«Изучение действия препарата киллевир на экспериментальную герпесвирусную инфекцию, включая варианты вируса с лекарственной устойчивостью»

Государственное учреждение научно-исследовательский

институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Российской Академии Медицинских Наук

ОТЧЕТ

о выполнении научно-исследовательских работ на тему: «Изучение действия

препарата киллевир на экспериментальную герпесвирусную инфекцию,

включая варианты вируса с лекарственной устойчивостью».

Москва - 2006

Количественно цитотоксичность определяли по способности мертвых клеток окрашиваться трипановым синим в соответствии с общепринятым методом (trypan blue exclusion method) [Holy A., De Clercq E., Votryba I. // Phosphonylmethyl Ethers of Nucleosides and their Acyclic Analogues / Ed. J.C. Martin. Washington, 1989, P.50-71; Галегов Г.А., Шобухов В.М., Леонтьева Н.А., Ясько М.В. // Биоорг. химия, 1997, №1, С. 906-909; Андронова В. Л., Скоробогатый М.В., Манасова Е.В. и др. //Биоорг. химия, 2003, №3, С.290-295; Fedorov I.I., Kazmina E.M., De Clercq E. et al. // J. Medicinal Chemistry. - 1997. -Vol. 40, № 4. - P. 486-494]. За величину 50% цитотоксической дозы/концентрации ЦД50

принимали концентрацию соединения, при которой выживаемость клеток составляла 50% через 72 ч контакта с изучаемыми соединениями.

Изучение противогерпесвирусной активности киллевира in vitro проводили с использованием двух международнопринятых методов.

1. 
   В соответствии с методом CPE inhibition assay [De Clerck E., Descamps J., Verheist G et al.// J. Infect. Dis., 1980, V.141, P. 563-573; Галегов Г.А., Шобухов В.М., Леонтьева НА., ЯськоМВ. //Биоорг. химия, 1997, №1, С. 906-909; Андронова В. Л., Скоробогатый М.В., МанасоваЕ.В. и др. //Биоорг. химия, 2003, №3, С.290-295; C.Janz, KWigand // Arch. Virol, 1982, V.73, P. 135-143; Fedorov I.I., Kazmina E.M., De Clercq E. et al. // J. Medicinal Chemistry. - 1997. - Vol. 40, № 4. - P. 486-494]. Монослойную культуру клеток Vero выращивали в 96-луночных пластиковых панелях (Linbro, Flow labor., UK) в атмосфере 5% СОг при 37 С⁰. Киллевир вводили непосредственно перед заражением. В двух парралелях готовили серийные разведения препарата киллевир с кратностью 2, затем в лунки со средой поддержки, содержащие препарат в известной концентрации вносили вирус герпеса простого тип 1 (ВПГ-1) с множественностью 0,1 БОЕ/кл. Среда поддержки: среды Игла и 199, соединенные в соотношении 1:1 + 2% ЭТС. После 48 часов инкубации, когда в контроле вируса развивался цитопатический эффект (ЦПЭ) на 95-100 % определяли концентрации киллевира, которые предотвращают развитие вирусиндуцированного ЦПЭ по сравнению с контролем на 50% и 95-100%, соответственно (ИД50 и ИД95).
   
2. 
   Непосредственный противовирусный эффект препарата оценивали методом снижения инфекционного титра вируса. Клетки, выращенные в 24-луночных планшетах, инфицировали с множественностью 0,1 БОЕ/кл. После одночасовой адсорбции клетки отмывали раствором Хенкса от неадсорбировавшегося вируса, и далее вносили среду поддержки, содержащую киллевир в известной концентрации. В контроле вируса среда поддержки не содержала препарат. Через 48 часов, когда в контроле вируса развивался
   

Для определения величины инфекционного титра вируса монослойные культуры, выращенные в 12-луночных пластиковых планшетах, заражали рядом серийных разведений вирусного материала с кратностью 10. После адсорбции в течение часа при 37°С инокулюм удаляли, клетки дважды отмывали от не адсорбировавшегося вируса и вносили среду Игла, содержащую 5% ЭТС и 0,4% агарозы ("SIGMA", USA). Через 48 ч клетки фиксировали 10% формальдегидом, окрашивали 0,5% раствором генцианвиолета и подсчитывали количество бляшек [R.T.Sarisky, T.T.Nguyen, K.E.Duffy et al. / Difference in incidence of spontaneous mutations between herpes simplex virus types 1 and 2. // Antimicrob. Agents and Chemother., 2000, V.44, № 6, p. 1524-1529].

Инфекционный титр «Т» вычисляли по формуле:

Т = (число бляшек в лунке х кратность разведения) : объем вносимого инокулюма

За минимально активную концентрацию (МАК) принималась концентрация, в присутствии которой инфекционный титр вируса снижается не менее чем на 1,25 lg БОЕ/мл по сравнению с контролем.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

При изучении токсического эффекта препарата киллевир для культуры клеток Vero в исследованном диапазоне концентраций от 500 мкг/мл и ниже после 72 ч инкубирования обнаружен незначительный цитотоксический эффект только в присутствии препарата в концентрации 500 мкг/мл при визуальной оценке внешнего состояния клеточного монослоя Таким образом МПК = 250 мкг/мл.

При использовании метода окрашивания клеток трипановым синим после 72 ч инкубации клеток в присутствии киллевира получены следующие результаты. Препарат в концентрации 250 вызывал гибель 61% клеток, в присутствии 200 мкг/мл препарата

погибало 52% клеток, в присутствии 125 мкг/мл препарата - 34% клеток (в контроле клеток количество погибших клеток 4%). Т.о. ЦД50 = 200 мкг/мл.

Противовирусную активность оценивали по способности препарата предотвращать развитие вирусиндуцированного цитопатического эффекта (CPE inhibition assay) в культуре клеток Vero в диапазоне нецитотоксических концентраций препарата.

Как видно из данных, приведенных в таблице 1, при изучении противогерпесвирусной активности препарата киллевир показано, что при его использовании в диапазоне концентраций от 250 мкг/мл до 62,5 мкг/мл в инфицированной культуре клеток через 48 ч развитие вирусиндуцированного ЦПЭ полностью ингибируется. В контроле вируса, т.е. в пробах, не содержащих киллевир, наблюдается ЦПЭ на 95-100%. При снижении концентрации киллевира до 31,25 - 15,6 мкг/мл развитие вирусиндуцированного ЦПЭ ингибировалось на 75 - 50%, что также является достоверным показателем. При использовании более низких концентраций препарата противовирусная активность в этом тесте не обнаруживалась.

Из таблицы 1 также четко следует, что аналогичные хорошо сравнимые результаты были получены при использовании вариантов вирусов, характеризующихся лекарственной резистентностью, т.е. резко сниженной чувствительностью к ацикловиру. Это наблюдается в случае двух вариантов ацикловиррезистентных вирусов. Образование вирусспецифического ЦПЭ под влиянием препарата предотвращается на 95-100% по сравнению с контрольными пробами, не содержащими киллевира. В этих условиях, как видно из таблицы 2 (в обобщенном виде представляющей результаты, приведенные в таблице 1), ацикловир даже в высоких концентрациях не предотвращает развития вирусспецифического ЦПЭ в культурах клеток, инфицированных двумя резистентными штаммами вируса герпеса простого.

Из таблицы 2 следует, что величины ИД50 и, следовательно, величины химиотерапевтического индекса, характеризующего селективность действия препарата, одинаковы для эталонного ацикловирчувствительного штамма ВПГ-1 и двух включенных в исследование ацикловиррезистентных штаммов вируса.

по сравнению с контролем клеток «+» поражение не более 25%

ВПГ-1 L₂- эталонный штамм вируса герпеса простого типа 1;

АЦВ^R ВПГ-1 - лабораторный штамм вируса, высокорезистентный к ацикловиру

АЦВ^R/Чех ВПГ-1 - клинический изолят ВПГ, резистентный к ацикловиру.

Множественность инфицирования 0,1 БОЕ/кл, продолжительность инкубированияч 48 ч.

Оценка подавления развития вирусиндуцированного ЦПЭ по сравнению с контролем вируса: «-» - полное подавление развития (отсутствие) ЦПЭ ВПГ (ИД₁₀₀)

«+» - поражено не более 25% (защита кл. монослоя от ЦПЭ ВПГ на 75%)

«++»- поражено не более 50% (ИД₅₀)

«+++» - поражено не более 75%

«++++» - полное поражение клеточного монослоя

Изучение противовирусного действия киллевира по снижению инфекционного титра вируса на модели лабораторного ацикловиррезистентного штамма АЦВ^R ВПГ-1 показало, что минимальной достоверной противовирусной активностью обладает

препарат в концентрации 15,6 мкг/мл. Полученный эффект был достоверно > 1,0 lg (см. таблицу 3).

Таблица 2. Противогерпесвирусная активность препарата киллевир в отношении резистентных штаммов вируса герпеса простого в культуре клеток Vero.

Вирус	Ацикловир		Киллевир
	ИД50 [мкг/мл]	ИД95 [мкг/мл]	ИД50 [мкг/мл]	ИД95 [мкг/мл]	хти МПК : ИД50
ВПГ-1 L2	0,4	1,56	15,6	62,5	16
АЦВR ВПГ-1	>100	>100	15,6	62,5	16
АЦВR/ЧехВПГ-1	50	> 100	15,5	62,5	16

Примечание: ВПГ-1 Ьг- эталонный высокочувствительный к ацикловиру штамм вируса герпеса простого типа 1;

AIJB^R ВПГ-1 - лабораторный штамм вируса, высокорезистентный к ацикловиру

AUB^R/4ex ВПГ-1 - штамм, резистентный к ацикловиру, изолированный из клинического

материала.

Множественность инфицирования 0,1 БОЕ/кл, продолжительность инкубированияч 48 ч.

В таблице приведены результаты трех независимых опытов.

В таблице приведены результаты двух независимых опытов.

1. 
   Цитотоксический эффект препарата киллевир на культуру клеток Vero (при изучении в диапазоне от 500 до 3,9 мкг/мл) проявляется при визуальной оценке состояния клеточного монослоя только в концентрации 500 мкг/мл. При использовании метода окрашивания клеток трипановым синим в присутствии киллевира в концентрации 200 мкг/мл погибает 50% клеток.
   
2. 
   Изучено действие препарата киллевир на репродукцию трех вариантов вируса герпеса простого типа 1, включая два штамма вируса с высоким уровнем лекарственной устойчивости к ацикловиру. Установлено, что киллевир в концентрации 15,6 мкг/мл обладает достоверной активностью в культуре клеток Vero, обеспечивая 50% ингибирование развития вирусиндуцированного ЦПЭ и снижая инфекционный титр вируса на 1,77 lg БОЕ/мл. При использовании препарата в концентрации 62,5 мкг/мл достигается полное подавление развития вирусиндуцированного ЦПЭ; в этих условиях внешний вид зараженных клеток не отличается от внешнего вида незараженных клеток.