Кроме того, могут ингибироваться ферментативные реакции, например, используемые при обратной транскрипции и пцр-амплификации
жүктеу/скачать 23.97 Kb.
|
|
Introduction В клинических лабораториях хранятся большие архивы тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE), что представляет собой бесценный источник возможности длительного хранения клинических образцов, таких как биопсии опухолей и операционный материал, сохраняя морфологию тканей для патологического исследования и нуклеиновые кислоты для молекулярного анализа. Однако по мере того, как мы вступаем в эпоху молекулярной патологии и персонализированной медицины, молекулярная сохранность и качество белков и нуклеиновых кислот становятся критически важными. Таким образом, возможность надежного исследования нуклеиновых кислот из материала FFPE важна и ее также следует учитывать при процедурах фиксации тканей. В целом, экстракция нуклеиновых кислот из образцов FFPE дает материал более низкого качества по сравнению с экстракцией из свежезамороженной ткани, а обнаружение низкочастотных генетических вариантов из образцов FFPE представляет собой серьезные проблемы. Однако при молекулярном анализе сообщалось о высокой степени соответствия между парными свежезамороженными образцами и образцами FFPE. На качество и целостность нуклеиновой кислоты влияют pH фиксатора, продолжительность фиксации ткани, возраст и условия хранения блоков ткани, а также используемый метод экстракции. Формальдегид, активный компонент формалина, химически связывает нуклеиновые кислоты с окружающими белками, а также может модифицировать нуклеотиды. Следовательно, это приводит к фрагментации нуклеиновых кислот. Кроме того, могут ингибироваться ферментативные реакции, например, используемые при обратной транскрипции и ПЦР-амплификации. Более того, в результате дезаминирования цитозина в урацил возникают невоспроизводимые артефакты последовательности, которые можно ошибочно интерпретировать как мутации. Для точной идентификации и количественного определения соматических вариантов в образцах тканей FFPE необходимы надежные протоколы выделения ДНК и РНК, и это улучшит как исследования, так и рутинное клиническое лечение рака. На одном и том же образце FFPE обычно проводятся множественные анализы, такие как иммуногистохимия (ИГХ), гибридизация in situ (ISH), секвенирование по Сэнгеру и эксперименты с ПЦР. Кроме того, обнаружение вариантов на основе секвенирования ДНК или РНК становится все более важным для диагностики и принятия терапевтических решений, а высокопроизводительное секвенирование (HTS) в настоящее время внедряется в рутинную молекулярную патологию. Значительные усилия были предприняты для оптимизации методов экстракции высококачественной ДНК из образцов FFPE, и для этой конкретной цели было разработано несколько коммерческих протоколов экстракции. В большинстве этих протоколов расщепление сшитых белков и сольватация ткани FFPE выполняется в буфере для лизиса тканей, содержащем протеиназу К. Депарафинизация срезов обычно проводится с использованием ксилола или других менее токсичных органических растворителей для солюбилизации и разделения фаз. Парафин также можно диссоциировать с помощью лизирующего буфера, альтернативно в сочетании со специальными методами, такими как адаптивно-фокусированная акустика (AFA), одновременно регидратируя ткань. Также часто выполняется этап обратного сшивания формалином для повышения производительности ДНК и РНК в последующих приложениях. Текущая очистка молекул ДНК или РНК в основном основана на технологиях адсорбции диоксида кремния или технологий связывания на основе парамагнитных шариков. Различные исследования были посвящены решающему выбору метода экстракции ДНК и РНК, его влиянию на целостность нуклеиновых кислот и последующие характеристики. Они охватывают как ручные, так и автоматические системы экстракции ДНК или РНК, оценивая амплификацию с помощью ПЦР или HTS. Большие различия наблюдались как по количеству, так и по качеству. Также была описана одновременная экстракция амплифицированной ДНК и РНК. Во многих случаях количество доступного материала FFPE ограничено, и может быть сложно получить материал для нескольких анализов, таких как определение как вариантов ДНК, так и слияний (перегруппировок) РНК. В этом исследовании мы провели обширное сравнение различных протоколов экстракции нуклеиновых кислот из материала FFPE, используя восемь различных протоколов экстракции из семи наборов от трех разных коммерческих поставщиков. Это включало два протокола, в которых одновременно получали ДНК и РНК, которые ранее не сравнивались в других исследованиях. Помимо количества и качества извлеченных нуклеиновых кислот, производительность в приложениях HTS с использованием Agilent SureSelect XT (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) для обнаружения вариантов в ДНК и анализа саркомы Archer FusionPlex (ArcherDX, Боулдер, Колорадо, США) для обнаружения слияния в РНК. FFPE material and pathological examination Архивные блоки FFPE из пяти образцов саркомы были отобраны из биобанка отделения патологии Университетской больницы Осло. Приготовление блоков FFPE проводилось в соответствии со стандартными процедурами отделения патологии. Среди пяти проанализированных образцов саркомы присутствовали различные уровни клеточности, некроза, содержания опухоли и размера ткани. Все опухоли были диагностированы в соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), а клиническая информация была получена из базы данных MEDinsight в Университетской больнице Осло. В двух образцах слитые гены были обнаружены с помощью RT-PCR в соответствии со стандартным молекулярным тестированием в отделении патологии. Данные по всем блокам FFPE представлены в таблице 1. DNA and RNA extraction methods ДНК и РНК экстрагировали из срезов FFPE с использованием восьми различных протоколов из семи наборов от трех разных коммерческих поставщиков (таблица 2). Для ДНК использовали набор AllPrep DNA/RNA FFPE, набор GeneRead DNA FFPE и набор QIAamp DNA FFPE Tissue Kit от QIAGEN и набор ДНК truXTRAC FFPE от Covaris. Для РНК использовали набор AllPrep DNA/RNA FFPE и набор RNeasy FFPE от QIAGEN, набор Agencourt FormaPure от Beckman Coulter и набор truXTRAC FFPE RNA от Covaris. Для набора AllPrep DNA/RNA FFPE была проведена одновременная экстракция ДНК и РНК. Для наборов ДНК и РНК truXTRAC FFPE проводилась как раздельная, так и одновременная экстракция ДНК и РНК. Экстракцию ДНК и РНК проводили три раза на набор, за исключением наборов ДНК и РНК AllPrep DNA/RNA FFPE, FormaPure и truXTRAC FFPE, где экстракция проводилась дважды из-за ограниченности материала. ДНК и РНК были экстрагированы из одного среза FFPE толщиной 10 мкм из пяти образцов саркомы, используя в общей сложности 95 срезов. Для всех методов экстракции использовали равное количество исходного материала, а перед экстракцией рандомизировали последовательные секции FFPE для каждого блока. ДНК и РНК экстрагировали как можно скорее после секционирования, чтобы предотвратить окисление нуклеиновых кислот. Экстракция ДНК проводилась в соответствии с инструкциями производителей. Все образцы обрабатывали РНКазой и элюировали ДНК в объеме 100 мкл. Экстракция РНК проводилась в соответствии с инструкциями производителей, за некоторыми исключениями для наборов AllPrep и FormaPure, где соблюдались конкретные рекомендации ArcherDX, поскольку для HTS-анализа образцов РНК использовался анализ саркомы Archer FusionPlex от ArcherDX. Для AllPrep соблюдался протокол экстракции тотальной РНК, не включающей малые РНК, депарафинизацию проводили с использованием раствора для депарафинизации (QIA GEN), а РНК элюировали в 30 мкл воды. В случае FormaPure образцы расщеплялись протеиназой К в течение ночи вместо 60 минут, а РНК элюировалась в 40 мкл воды. В остальных методах РНК элюировали в объеме 30 мкл. Для всех протоколов РНК обработка ДНКазой не проводилась. DNA and RNA yield, integrity and amplifiability Выход ДНК и РНК измеряли с использованием наборов для анализа Qubit dsDNA BR и наборов для анализа РНК BR/HS соответственно, а также флуорометра Qubit 3.0 от Life Technologies. Значения целостности ДНК (DIN) определяли с использованием системы 2200 TapeStation с D1000 ScreenTape. Значения целостности РНК (RIN) определяли с использованием системы 2100 Bioanalyzer с набором RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Амплификацию ДНК измеряли с использованием набора для контроля качества FFPE от Illumina (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя с использованием 4 нг введенной ДНК FFPE. Амплификацию РНК измеряли с помощью анализа PreSeq QC от ArcherDX в соответствии с инструкциями производителя. По возможности в качестве входных данных использовали 50 нг РНК, но для некоторых образцов использовали все доступное количество РНК (<50 нг). КПЦР в реальном времени выполняли с использованием системы быстрой ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Шаблонный реагент для контроля качества и универсальную РНК от Ambion (Thermo Fisher Scientific) использовали параллельно, чтобы они служили контрольным образцом для ДНК и РНК соответственно. Необнаруженные образцы подвергались цензуре до Ct 45. Для каждого образца значение дельта Ct рассчитывалось путем вычитания среднего значения Ct для шаблона контроля качества из среднего значения Ct для каждого образца. DNA high-throughput sequencing Для приготовления библиотеки ДНК HTS ДНК отбирали из параллельной экстракции, что давало средние выходы для всех различных методов. Для метода экстракции truXTRAC использовали ДНК, экстрагированную одновременно с РНК. Библиотеки для ДНК HTS готовили из 1 мкг ДНК в соответствии с протоколом SureSelect XT (Agilent Technologies) с использованием специальной панели захвата 900 раковых генов SureSelect в растворе, разработанной Норвежским консорциумом по геномике рака (cancergenomics.no) (Namlos, Zaikova et al. 2017). Библиотеки секвенировали по парным концам (2×151 п.н.) на приборе HiSeq4000 (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием химического секвенирования Synthesis. Файлы BCL, созданные системой секвенирования Illumina, обрабатывались с использованием программного обеспечения Illumina Bcl2fastq (v. 2.20) для создания и демультиплексирования файлов fastq. Картирование, выравнивание, оценка качества и вызов соматических вариантов выполнялись, как описано ранее (Намлос, Зайкова и др., 2017). Рандомизированное сокращение данных на основе охвата на образец было сделано для сравнения вариантов, вызывающих все методы экстракции ДНК. Вариантный вызов осуществлялся с помощью MuTect и «Стрелки», как обычно, с использованием искусственного управления. Варианты были аннотированы и отфильтрованы в Variant Studio v2.2.1 (Illumina) с использованием фильтра популяции нормальных вариаций (база данных ExAC <1%), сохраняя экзонные варианты с частотой аллелей > 5% и охватом > 100x. Кроме того, было проведено рандомизированное сокращение данных на основе количества чтений на образец, чтобы изучить сложность различных библиотек ДНК. Доступ к данным HTS предоставляется по запросу. RNA high-throughput sequencing Для приготовления библиотеки HTS РНК РНК отбирали из параллельной экстракции, что давало средние выходы для всех различных методов. Для метода экстракции truXTRAC использовали РНК, экстрагированную одновременно с ДНК. Библиотеки для РНК HTS были созданы с помощью Archer. Анализ саркомы FusionPlex и универсальный набор реагентов для РНК Archer v2 для Illumina (ArcherDX), следуя инструкциям производителя. Для образцов SARC3 и SARC4 в качестве входных данных использовали 200 нг РНК, а для SARC5 использовали все доступное количество РНК (20–160 нг). Вкратце, сначала кДНК была синтезирована из РНК с использованием случайного прайминга, затем была выполнена репарация концов, хвостовик dA и лигирование адаптера с использованием адаптеров молекулярного штрих-кода (MBC) A13-24 для Illumina (ArcherDx). Затем были проведены два раунда ПЦР с ген-специфическими праймерами из анализа саркомы Archer FusionPlex. Конечные библиотеки были количественно оценены с использованием набора qPCR KAPA Biosystems для Illumina (KAPA Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс, США), предполагая длину фрагмента 250 п.н. Библиотеки со штрих-кодом объединяли в эквимолярных концентрациях и секвенировали с использованием системы секвенирования MiSeq от Illumina с набором реагентов MiSeq v2 300 Cycle (Illumina). Файлы Fastq из MiSeq были проанализированы с использованием биоинформатической платформы Archer Analysis 5 от ArcherDX с использованием настроек по умолчанию для анализа саркомы FusionPlex. Алгоритм обнаружения слияния основан на специфичности праймеров, специфичных для гена, используемых на этапах амплификации в процессе закрепленной мультиплексной ПЦР (AMP). Программному обеспечению требуется одно чтение, охватывающее два отдельных гена, чтобы считаться кандидатом на слияние. Archer Analysis выполняет весь вторичный анализ и многие этапы третичного анализа с аннотациями из базы данных Archer Quiver Fusion, а также из таких источников, как Ensembl VEP, Clinvar и COSMIC. Кроме того, было проведено рандомизированное уменьшение общего количества считываний для каждого образца саркомы с использованием различных методов извлечения, чтобы иметь возможность сравнить все методы при одинаковом количестве считываний и оценить влияние глубины считывания на обнаружение слияния. Снижение выборки проводилось по выборке с наименьшим общим количеством чтений (> 1,5 миллиона чтений). Доступ к данным HTS предоставляется по запросу. Statistical analysis Был проведен статистический анализ, чтобы определить, существует ли значительная разница в выходе ДНК и РНК, значениях DIN и RIN, амплифицируемости ДНК и РНК и выходе библиотек ДНК HTS и показателях контроля качества для библиотек HTS РНК, полученных с использованием различных методов экстракции. Критерий знаковых рангов Уилкоксона был выполнен с использованием медианного значения каждого образца, когда были доступны две или три повторности, и сравнения методов друг с другом. Ethics statement Проект (S-06133) был одобрен Региональным этическим комитетом Южной Норвегии, от пациентов было получено информированное письменное согласие. Results and discussion DNA and RNA yield ДНК и РНК были извлечены из одних и тех же архивных блоков FFPE из пяти образцов саркомы с использованием различных наборов для экстракции от коммерческих поставщиков, чтобы определить лучший метод экстракции для последующих приложений HTS. В предыдущих исследованиях было показано, что набор QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, набор miRNeasy FFPE и набор AllPrep DNA/RNA FFPE от QIAGEN работают лучше по сравнению с другими протоколами ДНК и РНК. Однако сравнения с другими наборами, оценивавшимися в этом исследовании, до сих пор не опубликованы. Для всех методов экстракции использовали равное количество исходного материала и рандомизированный порядок последовательных секций блока FFPE. Извлеченные ДНК и РНК были количественно оценены с использованием количественного определения на основе флуоресцентных красителей, а среднее общее количество для различных образцов и методов экстракции показано на рисунках 1A и 1B, а также в таблице S1. Для ДНК самые высокие выходы в целом были получены с использованием набора truXTRAC, хотя между образцами и отдельными экстракциями были различия. Протокол с одновременной экстракцией ДНК и РНК дал более высокие выходы ДНК, чем протокол с экстракцией только ДНК для набора truXTRAC. Набор ДНК/РНК набора truXTRAC (одновременный протокол) давал значительно более высокие выходы ДНК по сравнению с наборами AllPrep, GeneRead и QIAamp (все p = 0,043), тогда как набор truXTRAC (только ДНК) давал значительно более высокий выход ДНК по сравнению с набором GeneRead (р = 0,043). При сравнении трех наборов QIAGEN не наблюдалось существенных различий в выходе ДНК. Были различия в количестве ДНК, полученном для разных образцов: образец SARC3 дал самый высокий выход ДНК, тогда как SARC5 дал очень низкий выход по сравнению с другими образцами, что указывает на разницу в качестве блоков FFPE. Было обнаружено, что образцы SARC1 и SARC3 имели некроз >40%, но, поскольку эти образцы были особенно богаты клетками, они все же содержали достаточное количество нуклеиновых кислот для анализа. Образцы SARC2 и SARC5 имели наименьший размер ткани (табл. 1). Что касается РНК, выходы различных методов экстракции были более схожими, хотя набор FormaPure давал несколько более низкие выходы РНК, чем другие методы экстракции. Оба протокола с использованием набора truXTRAC дали значительно более высокие выходы РНК по сравнению с набором FormaPure (p = 0,043). Как также видно по количеству ДНК, образец SARC5 дал гораздо более низкий выход РНК, чем другие образцы. DNA and RNA integrity and amplifiability Целостность нуклеиновой кислоты, включая длину фрагмента и отсутствие химических модификаций, важна для успешной амплификации. Распределение длин фрагментов экстрагированных ДНК и РНК, полученных с использованием различных протоколов экстракции, показано на рисунке S1, а значения DIN и RIN показаны в таблице S1. Принимая во внимание все образцы, набор ДНК/РНК truXTRAC (одновременный протокол) дал значительно более высокие значения DIN (p = 0,04), чем все методы, кроме набора AllPrep, тогда как самая низкая целостность была получена с использованием набора GeneRead. Для РНК набор truXTRAC RNA (только протокол РНК) дал самые высокие значения RIN, значительно выше, чем наборы RNeasy и FormaPure (p = 0,04). Меньшие различия наблюдались для образцов с высокой или очень низкой целостностью нуклеиновых кислот, но выбор протокола был более важным при промежуточном качестве. Чтобы определить амплификацию выделенных ДНК и РНК, полученных с использованием различных протоколов экстракции, проводили кПЦР с использованием набора FFPE QC и анализа PreSeq QC соответственно. Средние значения дельты Ct для различных образцов и методов экстракции показаны на рис. 1C, 1D и в таблице S1. В соответствии с приведенными выше результатами, набор truXTRAC DNA/RNA (одновременный протокол) дал значительно более низкие значения дельта Ct для ДНК по сравнению с наборами AllPrep, GeneRead и QIAamp (все p = 0,04), демонстрируя лучшую амплифицируемость. Хотя в качестве входных данных для анализа контроля качества FFPE использовались равные количества ДНК, в целом, по-видимому, наблюдалась тенденция, согласно которой образцы с более высокими количествами экстрагированной ДНК давали более низкие значения дельта Ct и наоборот. Таким образом, набор ДНК/РНК truXTRAC (одновременный протокол) не только давал значительно более высокий выход ДНК, чем наборы от QIAGEN, но и ДНК лучшего качества. Для РНК показатель качества PreSeq QC учитывает как концентрацию, длину, так и сшивку. Для образца SARC5 экстракты, использованные для подготовки библиотеки секвенирования, не были включены в количественный анализ PreSeq QC из-за ограниченного количества РНК. Никаких существенных различий в значениях дельта Ct, отражающих амплификацию, между методами не наблюдалось. В отличие от ДНК, высокие выходы экстрагированной РНК не обязательно соответствовали низким значениям дельта Ct. Для образца SARC1 РНК, экстрагированная с помощью набора FormaPure, была единственной РНК, получившей значение дельта Ct, хотя полученный выход был намного ниже, чем при использовании других методов экстракции. Detection of variants in DNA samples Библиотеки ДНК HTS были созданы для четырех образцов, SARC1-4, с использованием Agilent SureSelect XT и специальной панели генов рака SureSelect в растворе 900. Качество и выход ДНК SARC5 были сочтены слишком низкими для подготовки библиотеки. Два образца, SARC1, извлеченный с помощью набора GeneRead, и SARC2, извлеченный с использованием набора AllPrep, не имели достаточного количества библиотеки для перехода к захвату. Таким образом, для двух образцов ДНК-ВТС проводили на библиотеках, представляющих только три метода экстракции ДНК, тогда как для оставшихся двух образцов были включены все четыре метода. Никаких существенных различий между методами по выходу библиотеки ДНК не наблюдалось ни для библиотек до захвата, ни для конечных библиотек, хотя методы QIAGEN показали тенденцию к большему выходу (таблицы 3 и S1). Чтобы лучше сравнить пригодность различных секвенированных библиотек для вызова соматических вариантов, было сделано рандомизированное сокращение данных, чтобы иметь возможность сравнить все методы с одинаковым охватом на образец, что дало средний охват 245-320x (таблица S1). Соматические варианты, идентифицированные для различных методов экстракции и образцов, показаны на рисунке 2, а показатели качества секвенирования приведены в таблице S1. В целом, большинство вариантов, названных MuTect и «Стрелкой», совпадали между различными методами экстракции в пределах данной выборки. Чтобы сравнить сложность различных библиотек, мы уменьшили количество операций чтения и рассчитали уровень дублирования. Никаких существенных различий между методами извлечения не наблюдалось, хотя библиотеки, созданные с помощью AllPrep, в целом показали более низкий уровень дублирования, что указывает на более разнообразную библиотеку (таблица 4). Detection of fusion genes in RNA samples Для трех образцов с известными слитыми генами SARC3-5 были созданы библиотеки для РНК HTS с использованием анализа саркомы Archer FusionPlex. Выходы библиотеки приведены в таблицах 5 и S1. Хотя существенных различий не было, библиотеки, изготовленные из РНК, выделенной из наборов ДНК/РНК FormaPure и truXTRAC (одновременная экстракция), показали тенденцию к увеличению выхода. Выход библиотеки был самым низким для образца SARC5, что отражает низкое качество этого образца. Обнаружение слияния осуществляли с использованием биоинформатической платформы Archer Analysis 5 с использованием настроек по умолчанию для анализа саркомы FusionPlex (таблицы 6 и S1). Показатели качества секвенирования приведены в таблице S1. Слияние EWSR1-NR4A3 было обнаружено в РНК, выделенной всеми методами из образца SARC4. Низкое качество образца SARC5 также отразилось в анализе, поскольку не было обнаружено патогномоничного слияния EWSR1-FLI1, что также ожидалось исходя из полученного количества и качества. Таким образом, для образцов ФФПЭ низкого качества выбор метода экстракции не оказал никакого влияния на возможность обнаружения слияний. Для образца SARC3 слияние SS18-SSX2 было обнаружено с помощью РНК, экстрагированной с использованием наборов FormaPure и truXTRAC, но не с помощью наборов AllPrep и RNeasy. Для двух экстракций, в которых слияние не было обнаружено, библиотеки были более низкого качества, о чем свидетельствует низкий процент уникальных фрагментов, обеспечивающих менее сложные библиотеки, а данные HTS не прошли фильтр контроля качества Archer (таблица S1), что отражает низкий уровень качество выделенной РНК. Чтобы лучше сравнить способность обнаружения слияния различных методов экстракции, количество чтений на образец было нормализовано путем понижения выборки в соответствии с образцом с наименьшим количеством чтений (> 1,5 миллиона чтений) для каждого образца саркомы отдельно. Затем анализ слитых генов был повторен, что дало те же результаты для обнаружения слияния, что и при включении всех прочтений (таблицы 5 и S1). Следовательно, причины отсутствия слияний в некоторых образцах не были связаны с размером чтения библиотеки. РНК, экстрагированная из набора FormaPure, дала самый высокий процент уникальных чтений и целевых чтений, за ней следовал набор truXTRAC, хотя разница была незначительной по сравнению с другими методами (таблицы 5 и S1). Это подчеркивает важность сложности библиотеки и, следовательно, качества РНК для обнаружения соматических изменений. Conclusions Различные методы экстракции ДНК и РНК, рассмотренные в этом исследовании, дали различное количество, качество и эффективность выделенных нуклеиновых кислот. Для экстракции ДНК набор ДНК truXTRAC FFPE от Covaris в целом давал более высокий выход и больше интактных фрагментов ДНК, однако не наблюдалось существенных различий в количестве библиотек, секвенировании ДНК или вызове вариантов среди различных протестированных методов экстракции. Для обнаружения транскриптов РНК из слитых генов набор РНК truXTRAC FFPE от Covaris и набор FormaPure от Beckman Coulter показали лучшие результаты при идентификации слияния, которое не было обнаружено с помощью наборов от QIAGEN. Наборы FormaPure и truXTRAC также показали самый высокий процент идентифицированных уникальных пар чтения, что обеспечивает более высокую сложность библиотек и данных HTS. Как для ДНК, так и для РНК протокол одновременной экстракции ДНК и РНК truXTRAC работал так же хорошо или даже лучше, чем отдельные протоколы truXTRAC. В целом выбор метода экстракции представляется более важным для РНК, чем для ДНК. Однако результаты показывают, что выбор оптимальной процедуры экстракции нуклеиновых кислот очень ценен и может иметь важное значение для успешного анализа HTS. жүктеу/скачать 23.97 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|