Исследование белок-нуклеиновых контактов

Общее описание структуры.

DNA_ligase_A_M (ATP dependent DNA ligase domain) 1X9N

лигазы.

1)ДНК лигазу i

Цепь:А

ДНК-составляющую:

2) Дидезокси терминальную ДНК

Цепь:В

3)5’-фосфолирированную ДНК

4) TEMPLATE ДНК

Цепь:D

Также в данной структуре имеется лиганд – AMФ – аденозин монофосфат(C₁₀H₁₄N₅O₇P)

Предлагаемый скрипт dna.def к сожалению работать отказался. Вероятнее всего это обусловлено различным синтаксисом обозначения одних и тех де атомов в различным версиях RasMol-a и соответственно различном их обозначении в PDB файлах разного времени создания.

Для предопределения множества атомов оснований ДНК, обращённых в большую(малую) бороздку на основе старого был составлен новых скрипт mjg_mig.scr

Для определения различных контактов ДНК с белком были также предопределены следующие множества:

Polar_amp(define polar_amp amp and (nitrogen, oxygen)) – множество полярных атомов аденозин монофосфата

Hydro_amp(define hydro_amp amp and (nitrogen, oxygen)) – множество полярных атомов аденозин монофосфата

Интересен также тот факт, что при исправлении скрипта dna.def было замечено несоответствие кол-ва атомов, относимых к большой(малой) бороздке в скрипте и таковых в презентации к практикуму по A- и B-формам ДНК: в скрипте заданы не все атомы, которые указаны в презентации. Т.о. в работе было рассмотрено два случая:тот, который был в исходном скрипте и случай с ручным предопределением множества мажорной и минорной бороздок на основе презентации.

Далее будет рассмотрен случай, в котором интересующие множества были предопределены так, как это делалось в def.scr

1.Таблица. Контакты разного типа в комплексе ДНК-белок(для полной последовательности лигазы)

	Полярные	Гидрофобные	Всего
Контакты белка с ...
... остатками 2'-дезоксирибозы	15	81(27)	96(42)
... остатками фосфорной кислоты	40	-	40
... остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	0	0	0
... остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	3	1(3*)	4
… AMP	10	25	35

*значение ” три контакта” получено при задании множества mig по презентации

Т.о., основная часть контактов ДНК с белком приходится на полярные с участием остатка фосфорной кислоты и гидрофобные с участием остатка дезоксирибозы. Этот факт, вероятно, можно объяснить пространственным расположением данных групп: именно они составляют «внешнюю поверхность ” ДНК, находясь, таким образом непосредственно на границе ДНК-белок и являясь “открытыми” для образования контактов с а.о.

Атомы же больших и малых бороздок, напротив, участие в образовании контактов практически не принимают (4 контакта для малой бороздки, для большой контактов вообще не было выявлено). Это опять же можно объяснить их пространственным расположением(большинство атомов бороздок расположены слишком далеко от белка).

Далее рассмотрим контакты между ДНК и интересующим нас доменом DNA_ligase_A_M(542-746а.о.)

Для их нахождения зададим де же множества, только с учетом, что рассматривается не весь полипептид, а лишь его часть начиная с 542а.о. и заканчивая 746а.о.

1.Таблица. Контакты разного типа в комплексе ДНК-белок(для DNA_ligase_A_M(542-746а.о.)

	Полярные	Гидрофобные	Всего
Контакты белка с ...
... остатками 2'-дезоксирибозы	5	22	27
... остатками фосфорной кислоты	13	-	13
... остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	0	0	0
... остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	0	0	0
… AMP	10	26	36

К сожалению результаты для различных предопределений множеств mjd и mig совпадают: контактов не найдено ни для первого ни для второго случая.

Описание функций исследованного белка

Исследуемый белок относится к классу лигаз(синтетаз)(ДНК лигаза I) – ферментов, катализирующих реакцию соединение двух молекул в результате синтеза новой C-O, C-S, C-N или C-C связи, сопряжённое с одновременным гидролизом АТФ.

Рассмотрим механизм этой реакции, установленный Робертом Леманом.

1)Аденилирование: ATP или NAD⁺ вступают в реак­цию с ДНК-лигазой и образуют ковалентный комплекс фермент-AMP(при его образовании отщепляется пирофосфат), в котором AMP связан с ε-аминогруппой лизинового остатка фермента фосфоамидной связью .

2)Трансаденилирование: Адениловая группа переносится от белка на 5'-фосфорильную группу концевого остатка цепи ДНК

3)Лигирование(послед­няя стадия) - нуклеофильная атака активи­рованного атома фосфора 3'-ОН-группой. В результате образуется фосфодиэфирная связь и освобождается AMP.

Движущая сила этой последовательности реакций - ги­дролиз пирофосфата, отщепляющегося при образовании комплекса фермент—аденилат.

Реагенты			ATP						+	{deoxyribonucleotide}(N)	+ {deoxyribonucleotide}(M) =
Продукты			AMP						+	diphosphate	+ {deoxyribonucleotide}(N+M)

Для того, чтобы катализировать ковалентное сшивание цепей ДНК, ДНК-лигазе для начала необходимо определить место, в котором отсутствует фосфодиэфирная связь между дезоксирибозами. Такое место может быть определено лишь при образовании специфических контактов между лигазой и “поврежденным” участком ДНК. Так как фосфодиэфирная связь может отсутствовать между любыми парами нуклеотидов, то контакты между лигазой и азотистыми основаниями вряд ли можно отнести к специфическим в данном случае. Т.о., специфические контакты вероятно следует искать между лигазой и остатками дезоксирибозы и фосфорной кислоты, причем остатками находящимися именно в месте “разрыва”. Данную задачу затрудняет тот факт, что в исследуемой PDB структуре катализируемая лигазой реакция находится на стадии трансаденилирования, т.е. адениловая группа уже перенесена на 5'-фосфорильную группу концевого остатка цепи ДНК, что затрудняет поиск специфических контактов, обеспечивающих узнавание сайта в молекуле ДНК, т.к. это узнавание происходит до посадки адениловой группы. За неимением первоначальной(до трансаденилирования) ДНК и лигазы попробуем разобраться какие же контакты в имеющейся структуре возможно являются специфическими. Интересно также, что тот нуклеотид, который должен совершать нуклеофильную атаку активи­рованного атома фосфора 3'-ОН-группой, попросту не имеет данной группы, т.е. в его состав входит не дезоксирибоза, а дидезоксирибоза. Это также затрудняет поиск специфических контактов, т.к. вполне возможно, что 3'-OH группа также принимает в них участие. Рассматривать взаимодействия между AMP и белком также бессмысленно в данном случае, т.к. несмотря на их внушительное кол-во(35 штук), они вряд ли могут быть пцифическими по уже оговоренным причинам. Т.о .для поиска гипотетически специфических контактов рассмотрим все а.о., какие-либо атомы которых находятся на расстоянии 3.5(возможны полярные взаимодействия) и 4.5A от двух интересующих нас нуклеотидов.

Таких аминокислотных остатков 2 – Phe872 и Lys568(специфичность контактов для Lys568 также подтверждает то, что он является каталитическим остатком)

Лизин образует водородную связь с кислородом фосфорильной группы концевого остатка ДНК.

Фенилаланин расположен в плоскости практически параллельной плоскости остатка дезоксирибозы, причем расстояние между этими плоскостями менее 4А, что свидетельствует о наличии множественных гидрофобных взаимодействий между ними.

Рис.№3(специфические контакты)

Далее используя выравнивания из Pham проверим на сколько выбранные а.о. являются консервативными.

Получив выравнивания видим, что Lys568 является консервативным остатком, что подтверждает предположение, что он может образовывать специфические контакты.

Визуализация контактов между ДНК и белком с помощью nucplot

К сожалению получить данное изображение с помощью nucplot никак не удалось, изображение было взято с сайта http://www.ebi.ac.uk/