Иван Георгиев Иванов биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на leucojum

2. Доказано е, че модифицираният колонен биореактор с вътрешни секции е най-подходящата култивационна система за биосинтез на галантамин от shoot култури на L. aestivum. Максималната продуктивност [48 μg/(L.day)] и максималният добив на галантамин (1.68 mg/L) се постигат чрез култивирането на L. aestivum shoot линия G 80 при температура 22°С и дебит на входящия въздух – 18 L/(L.h).

3. За пръв път са изследвани антиацетилхолинестеразните активности на комплексни алкалоидни смеси, получени от растителни in vitro системи на L. aestivum. Антиацетилхолинестеразните активности на алкалоидните, екстрахирани от биомасата (IC₅₀ 4.6 mg), са съпоставими с тези, екстрахирани от интактни растения.

4. Вследствие на мултиметаболитни анализи е доказано, че алкалоидните смеси, получени от L. aestivum shoot линия G 80, съдържат 18 Amaryllidaceae алкалоида, като три от тях са доминиращи – ликорин, галантамин и хамаин.

5. Доказано е, че температурата на култивиране на L. aestivum shoot линия G80 влияе на фенол-окислителното свързване на 4-О-метилнорбеладина и на формирането на алкалоиди с различен структурен тип.

6. Доказано е, че жасмоновата киселина (40 μМ), прибавена на 28-ия ден от началото на култивационния процес, е подходящ елиситор за индукция на биосинтеза на галантамин от L. aestivum shoot линия G 80. При този режим добивът на галантамин се увеличава 1.73 пъти.

7. Установено е, че жасмоновата киселина насочва вторичния метаболизъм на клетката преимуществено към биосинтез на алкалоиди чрез индуциране на тирозин декарбоксилазата

8. Селекционирана е линия L. aestivum LaR 28, акумулираща 332.3 μg/g СБ галантамин – биосинтетичен капацитет, сравним с най-добрите, съобщавани понастоящем за in vitro култури от този вид.

9. Постигнатият добив от галантамин (3.3 mg/L) при култивиране в колонен биореактор с вътрешни секции на линия L. aestivum LaR 28 е 1.96 пъти повече спрямо базисната линия G 80.

10. Чрез GC-MS анализи е доказано, че новоселекционираните линии, култивирани в колонен биореактор с вътрешни секции, биосинтезират предимно галантамин.

11. Установено е, че смолата Amberlite XAD-4 показва най-голям адсорбционен капацитет – 11.5 mg галантамин/1g смола. Най-подходящата елуентна система за максимална десорбция на галантамин (93.6%) е подкисленият с 1% (0.5М HCl) метанол.

12. Установено е, че при включване на втора фаза в 21-ия ден от началото на култивационния процес на линия L. aestivum LaR 28 в колонен биореактор с вътрешни секции се постига максимален добив от галантамин – 5.9 mg/L, като 96,3% от външноклетъчния галантамин се адсорбират върху втората фаза. Това е най-високият добив на галантамин от растителна in vitro система, съобщаван понастоящем.

13. Доказано е, че при двуфазно култивиране върху смолата Amberlite XAD-4 се адсорбира 3-О-метилгалантамин – нов за вида L. aestivum L. алкалоид.

ПРИНОСИ
1. Разработен е нов метод за разделяне и количествено определяне на галантамин, ликорин и норгалантамин в алкалоидни екстракти на shoot култури на L. aestivum, базиран на високоефективна течна хроматография.

2. За първи път е използвана „технологията” с временно разбъркване за биосинтез на Amaryllidaceae алкалоиди от диференцирани растителни in vitro системи.

3. За първи път е приложен мултиметаболитен анализ на алкалоидните смеси от shoot култури на L. aestivum като елемент от интегриран подход за оптимизиране на биосинтетичния процес.

4. Разработен е алгоритъм за селекция на shoot тип линии L. aestivum, базиран на вътреклетъчната изменчивост на вторичния метаболизъм на растителните клетки в калусните култури.

5. Разработен е нов двуфазен метод за култивиране на растителни in-vitro системи, биосинтезиращи галантамин.

6. Идентифициран е нов за вида Lеucojum aestivum L. алкалоид – 3-О-метилгалантамин.

Georgiev V., Ivanov I., Georgiev M., Ilieva M., Berkov S., Pavlov A., Alkaloids biosynthesis in Amaryllidaceae plant in vitro systems. European BioPerspectives –2008, 7 – 9 October, Hanover, Germany