Тема Биохимические и физиологические реакции на антропогенные стрессоры

Рассматривая два организма на молекулярном уровне, принадлежащие к одному семейству или отряду, a иногда и к разным таксонам, мы видим больше сходства, чем различия. Высокая степень сходства молекулярно-клеточной организации и биохимических превращений по сравнению с более высокими уровнями организации не может не удивлять. Это удается проследить при переходе от самого низкого уровня организации живого к высшему. Заменые различия обнаруживаются даже у близкородственных видов только при переходе на более высокие уровни организации (ткань, органы, организм).

Эти соображения позволяют предположить, что ответные реакции разных организмов, относящихся к одному семейству или роду, при действии токсических веществ на молекулярном уровне не будут сильно различаться. Это в свою очередь дает возможность экстраполировать результаты, полученные в опытах с одними организмами на тканевом или организменном уровне.

1.1 Диагностическое значение биохимический и физиологических показателей;

С биоиндикацией тесно связаны динамическое равновесие и стабильность биологических систем. Экосистемы весьма стабильны. При изменении факторов среды и под влиянием стрессоров, т.е. при нагрузке, они могут переходить в другие стабильные состояния. Организмы тоже способны в определенных границах адаптироваться к измененным условиям существования. В меньшей степени это относиться к органеллам, таким как митохондрии или хлоропласты, а также к биохимическим или физиологическим реакциям. Пределы их протекания относительно узки, поэтому они весьма чувствительны к нарушениям.

На уровне организмов и экосистем воздействие стрессоров различимо благодаря появлению внешних симптомов повреждений. Например, за реакцией индикаторных растений можно проследить по возникновению определенного поврежедения (некроз, хлороз).

На клеточном и субклеточном уровнях воздействие стрессоров чаще всего скрыто от наблюдения. Как синонимы в литературе широко используются понятия «физиологические повреждения», «латентные повреждения», «тонкие повреждения». Однако при достижении определенных количественных параметров стрессора невидимые повреждения приводят к снижению продуктивности, появлению морфологической изменчивости или тератов и т. д. Если необходимо своевременно предотвратить необратимое изменение, то раннее распознавания именно этих нарушений становиться решающим, т.к. чувствительные биохимические и физиологические параметры “улавливают” очень незначительные концентрации стрессора. Кроме того, биоиндикация на биохимическом и физиологическом уровне позволяет понять механизм действия стрессоров:

- видимые симптомы какого-нибудь повреждения - результат изменений в обмене веществ растений и животных;

- точное знание механизмов действия стрессора позволяет провести раннюю диагностику нарушений;

- можно установить механизм адаптаций и предпринять защитные меры.

1.2 Регуляция обмена веществ и биоиндикация

Обмен веществ каждой живой клетки подчиняется следующим принципам:

– привязан к молекулярным и надмолекулярным структурам;

– организован по типу функциональной и структурной иерархии;

– высокоэкономичен;

– способен к саморегуляции.

Его задачи можно свести к следующим:

– поставка энергии в форме АТФ, необходимой для многочисленных реакций;

– поставка предшественников - мононуклеотидов, аминокислот, моносахаридов - для синтеза нуклеиновых кислот, белков, углеводов;

– биосинтез биомакромолекул – ферменты, гормоны, пигменты, резервные вещества.

За все процессы обмена веществ в первую очередь несут ответственность нуклеиновые кислоты (носители генетической информации) и белки (ферменты и структурные элементы). Необходимо, чтобы эти макромолекулы функционировали с соответственной скоростью.

Регуляция обмена веществ осуществляется с помощью многочисленных ферментов, поэтому наиболее чувствительные из них могут быть важными индикаторами нарушений. Стрессоры прежде всего воздействуют на активность и количество ферментов.

Для биоиндикации решающее значение имеют действия стрессоров на следующие этапы обмена веществ:

концентрация макромолекул (например, изменяется количество ферментов);

активность макромолекул (например, ферментативная) - в целом отмечается увеличение их активности при низких концентрациях загрязняющих веществ и снижение - при высоких.;

снижение энергетического баланса;

нарушение процесса фотосинтеза;

продуцирование веществ с защитными функциями (например, пролина), увеличение сахарозы и фруктозы с целью самозащиты;

преждевременное включение механизмов старения организма: характерным признаком является увеличение содержания гормонов, регулирующих созревание плодов, старение и опадение листвы и т.д. (этилен, абсцизовая кислота и др.);

Остановимся более подробно на биоиндикационных признаках молекулярного уровня

Концентрация (количество) ферментов, пигментов

а) хлорофилл - в качестве биоиндикаторного признака у растений используют уменьшение содержания хлорофилла, уменьшение соотношения хлорофиллов а и б, увеличение содержания феофитина. Снижение содержания зеленых пигментов в листьях может происходить вследствие разрушения хлорофиллов и превращения их в феофитины под влиянием стрессоров, которые воздействуют на ферменты катализирующие образование этого пигмента.

б) соотношение каротиноидов – листьях и хвое, подвергшихся действию фотоокислителей (фотохимического смога) и газодымовых выбросов двуокиси серы, содержание лютеина повышается, а бета-каротина снижается.

в) металлотионеины - процессы детоксикации некоторых тяжелых металлов у многих видов идут путем их связывания с металлотионеиновыми белками; при действии ртути в концентрации 5мкг/л на лосося было обнаружено значительное увеличение концентрации ртути в тканях; при действии ртути в концентрации 1 мкг/л подобного эффекта не наблюдалось, по-видимому, потому,

что весь металл образовывал комплексы с металлотиопеинами

г) стероиды - обнаружена достоверная корреляция между влиянием сублетальных концентраций некоторых загрязняющих веществ и концентрацией стероидных гормонов у птиц, рыб и морских млекопитающих. Сублетальные концентрации загрязняющих веществ могут повлиять на ферментные системы, ответственные за стероидогенез, который в свою очередь определяет функционирование гомеостатического механизма животных.

Ферментативная активность

За биохиическими и физиологическими реакциями на антропогенные стрессоры можно сле-дить по изменениям активности определенных ферментов. Они могут быть индикаторами нарушений обмена веществ. SO2, например, реагирует с SH - группами белка в составе фермента и разрывает их.

а) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - является ключевым ферментом прямого окисления глюкозы, реагирует повышением активности на различные виды стресса; повышение активности влечет за собой переключение на энергетически невыгодное расщепление глюкозы по пути гликолиза;

б) ферменты аминокислотного обмена также изменяют свою активность, в результате чего усиливается распад белков и снижается их синтез;

в) пероксидазы – их активность повышается в ответ на усиление образования токсичных перекисей Н2О2 под действием стрессоров; определение этой активности позволяет выявить нару-

шения обмена веществ, возникающее под действием фтористых, транспортных, содержащих двуокись серы или озон газодымовых выбросов.

г) оксигеназы со смешанной функцией - цитохром P-450 - гемопротеид, содержащийся в оксигеназных системах, можно без преувеличения отнести к универсальной молекуле. Она обнаружена у бактерий, высших растений и млекопитающих. Наряду с основными функциями цитохром; P-450 может принимать участие в метаболизме чужеродных соединений. В определенных

условиях изменение активности оксигеназы со смешанной функцией у организмов, взятых в качестве пробы из естественных популяций, может свидетельствовать о хроническом или остром загрязнении нефтепродуктами.

Показатель энергетического состояния организма позволяет оценивать количество химически связанной энергии, запасенной в пуле адениновых нуклеотидов и доступной в данный момент для метаболических процессов в организме. Энергетическое состояние клетки характеризуют с помощью “знергетического заряда”и определяется по формуле:

[ ] [ ]

э.э = [ ] [ ] [ ]

АТФ АДФ АМФ

+

+ +

Это отношение представляет собой важный контрольный критерий и меру жизнеспособности системы. Благодаря механизмам регуляции обмена система АТФ - АДФ - АМФ относительно стабильна. Установлено, что активность одних ферментов зависит от концентрации АТФ, активность других определяется концентрациями АДФ, АМФ или соотношениями АТФ/АМФ;

АТФ/АДФ. Установлено отрицательное влияние стрессоров на образование АТФ. При действии стрессора “энергетический заряд” снижается с 0,8 до 0,2: снижение его значения до 0,5-0,75 означает, что процессы потребления и аккумулирования энергии разбалансированы под влиянием неблагоприятных факторов; в стрессовых условиях значения энергетического потенциала ниже 0,5.

После удаления стрессора энергетический потенциал вновь достигает своей первоначальной величины.

Основные достоинства метода с использованием энергетического потенциала в качестве показателя воздействия загрязняющих веществ на биоту заключаются в следующем:

1. разность между значениями энергетического потенциала в нормальных и стрессовых условиях есть величина постоянная для данного организма;

2. внутривидовые различия значений энергетического потенциала очень малы, что позволяет работать с выборкой небольшого объема;

3. ответ на стрессовое воздействие может быть зарегистрирован быстрее, чем при использовании других показателей.

Фотосинтетическая активность хлоропластов связана с пигментами, поглощающими излучение с длиной волн от 400 до 700 нм. Хлорофилл обнаруживает способность к флуоресценции -спонтанному излучению света.

Эта особенность хлорофилла была предложена в качестве индикаторного признака нарушений, вызываемых у растений газодымовыми выбросами.

На рис. приведены кривые изменения флуоресценции под действием SO2 : 1 - контроль (6 мин. темновая фаза перед измерением); 2 – 30 сек. предварительного освещения; 3 - 25 млн.-1 SO2 , темновая фаза и предварительное освещение. Контроль аотчетливо демонстрирует эффекты световой и темновой фаз, которые отсутствуют у обработанной пробы. Развитие флюоресценции хлоропластов служит критерием жизнеспособности при загрязнении двуокисью серы.

Ассимиляция СО2. Под действием SО₃^2-, наблюдается торможение фотосинтетической фиксации СО₂, из-за конкурентного связывания биологически активной формой двуокиси серы ключевого фермента фотосинтеза - рибулозодифосфаткарбоксилазы (ингибирующая концентрация 3ммоль SO₃^2-.

2. Клеточный уровень

2.1 Химический состав клетки

а) аккумуляция вредных веществ - поглощаемые организмом вредные соединения могут быть либо преобразованы в ходе обмена веществ, либо включены в общий метаболизм. Однако обычно большинство элементов вредных веществ пригодно для использования лишь в небольших количествах и присутствует в незагрязненных организмах лишь в виде следов (хлор, тяжелын металлы - свинец, кадмий, цинк).

Их аккумуляция выше естественного содержания может быть использована в качестве индикационного признака для определения уровня стрессовой нагрузки. Обнаружена тесная связь между содержанием свинца в листьях растений и интенсивностью движения в городах.

б) белки и аминокислоты - уменьшение содержания растворимых белков - общий индикаторный признак; причиной является повышение их распада до аминокислот. В высших растениях белок пролин участвует в осуществлении водного баланса, эта аминокислота считается индикатором стресса, в особенности водного; после воздействия многих стрессоров количество свободного пролина увеличивается.

в) углеводы - в растениях, обработанных SO₂ , увеличивется содержание глюкозы и фруктозы, что обеспечивает механизм самозащиты растений; автомобильные выбросы и соли свинца влияют на метаболизм углеводов меньше, чем двуокись серы;

г) липиды - с ростом загрязнения газодымовыми выбросами (лес <парк <городской центр) происходят значительные изменения состава жирных кислот, которые входят в состав липидов, особенно увеличивают свою концентрацию линолевая и линоленовая кислоты; повышение концентрации этих кислот отмечено в стареющих листьях растений, поэтому нельзя исключить ускоряющее воздействие стрессоров на процессы старения; автомобильные выхлопы сильнее действуют на увеличение концентрации жирных кислот, чем двуокись серы.

а) биомембраны - Строение и состав биомембран - бимолекулярной липоидная пленка с белковыми слоями, отложенными с обеих ее сторон - обеспечивают избирательную проницаемость и направленный транспорт веществ внутрь клетки.

SO₂ диффундирует, подобно СО₂ через мембраны клеток, растворяется в воде клеточной стенки, образует ионы SO₃^2- / HSO₃, которые разрушают клеточную мембрану. Эти нарушения проявляются в повышении проницаемости, изменении рН, ферменты, связанные с мембраной,высвобождаются и переходят в другие участки.

В норме клетка предохранена от изменений рН. Поглощение SO2 и его превращение в сернистую кислоту, изменяет буферную емкость клетки, чаще всего она значительно снижается. А так как каталитические функции ферментов зависят от рН, снижение буферной емкости может привести к значительным нарушениям обмена веществ.

Подобным повреждающим эффектом для мембран клеток обладают озон, тяжелые металлы -кадмий, цинк, никель.

б) изменение внутриклеточных структур - расширение цистерн эндоплазматического ретикулума (Zn); отложение кристаллических включений в хлоропластах фасоли(Cl); грануляция цитоплазмы и разрушение хлоропластов (SO2, Cl),

в) стабильность лизосом

Лизосомы во многих отношениях являются идеальной клеточной органеллой для исследований интегрального отклика на воздействие неблагоприятных факторов среды. Лизосомный комплекс образует внутриклеточную пищеварительную систему, которая способна катаболизировать как эндогенные клеточные компоненты, так и экзогенные вещества. Считают, что в норме основной функцией лизосом является расщепление цитоплазматических компонент внутри вакуоли. В стрессовых условиях лизосомы могут перейти на гетерофагию, которая включает эндоцитоз (пиноцитоз и фагоцитоз). Таким путем может происходить внутриклеточное потребление внеклеточных веществ.

Одним из фундаментальных биохимических свойств лизосом является изоляция, обладающих огромной разрушительной силой гидролитических ферментов. При нарушении стабильности лизосом возможны активизация гидролитических ферментов и в некоторых случаях выход их в цитоплазму, приводящий к частичному или полному цитолизу. Обнаружено, что лизосомы некоторых позвоночных, моллюсков и рыб способны накапливать ароматические углеводороды, асбест, кремнезем, производные аминоазобензина, бериллит, металлические порошки и вирусы, a также ионы меди, железа, свинца, цинка, никеля, серебра, ртути и плутония. Когда накопление этих веществ в лизосомах превышало некоторый уровень, мембраны лизосом разрушались и, как следствие, наблюдалась активация н выход ферментов в цитоплазму.

г) изменения размеров клетки- уменьшение клеток эпидермиса листьев (SO₂);

д) плазмолиз - отслаивание плазмы от клеточной стенки (действие кислот и SO₂);

2.3 Хромосомные нарушения

Хроническое или случайное присутствие загрязняющих веществ антропогенного происхождения может привести, к различным нарушениям генетического плана (рисунок). Например,присутствие загрязняющих веществ может изменить состав генетического пула, что в условиях генетической изменчивости в пределах популяции приведет в результате адаптации к изменению усредненного фенотипа популяции. Загрязняющее вещество может непосредственно влиять на генетический материал или вызывать различного рода мутации. При наличии специальной системы лабораторных тестов на мутагенность генетик может определить, какие вещества, поступающие в среду, обладают мутагенными свойствами.

С учетом общих принципов биоиндикации (см. лекцию 1) любой эффект может быть использован в качестве индикаторного признака только тогда, когда соответствующий параметр системы х быстро и чувствительно реагирует на изменение какого-либо параметра среды р (воздействие стрессора), т.е. когда dx dp

Физиологические, биохимические и особенно ферментные анализы очень сложны и связаны с определенными измерительными устройствами. Далеко не в каждом случае наблюдаемая реакция может быть однозначно сопоставлена с антропогенным стрессором. Так, загрязнение воздуха четко обнаруживается лишь тогда, когда его воздействие явно превосходит влияние всех других факторов среды. Однако биоиндикация на первом уровне (см. лекцию 1) в целях ранней диагностики необходима в областях с загрязненностью от низкой до средней, где наблюдать видимые повреждения организмов еще невозможно.

1. В чем отличие по чувствительности к стрессорам биологических систем на субклеточном, клеточном, организменном и экосистемном уровне?

2. В чем состоит диагностическая ценность биоиндикации на биохимическом и физиологическом уровне?

3. В чем заключается достоинство биоиндикации на молекулярном уровне?

4. Какие основные этапы обмена веществ подвергаются воздействию стрессоров и наблюдение за которыми имеет решающее значение для биоиндикации?

5. Какие из индикационных признаков на физиолого-биохимическом уровне пригодны для ранней биоиндикации?

6. Показательные повреждения молекулярного уровня как биоиндикационные показатели,примеры.

7. Показательные повреждения клеточного уровня как биоиндикационные показатели

Еще в середине ХІХ в. были отмечены повреждения растений дымом вокруг бельгийских и английских содовых фабрик.

В ряде стран морфологические индикаторы используются в национальной системе мониторинга уже более 25 лет. С помощью методов биоиндикации, основанных на морфологии растений, получена большая часть картосхем антропогенного влияния.

Одним из широко применяемых методов экологической оценки состояния окружающей среды является анализ особенностей морфологического строения биологических объектов. Накопление поллютантов в организме, нарушения метаболизма, приводят к изменению строения тканей, органов и в целом к модификации диагностических признаков видов.

При оценке экологического состояния окружающей среды по морфологическим отклонениям в качестве индикаторов должны быть выбраны наиболее чувствительные виды, обладающие хорошо выраженными, яркими и легко распознаваемыми реакциями на определенное антропогенное воздействие. Чувствительность живых организмов к поллютантам зависит от генетической структуры, стадии развития, условий внешней среды, концентрации поллютанта и меняется в течение вегетационного сезона в зависимости от возраста особи.

На практике осуществляется основной подход к изучению таких отклонений – это детальный визуальный подход, который включает в себя изучение анатомо-морфологических признаков.

Изучение анатомо-морфологических признаков, не требующее больших материальных затрат,имеет особое практическое значение для экспресс-оценки интенсивности техногенного воздействия на экосистемы. В качестве индикаторных признаков эффективно применение морфологических показателей: высоты растений, длины и ширины листьев, междоузлий и т. д. У древесных видов возможно изучение таких морфологических признаков, как высота стволов, высота прикрепления кроны, первой живой ветви, высота отслаивающейся корки, состояние и разреженность кроны, суховершинность и др. Возможность количественной оценки перечисленных параметров при сравнительном анализе фоновых и антропогенно нарушенных территорий с применением аппарата математической статистики повышает надежность и достоверность прогноза антропогенных сукцессии и выводов о современном состоянии экосистем.

Возникновение уродливых форм (тератов), появление хлороза и некроза являются крайней формой проявления стрессового воздействия. Но такие яркие отклонения в развитии организма являются лишь качественными признаками стрессовой ситуации и не дают представления об интенсивности воздействия или частоте стресса. Переход к количественной характеристике достигается за счет использования бонитировочных шкал некрозов, хлорозов или, например, шкалы продолжительности жизни хвои (листвы) древесных пород. Интенсивность воздействия диагностируется степенью поражения (% покрытия) листьев хлорозом или некрозом, представленной в виде соответствующих классов. Морфологические показатели древостоя могут свидетельствовать об ухудшении среды обитания в результате нарушений и (или) загрязнений. Такие показатели, как высота, диаметр, сомкнутость, среднее расстояние между деревьями, высота мертвой отторгнутой корки, высота прикрепления кроны, суховершинность, наличие сухостоя и пней, сравниваются с соответствующими фоновыми характеристиками. Их изменения по сравнению с фоновыми значениями свидетельствуют о неблагоприятных условиях местообитания древесных видов.

Для отбора показателей биоиндикации на тканевом и организменном уровне предлагаются такие критерии:

1. наличие данных, показывающих связь заболевания с загрязнением;

2. изменчивость аномалии в зависимости от места, сезона, a также возраста и размера организма;

3. легкость и точность измерения аномалии;

4. относительная устойчивость аномалии;

5. затраты времени и стоимость получения данных;

6. соответствие специфичности аномалии и загрязнения;

7. виды, для которых характерна данная аномалия;

8. наличие данных о биологии и экологии используемых видов

Таким образом, при биоиндикации на тканевом уровне используются следующие признаки:

1) отмирание тканей – некроз;

2) преждевременное увядание и опадание листвы (дефолиация);

3) патологические отклонения у животных

2. Тканевой уровень