Клинико-патогенетическое значение исследования аутоантител к ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма у больных ревматоидным артритом 14. 00. 39 ревматология

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

диссертационного совета Д 208.008.02

доктор медицинских наук, профессор А.Р. Бабаева

ВВЕДЕНИЕ

Хроническое прогрессирующее, нередко инвалидизирующее течение РА ставит перед врачами задачу возможно более ранней его диагностики. Однако распознавание РА на ранней стадии представляет значительные трудности. По настоящее время не найдено строго специфичного для РА лабораторного теста. Только сочетание многих клинических и лабораторных признаков может оказать помощь в диагностике этого заболевания. Поэтому и сейчас продолжается поиск методов, позволяющих дифференцировать ревматоидный артрит среди множества воспалительных и дегенеративных болезней опорно-двигательного аппарата.

По современным представлениям, поражение соединительной ткани при РА является следствием развивающихся иммунопатологических нарушений. Об аутоиммунной природе РА свидетельствует ряд признаков: выявление ревматоидного фактора, циркулирующих иммунных комплексов, сенсибилизированных к компонентам соединительной ткани лимфоцитов, а также широкого спектра аутоантител (Ат). Иммунная система обладает определенной автономностью в распознавании и удалении чужеродных клеток, антигенов и других веществ, но, наряду с этим, она находится под строгим гомеостатическим контролем, участие в котором принимает и множество биохимических реакций [Мартемьянов В.Ф., 2006]. Существующая биохимическая гетерогенность РА, очевидно, обусловлена наличием конституциональной биохимической индивидуальности человека и зависит от нарушений именно надмолекулярного порядка, затрагивающих клеточные, тканевые, системные уровни.

Активно обсуждается вопрос об участии в патогенезе аутоиммунных заболеваний различных нарушений, связанных с метаболическими процессами, происходящими на клеточном или субклеточном уровнях, медиаторами которых являются ферменты. Биохимические реакции, составляя материальную основу всех функциональных процессов организма, несут адаптационную, гомеостатическую миссию.

В последние годы пристальное внимание уделяют участию активных форм кислорода и антиоксидантной системы (АОС) в физиологических и патологических процессах, в том числе и при РЗ. Теоретическим обоснованием участия свободных радикалов в патогенезе аутоиммунных РЗ является способность повреждать белки, липиды, ДНК, придавая им свойства аутоантигенов и провоцируя выработку аутоантител [Foltyn V.N., 2001; Bombardier C., 2005]. Недостаточность антиоксидантной защиты при РА, выражающаяся в накоплении вторичных продуктов свободнорадикальных реакций может быть связана с образованием антител к ферментам-антиоксидантам.

Также возрос интерес к изучению метаболизма пуриновых соединений в норме и при патологии. Это связано не только со значением данного цикла в обмене нуклеиновых кислот, но и с той важной биологической ролью, которую выполняют его отдельные, составные части: ферменты и промежуточные субстраты. С активностью аденозиндезаминазы, являющейся ключевым ферментом пуринового метаболизма (ПМ), тесно связаны иммунологические процессы в организме. От активности данного фермента зависит внутриклеточная концентрация аденозина и дезоксиаденозина – пуриновых метаболитов, играющих важную роль в процессах кооперативных взаимодействий клеток иммунной системы. Снижение активности аденозиндезаминазы и следующие за этим многочисленные изменения, являющиеся результатом накопления в клетке токсических концентраций аденозина, дезоксиаденозина и соответствующих нуклеотидов, а также блокады рибонуклеотидредуктазы, приводят, в конечном счете, к остановке биосинтеза РНК, ДНК и гибели клеток.

С активностью ряда ферментов гуаниновой ветви обмена пуриновых производных связаны процессы созревания Т-клеток и развитие Т-клеточного иммунитета в организме, процессы деградации пуринового нуклеозида – гуанозина, обладающего выраженными регуляторной и физиологической активностями.

Связующим звеном между двумя ферментными системами (АОС и ПМ) выступает ксантиноксидаза – эндогенный фактор, способствующий интенсификации свободнорадикального окисления и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Ксантиноксидаза действует на заключительном этапе пуринового метаболизма, окисляя ксантин и гипоксантин до мочевой кислоты. Своеобразие действия этого фермента заключается в том, что он представляет собой как бы комплекс, функционирующий двояко: фермент может работать как оксидаза, и как дегидрогеназа. По соотношению активности ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы можно судить о напряженности оксидантных и антиоксидантных процессов.

Согласно данным ряда авторов [Заводовский Б.В., 2004; Гонтарь И.П., 2006] у больных РА наблюдаются существенные изменения активности ряда ферментов АОС и пуринового метаболизма в сыворотке крови, которые в ряде случаев коррелируют с активностью патологического процесса. Учитывая характерные иммунологические нарушения при аутоиммунных заболеваниях, можно предположить, что изменение энзиматической активности ряда ферментов пуринового метаболизма может быть связано с гиперпродукцией аутоантител к ним.

Имеющиеся в литературе сведения по изучению Ат к энзимам АОС и ПМ при некоторых РЗ [Lee J.Y., 2002; Негметзянова Е.С., 2006; Котельникова О.В., 2007] разрознены, как правило, противоречивы и, главное, не систематизированы. При этом следует отметить, что патологическое действие подобных антител до конца не определено. В связи с этим представляется перспективным комплексное исследование у больных РА антител к основным ферментам АОС – супероксиддисмутазе (СОД), глутатионредуктазе (ГР), каталазе (КАТ), церулоплазмину (ЦП) и основным ферментам ПМ – аденозиндезаминазе (АДА), 5'-нуклеотидазе (5'-НТ), пуриннуклеозидфосфорилазе (ПНФ), гуаниндезаминазе (ГДА), ксантиноксидазе (КО), что позволит выяснить некоторые детали патогенеза данного заболевания, будет способствовать более точной оценки активности патологического процесса и выработке усовершенствованных способов диагностики РА и дифференциальной диагностики воспалительных и дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов. Результаты исследования могут дать дополнительные критерии эффективности проводимой терапии, что, в конечном итоге, поможет облегчить состояние больных РА и уменьшить затраты, связанные с этим страданием.

Целью настоящего исследования является повышение качества диагностики, дифференциальной диагностики, уточнение отдельных звеньев патогенеза, объективизация контроля эффективности проводимой терапии при ревматоидном артрите путем изучения процессов аутоантителообразования к ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. 
   Получить иммобилизированные формы СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО, изучить их физико-химические свойства.
   
2. 
   Отработать условия и технику постановки иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированных антигенных препаратов на основе энзимов АОС и ПМ для определения специфических аутоантител; провести выбор предпочтительной методики.
   
3. 
   Изучить иммунобиохимические свойства иммобилизированных ферментов АОС и ПМ в условиях in vitro.
   
4. 
   Изучить содержания аутоантител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО в сыворотке крови здоровых людей и определить границы нормы этих показателей в зависимости от пола и возраста.
   
5. 
   На основе разработанных методик иммуноанализа изучить содержание антител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, ГДА, 5'-НТ, ПНФ и КО в сыворотке крови больных ОА в зависимости от клинико-иммунологических особенностей заболевания.
   

1. 
   На основе разработанных методик иммуноанализа изучить содержание аутоантител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности, характера течения, наличия системных проявлений и других клинико-иммунологических особенностей заболевания.
   
2. 
   Исследовать взаимосвязь процессов аутоантителогенеза к ферментам АОС и ПМ с изменением активности ферментов в сыворотке крови больных РА.
   
3. 
   Провести оценку качества жизни, связанного со здоровьем, у больных РА и ОА.
   
4. 
   Исследовать динамику содержания антиферментных антител у больных РА на стационарном этапе наблюдения и оценить возможность использования предлагаемых тестов в качестве показателей эффективности проводимой терапии.
   
5. 
   Определить диагностическое значение антител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО в сыворотке крови при дифференциальной диагностике воспалительных и дегенеративно-дистрофических заболеваниях суставов.
   
6. 
   Разработать и реализовать программно-информационный комплекс поддержки диагностики РЗ и проверить эффективность разработанных методов и алгоритмов в ходе опытной эксплуатации диагностического комплекса.
   

Впервые дана комплексная оценка процессов антителогенеза к ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма у больных РА. Для иммунодиагностики воспалительных и дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов разработаны и применены в методах лабораторного анализа иммобилизированные формы основных энзимов антиоксидантной системы и пуринового метаболизма; подобраны оптимальные концентрации антигенов и определены соответствующие условия иммобилизации ферментов, позволяющие сохранять их биологические функции.

В сыворотке крови больных РА обнаружены антитела к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крови здоровых лиц и больных с другими РЗ, протекающими с выраженным суставным синдромом.

Впервые проведено комплексное сравнительное исследование содержания аутоантител к ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма в сыворотке крови больных РА. Проанализирована зависимость указанных показателей от активности и характера течения патологического процесса, наличия системных проявлений заболевания. Выявлено, что концентрация антител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО у больных РА коррелирует с активностью патологического процесса, а наличие системных проявлений сопровождается максимальными значениями исследуемых аутоантител. Динамика содержания аутоантител к ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма позволяет прогнозировать клиническое течение РА и судить об эффективности проводимой терапии.

Впервые при заболеваниях суставов изучены корреляционные связи между ферментативной активностью и содержанием аутоантител к включенным в исследование энзимам; прослежена связь с наиболее важными клиническими симптомами заболеваний. Дана оценка возможности использования разработанных иммунологических тестов для прогнозирования течения РА и дифференциальной диагностики воспалительных и дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов.

Создан программно-информационный комплекс поддержки диагностики РЗ, который показал свою эффективность в опытной эксплуатации.

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ферментам АОС и ПМ. Проведенные исследования показали достоверные различия в содержании антител к энзимам АОС и ПМ у больных с воспалительными и дегенеративно-дистрофи­ческими заболеваниями суставов, что позволяет использовать данные тесты вместе с другими клинико-лабораторными показателями для дифференциальной диагностики этих заболеваний. Определение антител к энзимам АОС и ПМ в динамике дает возможность судить об эффективности и адекватности проводимой на стационарном этапе терапии; положительная динамика уровней антител к изучаемым энзимам коррелирует с клиническим улучшением при РА.

Опытная эксплуатация разработанного программно-информационного комплекса поддержки диагностики ревматических заболеваний показала эффективность его применения в клинической практике; использование комплекса позволило уменьшить количество исследований, проводящихся при диагностике РА, сократить время диагностики и затраты на ее проведение.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. 
   Содержание антител к ферментам АОС и ПМ в сыворотке крови зависит от активности и тяжести воспалительных ревматических заболеваний.
   
2. 
   Определение уровня антиэнзимных антител может использоваться для диагностики активности патологического процесса при РА, дифференциальной диагностики и для контроля эффективности проводимой терапии.
   
3. 
   Одной из причин снижения ферментативной активности большинства энзимов АОС и ПМ при РА является усиление антителогенеза к данным ферментам.
   
4. 
   Наиболее ценным с диагностической точки зрения при разграничении РА от других ревматических заболеваний, протекающих с суставным синдромом, является определение иммуноферментным методом с помощью иммобилизированных антигенных препаратов в сыворотке крови антител к 5'-НТ и ПНФ.
   

По теме диссертации опубликовано 73 печатные работы, из которых 47 – в центральной, 18 – в местной, 8 – в зарубежной печати, в том числе 14 работ в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук.

Материалы диссертации были представлены на ежегодных научно-практических конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2000-2008 гг.), научных конференциях НИИ КиЭР РАМН (1998-2009 гг.), симпозиумах EULAR (Стокгольм, Швеция, 2002; Берлин, Германия, 2004; Вена, Австрия, 2005; Амстердам, Нидерланды, 2006; Париж, Франция, 2008), Съезде ревматологов России (Рязань, 2001; Казань, 2005; Москва, 2009), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1996, 1998, 2000, 2001, 2003, 2005, 2007, 2008), Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2006, 2007, 2008), научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренней патологии» (Челябинск, 2001), Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии» (Москва, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в лечении и реабилитации больных с патологией суставов» (Курган, 2004), Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2004, 2005), Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006), Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2007, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007, 2008, 2009), международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007), V национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007), юбилейной ХV Международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009).

Диссертационное исследование было поддержано грантом Регионального общественного фонда содействия отечественной медицине (2005 г.) и государственным научным грантом Волгоградской области (2008 г.). Результаты проведенных исследований вошли в работу «Иммобилизированные системы биологически активных веществ в диагностике и лечении ревматических заболеваний», получившей I премию Волгоградской области в сфере науки и техники в номинации «За достижения в разработке и практическом применении новых методов и средств в здравоохранении» (2006 г.).

Результаты диссертации были апробированы на совместном заседании Ученого Совета НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 1 июня 2009 года (Протокол №4).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения Ат к ферментам АОС и ПМ у больных РЗ иммуноферментным методом с помощью иммобилизированных антигенных препаратов внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 25» г. Волгограда, государственного учреждения здравоохранения «Волгоградский областной клинический госпиталь ветеранов войн», муниципального учреждения здравоохранения «Городская больница №1 им. С.З.Фишера» г. Волжского. Материалы проведенного исследования входят в лекционный курс на кафедре госпитальной терапии Волгоградского государственного медицинского университета, а также используются на семинарах, научно-практических и клинических конференциях врачей.

Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста и состоит из введения, 11 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 54 таблицами, 44 рисунками, 5 выписками из истории болезни. Указатель литературы содержит 376 источников, в том числе 72 отечественных и 304 иностранных.