Левшина Наталья Николаевна заведующая микробиологической лабораторией мгцгэ м инск 2008 глава 1 область применения настоящая инструкция

УТВЕРЖДАЮ

Первый заместитель Министра

_______________Р.А. Часнойть

«____»_______________200 г.

Регистрационный №________

ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТ В ЛАБОРАТОРИЯХ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

Инструкция по применению

Учреждения-разработчики: государственное учреждение образования «Белорусская медицинская академия последипломного образования» (БелМАПО)

Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр «Мать и дитя» (РНПЦ «Мать и дитя»)

Государственное учреждение «Минский городской центр гигиены и эпидемиологии» (ГЦГЭ)

Авторы:

Костюк Светлана Андреевна – кандидат медицинских наук, доцент кафедры эпидемиологии и микробиологии

Тонко Оксана Владимировна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры эпидемиологии и микробиологии

Сергейчик Наталья Леонидовна - кандидат медицинских наук, заведующая клинико-диагностической лаборатории РНПЦ «Мать и дитя»

Левшина Наталья Николаевна – заведующая микробиологической лабораторией МГЦГЭ


Минск- 2008
ГЛАВА 1

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

1.Настоящая Инструкция по применению устанавливает санитарно-гигиенические и противоэпидемические требования к устройству, оборудованию и эксплуатации клинико-диагностических лабораторий системы здравоохранения, использующих метод полимеразной цепной реакции, далее - ПЦР, в различных модификациях. Соблюдение данных требований позволит снизить риск контаминации, получения ложноположительных результатов и обеспечить получение достоверных результатов ПЦР-исследований.
ГЛАВА 2

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

2. Перечень оборудования и материалов необходимых для выполнения ПЦР исследований: амплификатор (термоциклер); микротермостат для пробирок типа «eppendorf»; микроцентрифуги-вортексы; фотометр-флуориметр; высокоскоростная микроцентрифуга; ПЦР –бокс; колба-ловушка; генетический анализатор (секвенатор); камера для горизонтального электрофореза; источник тока для создания напряжения в камере электрофореза; набор автоматических пипеток переменного объема; халат и одноразовые резиновые перчатки, сменная обувь; одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки с плотно закрывающимися крышками объемом 1,5 мл и 0,5 мл; штативы для микропробирок и наконечников; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 0,5 мкл и до 1000 мкл; одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 0,5 и до 1000 мкл; холодильники с рабочей температурой 6+2ºC, морозильная камера; емкости с дезинфицирующим раствором; реактивы для проведения полимеразной цепной реакции (экстракция нуклеиновых кислот, амплификации и идентификации результатов).
ГЛАВА 3

ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ПЦР

3. Экстракция нуклеиновых кислот - основной принцип экстракции состоит в выделении дезоксинуклеиновой кислоты(рибонуклеиновой кислоты), далее – ДНК(РНК), присутствующей в образце, и дальнейшей одновременной или последующей очистке ДНК/РНК от ингибиторов ПЦР.

4. Проведение ПЦР (амплификация искомого участка ДНК) - представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификации) специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы), дезоксинуклеотидфосфатов – дезоксиаденинтрифосфаты, дезокситиминтрифосфаты, дезоксигуанинтрифосфаты, дезоксицитозинтрифосфаты (далее - дАТФ, дТТФ, дГТР и дЦТР), солевого буфера и нуклеотидных праймеров, определяющих границы синтезируемого участка. В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов, протекающих в различных температурных режимах.

Этап 1. Денатурация ДНК - расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК при температуре 93-95⁰С в течение 30-40 сек.

Этап 2. Отжиг - присоединение праймеров, образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК) при температуре 50-65⁰С в течение 20-60 сек.

Этап 3. Элонгация – синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих цепей ДНК) при температуре 70-72⁰С в течение 20-40 сек.

5. Детекция продуктов ПЦР

5.1. Детекция амлифицированной ДНК методом гель-электрофореза в агарозном геле - метод основан на разделении молекул ДНК по размеру в присутствии бромистого этидия под действием электрического поля – открытая система.

5.2. Гибридизационный метод детекции - метод основан на гибридизации синтезированного фрагмента ДНК со специфическим нуклеотидным зондом. Данный метод в зависимости от особенностей диагностический систем может быть открытой или закрытой системой.

5.3 Детекция амлифицированной ДНК в режиме реального времени - данный метод детекции основан на взаимодействии флуоресцентно-меченых зондов, добавляемых в ПЦР-смесь, со специфическими продуктами амплификации и является закрытой системой.

ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТ В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЙ

6. Случайное загрязнение исследуемых проб нуклеиновыми кислотами или их амплификационными фрагментами (контаминация исходной ДНК или продуктами ПЦР) может происходить в результате воздействия пыли и аэрозолей. Вследствие этого, организация рабочей зоны в лаборатории основывается на системной локализации по месту этапов метода, вовлеченных в получение результатов, и на принципе «поточности».

7. Для предупреждения контаминации необходимо территориально разделить различные этапы ПЦР-анализа и разместить их в отдельных помещениях:

помещение для пробоподготовки (обработка клинического материала и выделение ДНК(РНК) - пре-ПЦР;

помещение для постановки реакции амплификации (подготовка реакционной смеси и постановка амплификации) - ПЦР-зона;

помещение для анализа результатов (детекция продуктов амплификации) – пост-ПЦР.

Проведение других видов работ в данных помещениях лаборатории запрещается.

8. Планировка и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Не допускается движение воздушных потоков из помещений пост-ПЦР в пре-ПЦР и ПЦР- помещения.

9. Помещения на всех этапах ПЦР-анализа должны быть оборудованы бактерицидными лампами из расчета 2,5 Вт/м³.

10. Для ежедневной уборки каждого из помещений необходимо использовать отдельный уборочный инвентарь.

Генеральная уборка помещений проводится один раз в неделю в три этапа с использованием растворов дезинфицирующих средств, разрешенных Министерством здравоохранения Республики Беларусь в концентрациях, согласно инструкции по их применению: на первом этапе с использованием щелочесодержащего моющего дезинфектанта, на втором – кислотосодержащего моющего дезинфектанта, на третьем этапе - закрепляющего дезинфектанта без моющего эффекта. Обязательным является последующее ультрафиолетовое облучение в течение 2 часов.

11. Для каждой стадии ПЦР-анализа следует использовать свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, расходных материалов, оборудования и холодильников. Чтобы исключить контаминацию переносное оборудование в каждой рабочей зоне должно быть промаркировано.Перенос оборудования, автоматических пипеток и лабораторной одежды из одного помещения в другое запрещен.

12. Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует обрабатывать после работы спиртосодержащим дезинфицирующим раствором с последующим облучением ультрафиолетом в течение 1 часа с максимумом излучения в области 260 нм. Обработка одежды из различных помещений должна проводиться отдельно.

13. Работа на всех этапах должна проводиться только с использованием одноразовых расходных материалов (пробирок, наконечников для автоматических пипеток, перчаток).

При переходе от пробы к пробе наконечники должны использоваться однократно. Использованные пробирки и наконечники подлежат дезинфекции, они должны сбрасываться в специальные контейнеры или емкости, содержащие дезинфицирующий раствор, разрешенный Министерством здравоохранения Республики Беларусь как вирулицидное средство в концентрациях, согласно инструкции по его применению.

Отработанные наконечники, пробирки, прошедшие этап дезинфекции, подлежат последующей утилизации в соответствующими нормативными документами Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

14. Подготовка пробы и выделение ДНК(РНК):

проводится в зоне пре-ПЦР. Выделение ДНК/РНК из клинического материала или продовольственных продуктов и продовольственного сырья, кормов следует проводить в специальных ПЦР-боксах, имеющих встроенные бактерицидные лампы;

рабочие поверхности и оборудование следует обрабатывать спиртосодержащим дезинфицирующим раствором до начала и после проведения исследований. Облучение помещения пре-ПЦР необходимо проводить ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы;

для контроля за контаминацией объектов внешней среды продуктами амплификации следует 1 раз в неделю проводить смывы с рабочих поверхностей пре-ПЦР зоны с последующей постановкой ПЦР анализа на наличие в них ампликонов определяемых микроорганизмов.

15.Амплификация ДНК:

проводится в помещении ПЦР-зоны. Приготовление амплификационной смеси необходимо проводить в специальных ПЦР-боксах, имеющих встроенные бактерицидные лампы;

помещение ПЦР-зоны необходимо подвергать облучению ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм в течение 2 часа до начала работы и в течение 2 часа после окончания работы для инактивации продуктов амплификации. Рабочую поверхность ПЦР-бокса также следует подвергать облучению встроенной бактерицидной лампой в течение 2 часа до начала работы и в течение 2 часа после окончания работы;

для контроля контаминации продуктами амплификации следует 1 раз в неделю проводить смывы с рабочих поверхностей данной зоны (поверхности рабочих столов, ручки дверей, подоконники) для выполнения последующего ПЦР анализа в данных смывах на наличие ампликонов определяемых микроорганизмов или генетически модифицированных соединений.

16.Детекция и идентификация результатов ПЦР исследований:

проводится в помещении для детекции и анализа результатов - пост-ПЦР;

для инактивации продуктов амплификации, попавших в окружающую среду, следует проводить облучение помещения пост-ПЦР ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм в течение 2 часа до начала работы и в течение 2 часа после окончания выполнения исследований.

17. Особенности организации ПЦР-лабораторий, выполняющих небольшой объем исследований (не более 38 исследований в день), и использующих электрофоретическую или открытую гибридизационную детекцию амплифицированной ДНК:

при организации ПЦР-лабораторий с малым количеством проводимых исследований (не более 38 исследований в день), использующих для детекции амплифицированной ДНК гель-электрофорез или методику открытой гибридизации, допускается объединение пре-ПЦР и ПЦР-помещений в одно при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической безопасности) – для выделения нуклеиновых кислот и постановки реакции амплификации;

запрещается проведение одновременно нескольких этапов ПЦР-анализа (например, пробоподготовка и электрофорез, постановка реакции амплификации и электрофорез) одним сотрудником в течение рабочего дня;

рекомендуемый штатный состав данной лаборатории приведен в приложении 1 к настоящей инструкции.

18. Особенности организации ПЦР-лабораторий с большой загруженностью (более 38 исследований в день), и использующих электрофоретическую или открытую гибридизационную детекцию амплифицированной ДНК:

при организации ПЦР-лабораторий с большой загруженностью (количество исследований превышает 38 исследований в день), использующих гель-электрофорез или методику открытой гибридизации для детекции продуктов амплификации, вследствие высокого риска контаминации запрещается объединение пре-ПЦР и ПЦР-помещений в одно, в том числе, при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов;

каждый этап постановки ПЦР-анализа осуществляется отдельным сотрудником и их замена (переход из пре-ПЦР в ПЦР- или пост-ПЦР помещения) в течение дня запрещена;

данные требования распространяются также на организацию ПЦР-лабораторий, проводящие секвенирование продуктов ПЦР. При этом в случае необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и сиквенс анализа, следует выделить в отдельное помещение в пост-ПЦР-зоне для проведения секвенирования;

рекомендуемый штатный состав данной лаборатории приведен в приложении 1 к настоящей инструкции.

19. Особенности организации ПЦР-лабораторий, выполняющих небольшой объем исследований (менее 38 исследований в день), и использующих гибридизационную схему детекции, детекцию амплифицированной ДНК в режиме реального времени (или закрытую гибридизационную детекцию):

при организации ПЦР-лабораторий, проводящих ПЦР-исследования с использованием закрытой гибридизационной детекции и в режиме реального времени (с учетом малой загруженности лаборатории – менее 38 исследований в день) допускается совмещение всех трех (пре-ПЦР, ПЦР-, и пост-ПЦР) помещений для проведения ПЦР-анализа в одно при условии наличия в нем отдельных ПЦР-боксов – для выделения нуклеиновых кислот и постановки реакции амплификации;

рекомендуемый штатный состав данной лаборатории приведен в приложении 1 к настоящей инструкции.

20. Особенности организации ПЦР-лабораторий с большой загруженностью (более 38 исследований в день), и использующих гибридизационную схему детекцию амплифицированной ДНК, детекцию в режиме реального времени (или закрытую гибридизационную детекцию):

при организации ПЦР-лабораторий с большой загруженностью (количество исследований превышает 38 исследований в день), использующих закрытую гибридизационную систему или организующих проведение ПЦР-исследований в режиме реального времени для детекции продуктов амплификации,

объединение пре-ПЦР и ПЦР-помещений в одно даже при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов является недопустимым вследствие высокого риска контаминации;

при необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа, а также метода детекции продуктов амплификации в режиме реального времени, следует выделить в пост-ПЦР помещении отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного/в режиме реального времени анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне;

рекомендуемый штатный состав данной лаборатории приведен в приложении 1 к настоящей инструкции.

ГЛАВА 5

25. 
    Транспортировка пробирок с биологическим материалом при температуре внешней среды без контейнеров. Транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах. Каждый образец, для исключения взаимной контаминации, хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете.
    

27. Появление неспецифических продуктов амплификации при их детекции методом электрофореза: дополнительные полосы, «шмеры» согласно рисунку 3 приложения 2 к настоящей инструкции по применению. Появление в дорожках неспецифических полос на разных уровнях свидетельствует о неверном температурном режиме в ячейках амплификатора, или об отсутствии «горячего старта». При этом необходимо отрегулировать температурный режим в ячейках амплификатора и использовать «горячий старт» до начала циклов амплификации.

28. Отсутствие в пробе полос внутреннего контроля и специфического фрагмента амплификации ДНК, согласно рисунку 4 приложения 2 к настоящей инструкции по применению, свидетельствует об ошибке в процедуре подготовки клинического материала, а результаты, полученные по данной пробе, считаются недействительными. Требуется повторить анализ пробы, начиная с этапа выделения.
ГЛАВА 6

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ

Противопоказаний к применению ПЦР метода не имеется.
Приложение 2

к Инструкции по применению

«Организация работ в лабораториях,

использующих метод полимеразной цепной реакции»

К+ клинические образцы К-

Рис.3. Основные артефакты ПЦР, возникающие при контаминации.

1 слайд. Отсутствие контаминации.

2 слайд. Появление дополнительных полос

3 слайд. Появление «шмеров».

Рис.4. Основные артефакты ПЦР:

1. 
   – отсутствие внутреннего контрольного образца,
   
2. 
   – наличие «шмеров»,
   
3. 
   – наличие неспецифических продуктов амплификации.
   

к Инструкции по применению

«Организация работ в лабораториях,

использующих метод полимеразной цепной реакции»

в зависимости от вида детекции результатов и объема проводимых исследований