удостоверитьсято, что пробирки зафиксированы кольцом для предотвращения случайного открытия пробирок во время термоциклирования. 3. Для создания файла «Предварительного запуска» задайте температурный профиль. 4. Щелкните “New”, затем щелкните два раза на папке маркированной “Empty run” (Холостой пробег) (Рисунок 28). 
Рис. 28. Диалоговое ркно «Новый запуск» (New Run). 5. Выбирите 72-луночный ротор, удостоверьтесь, что фиксирующее кольцо на месте и нажмите “Next”. 
Рис. 29. Диалоговое окно «Мастер нового запуска». 6. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните “Next (Рис. 30).
Рис. 30. Установление параметров для предварительного запуска. 7. Выберите «Редактировать профиль» (Edit profile) (Рис.31)
Рис. 31. Установка параметров анализа. 8. Щелкните «Insert after» (Рис.32).
Рис. 32. Вставить шаг цикла. 9. Щелкните «Установка новой температуры» (New hold at temperature) (Рис.33)
Рис. 33. Изменение температурного режима 10. Установка температуры на 95 °C и времени 10 минут.. 
Рис. 34. Начальный шаг инкубации в 95°C 11. Щелкните «Вставить после» (Insert after), затем «Новый цикл» (New cycling)
Рис. 35. Начальный шаг инкубации в 95°C 12. На шаге 95°C выставить время 1 сек. (Рис. 36).
13. На шаге 60°C выставить время 1 сек. (Рис. 37). 
Рис. 37. Шаг цикла 60°C 14. Щелкните на шаге 72°C (Рис.38)
Рис. 38. Выбрать дополнительный шаг цикла 72°C 15. Щелкните на минус (“-“) в верхней правой стороне экрана, установите 72°C, затем нажмите «ОК» (Рис. 39). Количество циклов – 45.
Рис. 39. Удалить дополнительный шаг цикла 72°C 16. Щелкните «Next» (Рис.40). 
Рис. 40.Пропустиь установку канала и начать оптимизацию 17. Щелкните «Save template» и введите подходящее имя (Рис.41).
Рис. 41. Сохраните шаблон 18. Сохранить файл для дальнейшего использования (рисунок 42). Для того, чтобы открыть подходящий файл, щелкните два раза на выбранный файл. 
Рис. 42. Выбрать «warm-up run» (предварительный запуск). 19. Щелкните “Next” (Следующий), затем «New Run Wizard» (Мастер нового запуска) и щелкните «Start Run» (Начните запуск) для запускаанализа (Рис. 43). 
Рис. 43. Начать предварительный запуск.
Хранение Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» доставляется в сухом льду и по прибытию должен также оставаться замороженным. Если по прибытии набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» не заморожен, при транспортировке вскрывалась внешняя упаковка, посылка не содержит упаковочного листа, руководства или реактивов, пожалуйста, свяжитесь с одним из отделений Технической службы QIAGEN или местных дистрибьюторов. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» хранят при температуре от –15°C до –25°. Для обеспечения оптимальной активности и производительности праймеров Scorpions® набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен быть защищен от света во избежание дезактивации флуоресцентной метки. При хранении в рекомендуемых для этого условиях и в исходной упаковке набор стабилен до даты окончания срока хранения, указанной на этикетке. Следует избегать повторного оттаивания-замораживания. Мы рекомендуем максимум 7 циклов замораживания-оттаивания. Ограничение использования Полученные результаты должны интерпретироваться в контексте всех соответствующих клинических и лабораторных исследований и не должны применяться для диагностики отдельно. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен использоваться только персоналом, специально проинструктированным и обученным диагностике in vitro и работе на Rotor-Gene Q. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» валидирован для ДНК, выделенной из парафинизированных блоков, предварительно фиксированного в забуференном формалине образцов опухолевой ткани с использованием набора реагентов для выделения ДНК QIAGEN (Кат.№ 56404). Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для применения только в амплификаторе для проведения ПЦР в реальном времени Rotor-Gene Q серии 5plex HRM. Для получения оптимальных результатов необходимо строгое соответствие руководству по применению набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)». Реактивы должны готовиться согласно рекомендациям данной Инструкции. В противном случае, возможно, получить некорректные результаты. Важно, чтобы количество и качество ДНК в пробе определялось непосредственно перед проведением анализа данной пробы с использованием набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)». Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» имеет дополнительную контрольную смесь (Ctrl) для определения значения порогового цикла (CT), приемлемого для анализа. Следует обращать внимание на даты окончания срока годности и условия хранения, напечатанные на коробке и этикетках всех компонентов. Не используйте компоненты с истекшим сроком годности или неправильно хранившиеся. Руководство по устранению неисправностей Руководство по устранению неполадок может помочь в решении проблем, которые могут возникнуть. Подробнее см. также страницу «Часто задаваемые вопросы» в Центре технической поддержки: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Комментарии и советы Нет сигнала с положительным контролем KRAS (ПК) на флуоресцентном канале Cycling Green
Комментарии и советы Сигналы отрицательных контролей в канале флуоресценции Cycling Green для аналитической ПЦР
Техническая поддержка ООО «ИнтерЛабСервис» - официальный дистрибьютор продукции компании QIAGEN. Мы справедливо гордимся оперативностью и уровнем профессионализма в отношении оказания консультационной поддержки в отношении продукции QIAGEN всем пользователям. Сервисная служба ООО «ИнтерЛабСервис» предоставляет всестороннюю сервисную поддержку лабораторного оборудования, как в научно-исследовательских, так и в диагностических лабораториях с целью гарантии его продолжительной успешной работы. Клиенты компании «ИнтерЛабСервис» являются важным источником информации, полезной как для ученых и клиницистов. Мы будем рады, если вы свяжетесь с нами, если у вас есть какие-нибудь советы касательно продуктов, новых способов их применения и новых методов. жүктеу/скачать 3.31 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|
