Полимеразно цепная реакция (ПЦР)

ВОПРОСЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
107
тосомно-рецессивных заболеваний. Наличие оши-
бочных диагнозов подчеркнул недостаток опоры 
на одной системе ПЦР зонда. Некоторые методы 
были использованы для сведения к минимуму 
возможности ошибочного диагноза, в том числе и
сама техника модифицированных форм ПЦР, такие 
как флуоресцентный ПЦР с удлинением праймера 
предварительного усиления (PEP), а также альтер-
нативные методы, такие как флуоресцентная ги-
бридизация in situ (FISH) [6].
Флуоресцентный ПЦР
В последние несколько лет, ПЦР-анализ был 
автоматизирован с помощью изменений в техно-
логии ПЦР. Одной из таких модификаций являет-
ся флуоресцентный ПЦР. Эта система использует 
флуоресцентные праймеры и автоматизированных 
секвенсор ДНК при определении продукта ПЦР 
тем самым улучшая точность и чувствительность 
ПЦР [7].
Флуоресцентный ПЦР очень похож на обычных 
ПЦР за исключением того, что каждый праймер 
помечен флуоресцентным красителем. В резуль-
тате флуоресцентный продукт при сканировании 
лазерным лучом электрофореза на геле заставяет 
флуоресцировать продукт. С помощью повышения 
качества фотомультипликации и компьютерных 
технологий, флуоресцентный краситель теперь 
можно обнаружить на гораздо более низком по-
роговом уровне, чем при обычном анализе агароз-
ного или акриламидного геля. Флуоресцентный 
ПЦР является высокочувствительным, примерно в 
1000 раз более чувствителен, чем анализ обычного 
геля, который позволяет обнаруживать сигнал на-
много ниже порога, который может быть получен 
традиционным методом. Это приводит к высокой 
точности и надежности обнаружения даже тогда, 
когда сигнал очень слабый или значительно ниже 
(<1%), чем у другого аллеля. Еще одно преиму-
щество люминесцентных ПЦР является то, что 
несколько праймеров могут быть мультиплексиро-
ваны вместе, так как различные флуоресцентные 
красители могут быть одновременно определены 
даже если диапазон продукта перекрывается друг 
с другом. Эти разноцветные красители позволяют 
идентифицировать один продукт от другого, даже 
если размеры продукта находятся в пределах 1-2bp 
друг от друга. Этот метод был применен для муль-
типлексирования целых 15 наборов праймеров. 
Флуоресцентный ПЦР уже был успешно применен 
для генетического скрининга на муковисцидоз, 
синдром Дауна, мышечные дистрофии и синдрома 
Lesch-Nyhan даже на уровне одной клетки. Флу-
оресцентный ПЦР дает точные количественные 
измерения, по которым можно определить соот-
ношение одного аллеля образца по отношению к 
другим. Эти количественные измерения позволя-
ют решить трудности ПЦР одной клетки, но при 
этом предстоит изучить аллельный отсев и преи-
мущественное усиление [8].
Multiplex ПЦР
Мультиплекс ПЦР включает в себя ПЦР, содер-
жащий несколько различных наборов праймеров в 
надежде, что каждый набор праймеров усилится 
настолько, чтобы было выполнено одновремен-
ное обнаружение генетичееского нарушения. Это 
может облегчить диагностику либо конкретного 
генетического заболевания или нескольких забо-
леваний, т.к. данный метод может предоставить 
информацию для многих локусов одновремен-
но. Тем не менее, мультиплексный ПЦР является 
очень сложной технологией, которая требует очень 
тщательных условий реакции, которые создают 
равное усиление для всех фрагментов; тщатель-
ность разработки праймеров, так чтобы избежать 
артефакты, образованный между праймерами и 
неспецифической амплификацией и последова-
тельность результатов различных размеров для об-
легчения анализа [9].
В 1990-х годах, FISH-технология впервые была 
применена для оценки анеуплоидии в хромосомах 
сперматозоидов (Holmes и Мартин, 1993; Templado 
и др., 1996; Van Hummelen и др.,) [10].
Автоматизированные системы клеточного 
анализа основанные на флуоресценции в неко-
торой степени широко используются в некото-
рых клинических и исследовательских лабора-
ториях. Хотя шаги подготовки и гибридизации 
идентичны ручному анализу, автоматизирован-
ная система предлагает 3 основных преимуще-
ства для анализа сигналов. Во-первых, время 
технологии значительно сокращается. Автома-
тизированный анализ и скоринг может работать 
без присмотра. Система может хранить изобра-
жения клеток для последующего ручного ана-
лиза, который является необходимым. Таким 
образом, система не является полностью авто-
матизированной, он все еще содержит рутиный 
просмотр сохраненных изображений, но значи-
тельно сокращает время, затрачиваемое на тех-
нологию анализа образцов [11].
Развитие хромосомной основы наследственно-
сти быстро привело к пониманию того, что изме-
нения числа хромосом в геноме несут ответствен-
ность за тяжелые аномалии плода, провокации 
выкидыша или ранней летальности эмбрионов 
(Jacobs и др., ) [12].

жүктеу/скачать 3.45 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: