Жоспар: Кіріспе Негізгі бөлім Қорытынды Пайдаланылған әдебиеттер Кіріспе
жүктеу/скачать 22.02 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Негізгі бөлім
|
ЖОСПАР: Кіріспе Негізгі бөлім Қорытынды Пайдаланылған әдебиеттер Кіріспе Рестриктаза – рестрикция эндонуклеазалары, (латын тілінен, Restrictio -шектеу) – ферменттер тобы, гидролиз тобына жатады және нуклеин қышқылдарының гидролизге ұшырауына катализатор ретінде қолданылады.Рестриктазалардың экзонуклеаздардан басты айырмашылығы, нуклейн қышқылдарын ДНҚ молекуласының соңынан кеспейді, керісінше ДНҚ молекуласының ортасынан кеседі. Осы тұста әрбір рестриктаза ДНҚ молекуласының төрт нуклеотидтен тұратын бөлігін анықтап, нуклейн қышқылын сол тізбік ішінен анықтау сайтына сәйкес кеседі. Рестрикция сайты (анықтау бөлігі) – дегеніміз ДНҚ молекуласының қысқа бөлігі, осы бөлікті эндонуклеаза ферменттері анықтап, рестриктазаның кесуін атаймыз. Рестриктазалар, осы үрдіс кезінде ДНҚ молекуласының рестрикция сайтына сәйкес бөлігін анықтап, сол тізбектегі ковалентті байланыстарды үзіп, тізбектің ішінен кесу. Рестрикциялық эндонуклеазалар, рестриктазалар нуклеин қышқылдарының гидролиз реакциясын катализдейтін гидролазалар класына жататын ферменттер тобы. Экзонуклеазалардан айырмашылығы рестриктазалар нуклеин қышқылдарын молекуланың ұшынан емес, ортасынан бөледі. Бұл жағдайда әрбір рестрикциялық фермент ұзындығы төрт негіз жұбы болатын белгілі бір ДНҚ сегментін таниды және тану орнында немесе оның сыртында нуклеотидтік тізбекті үзеді. Негізгі бөлім Рестрикциялық эндонуклеазалар, рестриктазалар (латын тілінен рестрикция – шектеу) – нуклеин қышқылдарының гидролиз реакциясын катализдейтін гидролазалар класына жататын ферменттер тобы. Экзонуклеазалардан айырмашылығы рестриктазалар нуклеин қышқылдарын молекуланың ұшынан емес, ортасынан бөледі. Бұл жағдайда әрбір рестрикциялық фермент ұзындығы төрт негіз жұбы болатын белгілі бір ДНҚ сегментін таниды және тану орнында немесе оның сыртында нуклеотидтік тізбекті үзеді. Буфер дегеніміз — өзгеріске қарсы тұратын зат. Химиялықтілмен айтқанда, буфер дегеніміз ерітіндіге шамалы мөлшерде күшті қышқыл немесе күшті негіз қосылғанда, ерітіндідегі рН-ты тұрақты күйде ұстап тұратын қосылыс болып табылады. Буферлі ерітінді әлсіз қышқылдан және үйлескен негізден тұрады. Буферлер қалай жүмыс істейді? рН мәні 7-ге тең жай суға бірдей мөлшерде күшті қышқыл немесе күшті негіз қосқан кезде, онда пайда болатын рН өзгерістері мен рН мәні 7-ге тең буферлі ерітіндіні өзара салыстырып көрейік. Егер де 1.0 мл 0.1 М НСІ ерітіндісін 99.0 мл суға қосатын болсақ ондағы рН көрсеткіші айтарлықтай төмендейді. Ал, суға 0.1 М НСІ ерітіндісінің орнына 0.1 Л/№ ОН еііітіндісін қосатын болсақ, онда рН мәні айтарлықтай жоғарылай түседі. Ендеше, 1.0 мл 0.1 М НСІ ерітіндісін суға қосқан жағдайда не болатынын есептеп көрейік. НСІ — күшті қышқыл болып табылатындықтан, 0.1 М НСІ толыкдиссоциацияға ұшыраған кездеО.І ІІ/Н30 +түзіледі деуге болады. Егерде бізде Імл қышқыл болса, одан шығатын Н30+ мөлшерін келесі формула арқылы есептеп шығаруға болады: Імл = 1 х 10~3 л 1 х 10_3 л х 0.1 моль/л = 1 х 10~4 моль Н30 + Сонымен, 100 мл немесе 0.1 л су көлемінде 1 х 10-4 моль Н30 + ионы ериді, өйткені 99.0 мл-ге 1.0 мл қосылды. Н30 + ионының нақты концентрациясын келесі жолмен есептеуге болады: 1 х Ю-4 моль Н30 +/ О.іл = 1 х 10~3 М рН метр Буферленбеген Н20 Электрод Буферленген рН 7.0 1 мл 0.1 М №ОН қосқаннан кейін рН өте жоғары рН буфермен тұрақталды Сонан соң, рН келесі формула арқылы есептеледі: 90 2-ТАРАУ Су: биохимиялың реакциялар үшін еріткіш рн = -Іов [Н30+] = -1о§ (1 х 10-3) = 3 Егер біз 1 мл 0.1 Л/ИаОН ерітіндісін қосатын болсақ, [ОН-] қажетті иондық концентрациясын тудыру үшін есептеу жолы осыған ұқсас болады. Олай бол- са, [ОН-] концентрациясы 1 х 10-3Л/тең болады. Өйткені, негіздің концен- трациясы мен көлемі жоғарыда келтірілген мысалдағыдай болып табылады. ОН- концентрациясын пайдалану арқылы [Н30 +] мөлшері есептеледі. [ОН-] [Н30+] = 1 х ю-14 [Н30 +] = 1 х 10-14 / [ОН-] = 1 х 10-14 / 1 х 10-3 = 1 х Ю-11 Соңынан рН есептелінеді: рН = -І0£ (1 х 10~п) =11 Егер де 99.0 мл. жай судың орнына 99.0 мл. буфер ерітіндісін алатын болсақ, мүлдем басқа нәтижелер шығады. Бір сутекті және екі сутекті фос- фаттардан яғни, Н Р 042- және Н2Р 0 4- иондарының белгілі бір қатынасынан тұратын ерітінді буфер ретінде қызмет атқарады. Гендерсон-Хассельбах теңдеуін қолдана отырып, Н Р 042- / Н2РО ~ үлестік қатынасын есептеуге бо- лады. Төменде көрсетілгендей, олардың үлестік қатынасының рН мәні 7.0- ге сәйкес. Мұндай ерітіндіде үйлескен негіз / әлсіз қышқыл 0.63 қатынасында бо- лады. Егер 1.0 мл 0.10 М НСІ ерітіндісін 99.0 мл буфер ерітіндісіне қосатын болсақ, мынадай реакция жүреді: [НРО|“] + Н+^ Н 2Р 0 4_ Биохимия 91 яғни, қосылған Н+ иондарының барлығы жұмсалады. Ал Н Р 042- және Н2Р 0 4_ иондарының концентрациялары өзгереді. Олардың жаңа концентрацияларын есептеп шығаруға болады. Гендерсон-Хассельбах теңдеуін және фосфат ионының концентрацияларын пайдалана отырып жаңа рН мәнін есептеуге болады. рКа көрсеткішінің мәні 7.20 тең (2.6-кестені қараңыз). [НРОГ] рһ I Щ 1 Іое I——ІЙ І р 4 6 [Н2Р04 ] 0.062 рН = 7.20 + 108 — рН = 6.99 Жаңа рН мәні 6.99-ға тең. Бұл буферсіз жай суға қарағанда шамалы ғана өзгеріс деп есептеледі (2.14-сурет). Дәл осылайша, егер 1.0 мл 0.1 МЫаОН пай- даланылса, титрлену барысында жоғарыда көрсетілген реакцияға ұқсас реак- ция жүреді, атап айтқанда: рН = — іоб (1 х 10_и) = 11 Қосылған ОН- ионының барлығына жуығы жұмсалып, шамалы мөлшері бос күйінде қалады. Бұл буфер сулы ерітінді болғандықтан, = [Н+] [ОН* ] теңдеуі тура болып есептеледі. Гидроксид ионының концентрация- сы жоғарылауынан сутегі ионының концентрациясы төмендей бастайды және рН мәні жоғарылай түседі. Жаңа рН мәнін есептеу үшін және соның нәтижесінде рН = 7.01 болатындығына көз жеткізу үшін Гендерсон-Хассель- бах теңдеуін қолданыңыз. Нәтижесінде, жаңа рН мәні жай суға қарағанда жоғарыдағыдай шамалыөзгеріскеұшырайды (2.14-сурет). рН мәні айтарлықтай өзгеріске ұшырайтын болса, биологиялықреакциялардың көпшілігі жүрмейді, сондықтан да буферлердің биохимиялық зертхана үшін тәжірибелік маңызы өте үлкен. Буферлік ерітінділер — сутек иондарының концентрациясын белгілі бір дәрежеде ұстайтын ерітінділер. Олар негізінен әлсіз қышқылдар немесе негіздер және олардың тұздарының қоспасынан тұрады, сұйылтқанда, концентрлегенде, күшті қышқыл немесе негіздің аз мөлшерін қосқанда өзінің сутектік көрсеткішінің (рН) мәнін болымсыз өзгертеді. Мысалы: ацетаттық буферлік ерітінділернің (СН3СООН+ +СН3СООNa қоспасының) pH-ы 4,7, лимондық Буферлік ерітінділернің (С6Н6О7Na2 ерітіндісі) pH-ы 5,0, фосфаттық Буферлік ерітінділернің (Na2Н2РО4+ +NaОН қоспасының ерітіндісі) pH-ы 11,5. Буферлік ерітінділер аналитикалық химияда, биохимиялық және физиологиялық зерттеулерде кеңінен қолданылады. Буферлік ерітінділер тірі организмдерде үлкен рөл атқарады (мысалы, қанның, лимфалардың, клеткааралық сұйықтардың pH тұрақтылығы). Олардың бикарбонаттық, фосфаттық, белоктық (белоктар әлсіз қышқылдық әрі негіздік қасиет көрсетеді) табиғаты бар.
Рестриктазалар - дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын болшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Рестриктазалардың ерскшеліктері ДНҚ молекуласын кез кслген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Әрбір рестриктазаның тандайтын нуклеотидтср орналасу тәртібі бар. Бұл әдетте 4-6 жұп нуклеотидтер, әртүрлі рестриктазалар үзетін жеріндегі нуклеотидтердің құрамында айырмашылығы болады. Мысалы Е. соІі рестриктазасы ДНҚ молекуласын ГААТТЦ учаскесіндс үзеді, Ват -НІ-ГГАТЦЦ учаскесінде. Қазір әр түрлі рестрикта-залардың жүзден артық өзіндік бірізділігі белгілі. ДНК тізбегінің ұзына бойында нуклеотидтер кездейсоқ орналасса, теөт белгілі нуклеотидтен тұратын жүйелілік (бірізділік) 1/256-ға, ал алты нуклеотидтен - 1/4096 тең болады. Сондықтан рестриктазалар ДНК-ны бірнеше жүздеген немесе мындаған нуклеотидтер жұптарынан түратын бөлшектерге үзеді. Рестрикциялау — модификациялау құбылысы 50-ші жылдары байқалған болатын. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді, ал модификация — молекуланың белгілі топтарын химиялық жолмен немесе оларға баска топтарды жалғау арқылы өзгерту. Рестрикция мен модификациялау құпиясын В. Арбер ашты. Бактерияның "өзінің" нуклеин кышқылын "бөтен" фагтардың (вирустардың) нуклеин қышқылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның клеткада көбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қатар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның өзінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мөлшерде әрбір репликациядан кейін метил тобын (СН3) жалғап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза "өзінікі" санап оған "тиіспейді". Бұл бактериялардағы өзіндік бір "иммундык жүйе" іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қышқылы кездейсоқ метилденіп кетеді. Осы қателігінен бактерияның өзі фагтың әсерінен қырылып калады. Осы құбылысты О. Смит, Д. Натанс және В. Арбер ашты. Рестриктазалар табиғаттың ген инженериясына арнап жасаған таптырмас құралы. Бактерия әр түрлі болғандықтан олардың рестриктазалары ДНҚ-ны әртүрлі жолмен үзеді.[Қазір 500-ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни зерттеуші рестриктазаны тандай отырып ДНҚ-дан қалаған ферментті нсмесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады. Генді бөліп алу мен ген өркенін (клондарын) алу үшін әртүрлі объектілер (бактериялардан, сүтқоректілер клеткаларынан, құстардан т. б. алынған) және әртүрлі вирустар жұқтырылган ортада өсірілетін ерекше ферменттер құрал ретінде пайдаланылады. Негізіндс олар үш түрлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза жәис кері транскриптаза. Асыл тұқымды жануарлардың мутациясын нүктелік детекциялау амплификация өнімін РФҰП талдауы негізінде жүргізіледі. Бір жағдайда нүктелік детекция кезінде белгілі бір нуклеазаның рестрикция сайты жоғалады, басқа жағдайда керісінше, рестриктазаға қажетті рестриктаза сайты пайда болады. Молекулярлық-генетикалық диагностиканың келесі сатысы амплификатты рестрикциялау болып табылады. ДНҚ-ны рестрикциялау (кесу) рестриктаза көмегімен іске асырылады, рестриктаза бактериалды эндонуклеаза тобына жатады. ДҢҚ тізбегінің үзілуі не симметрияның өсі бойынша жүруі мүмкін, онда «доғал» ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ваll немесе ВsuRI рестриктазалары), не симметрия өсінен біршама қашықтықта өтуі мүмкін, онда шығыңқы «жабысқақ» 5′ (ЕсоRІ, Ніnd III— және т. б. рестриктазалар) немесе 3′ (РstІ рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі.
Буферы - буферлік жүйесі бар, ол шешимдер. құрамы мықты негіздер немесе әлсіз негіздер және олардың тұздары бар көрсетілген сандық қатынасы әлсіз қышқылдар және олардың тұздары бар онда қоспасы деп аталатын буферлік жққйелердыші. Мұндай шешімдер бейтарап сұйылтып еріткіш (су)бойынша Н + иондарының тұрақты шоғырлану бар және оларға күшті қышқылдар немесе негіздер белгілі бір соманы қосу. Буферлік Ерітінділер: Дайындау Және Пайдалану
Буферлік ерітінділер, мұхиттар суларында топырақ шешімдер болып табылады және тіріоргандерде. Бұл жүйелер метаболикалық астрономардың табысты пайда үшін қажетті көрсетілген құнмен белсенді Ортаның науксын қолдауға басқару элементтері функларды жұмыс істейді. Буферлік эрітінділер қышқыл және негізгі жіктеледі. аммоний - мысал бирюзового ацетата буферный раствор жүйесі, екінші болуы мүмкін. табиғи және жасанды буферлік ажыратады. Табиғи буферлік ерітінді гидрокарбонаты, фосфаты, ақуыз, гемоглобин және қышқыл буферлік жүйені қамтитын қан болып табылады. Жасанды буферный раствор CH3COOH тұратын, ацетатный буферный раствор болюсной кислоты. ацетаты қышқылы / натрий ацетаты: біз ацетаты буферлік жүйенің мысалды қарастырайық буферлік жүйелердің іс-қимыл ішкі құрылымы менджин ерекшеліктері. сулы ортада буферлік жүйе құрамдас ұшырайды электролиттик диссоциациялану. Натрий ацетаты әлсіз қышқылдың тұзы және күшті негіз ретінде толық иондары ішіне диссоциирует. буферлік қоспаның аниондар болуы ондағы тұздың сознаниясы және диссоциациялану ониң дәрежесіне байланысты. буферлік жүйеде H + иондарының концентрациисы оған қышқылының концентрации және осы қышқылы тұздарының оның мазмұнына кері пропорционал тікелей пропорционалды. жүктеу/скачать 22.02 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|