Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология»

1. 
   Преимущества выращивания вирусов в культуре клеток.
   
2. 
   Особенности культивирования вирусов гриппа.
   
3. 
   Основные методики изготовления вакцин против гриппа.
   
4. 
   Трудности в создании вакцин против вируса иммунодефицита человека.
   

1. 
   Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982.
   
2. 
   Букринская А.Г. Вирусология. – М.: Медицина, 1986.
   
3. 
   Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.
   
4. 
   Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. – 4-е изд. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. Электронный учебник.
   
5. 
   Общая медицинская вирусология / Н.С. Горячкина и др.; под ред. Н.С. Горячкиной, Л.И. Кафарской. – Ростов н/Д: Феникс, 2007.
   
6. 
   Общая микробиология: Лабораторный практикум. – Изд. 2-е, перераб., доп. – Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2005.
   
7. 
   www.medmaster.net
   
8. 
   http://dronel.genebee.msu.su/journals/ microb-r.html
   

1. 
   Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах
   

• 
  Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) – возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений (литическая инфекция);
  
• 
  Приобретение заражённой культурой клеток способности к гемадсорбции – к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя;
  
• 
  Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек, являющихся «негативными колониями» вирусов;
  
• 
  Подавление процессов метаболизма в заражённой вирусом культуре клеток, выявляемое с помощью так называемой цветной пробы.
  

Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет.

При острой вирусной инфекции может наблюдаться образование гигантских многоядерных клеток – симпластов (или синцитиев). Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты: лецитиназу, нейраминидазу, и богатых липидами (напр., парамиксовирусы).

Рис. 5. Проявление ЦПД в культуре клеток

К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37⁰С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более).

ЦПД различных вирусов на клеточные культуры обладает определённой специфичностью. Родственные вирусы дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус:

- энтеровирусы (вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО) вызывают однородную мелкозернистую деструкцию клеток;

- аденовирусы превращают клеточный слой в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда;

- парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита образуют симпласты.

Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине заражённых культур. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД₅₀) в 1 мл. За одну ЦПД₅₀ принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведённого до титра.

Для идентификации выделенного вируса по нейтрализации ЦПД культуральную жидкость смешивают с равным объёмом диагностической иммунной сыворотки (разведение сыворотки 1:5 или 1:10). После 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Опыт сопровождается несколькими контролями:

1 – контроль незаражённой культуры;

2 – контроль дозы вируса – клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте;

3 – контроль культуры, заражённой смесью культуральной жидкости с нормально сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем – обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

Гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы: орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы. Эти же вирусы обладают спосодностью вызывать гемагглютинацию – склеивание эритроцитов. Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 (I) группы. По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно.

Рис. 6. Реакция гемадсорбции

Техника постановки реакции гемадсорбции

Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с заражённой культурой вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависит от вида вируса. Пробирки встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания неадсорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малом увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.

При добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.

2.1.3. Метод бляшек

Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель – нейтральный красный. ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен.

Рис. 7. Метод бляшек

Агаровое покрытие готовят из высококачественного агара в концентрации 1-1,5% и других компонентов – солевых буферных растворов, дополнительных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учёта опыта. Часто вместо агара используют гель бентионита (5-6%) – это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток.

Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек

Для получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают. Заражение производят путём внесения разведённого исследуемого материала в объёме 0,1-0,25 мл и равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с помощью покачивания. Через 30-60 минут заражённую культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашеи с застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после чего производят их подсчёт и изучение.

Разные вирусы образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краёв, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса.

Для титрования вирусов готовят серийные разведения вируссодержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учётом разведения вируса), вычисляют титр вируса – количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Метод бляшек даёт возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается.

2.1.4. Цветная проба

Цветная проба (или цветная реакция) основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4 – 7,6), вследствие снижения рН до 7,0 – 6,8 приобретает жёлтый цвет.

Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета.

С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.

При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.

Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки.

При оценке результатов реакции учитывают два тона: жёлтый и красный (табл. 3).

При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 37⁰С после чего по изменению цвета учитывают реакцию.

Титром вируса по цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10^-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД₅₀) вируса.

Таблица 3

Схема титрования вируса методом цветной пробы

Ингредиенты опыта (в мл)	№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Разведения вируссодержащего материала						Контроль клеток
	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	1 доза	½ доза	¼ доза
Вируссодержащий материал	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	-	-
Взвесь клеток (1 доза)	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Питательная среда	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5	0,5	0,5
Вазелиновое масло	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Возможные результаты
Цвет среды в пробирках (красный или жёлтый)	К-4	К-4	К-3 Ж-1	К-2 титр Ж-2	К-1 Ж-3	Ж-4	Ж-4	Ж-2 К-2	К-4
Обозначения:	К-4 – красного цвета 4 пробирки; Ж-3 – жёлтого цвета 3 пробирки

2. 
   Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов
   

Гемагглютинация, вызываемая вирусами, не является иммунологической реакцией, так как здесь нет системы антиген – антитело. С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико- или липопротеидами.

В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов. На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться. Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов.

При постановке РГА используют те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур). Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах. Для снятия ингибиторного действия вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.

На плексигласовой доске готовят двукратные возрастающие разведения в объёме 0,5 мл исследуемого вируссодержащего материала , начиная с 1:10 и до 1:1280. в луночки с разведениями добавляют равные объёмы 1% взвеси эритроцитов кур. Доску осторожно встряхивают и оставляют на 30-45 мин при комнатной температуре. Учёт результатов проводят по трёхкрестовой системе в зависимости от внешнего вида осадка эритроцитов. При гемагглютинации на «+++» осадок имеет форму зонтика и занимает всё дно лунки. При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.

Титром вируса называется то наибольшее его разведение, при котором ещё наблюдается выраженная гемагглютинация («+++» или «++»). В нашем примере титр вируса 1:320 (табл. 4). Количественное содержание вируса в разведении, равном титру, называется гемагглютинирующей единицей (содержится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой величины необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие единицы.

Таблица 4

Схема постановки реакции гемагглютинации при диагностике гриппа

Ингре- диенты РГА (в мл)	Номера лунок разведения вируссодержащего материала
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	К
Вирус- содержащий материал	0,1	0,5						0,5 вылить
Физиоло- гический раствор	0,9	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
1% взвесь эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Возможный результат	+++	+++	+++	+++	+++	++ титр	+	-	-

Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующей сывороткой и потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию. Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использована для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке, а также для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам.

Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов. РТГА ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА.

2.2.2. Техника постановки РТГА

РТГА с целью идентификации вируса гриппа рода А. На плексигласовой доске готовят три ряда двукратных возрастающих разведений (в объёме 0,25 мл) диагностических противогриппозных сывороток А(Н1N1), А(Н2N2) и А(Н3N2) от 1:10 до 1:320 (до титра сывороток). Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0,25 мл рабочей дозы вируса (разведение 1:40), в котором содержится 4 гемагглютинирующие единицы (табл. 5). После выдерживания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре во все лунки добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур. Учёт результатов проводят через 30-40 минут. В примере торможение произошло сывороткой А(Н3N2), следовательно выделен вирус гриппа, принадлежащий к подтипу А(Н3N2).

Таблица 5

Схема постановки РТГА для определения типовой принадлежности

вируса гриппа А

Ингредиенты РТГА в мл	Номера лунок, разведения иммунной сыворотки
	1	2	3	4	5	6	7
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	Контр.
Диагностические противогриппозные сыворотки в разведении 1:5	0,25	0,25	0,25			0,25 вылить
Физиологический раствор		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5
Вируссодержащая аллантоисная жидкость в разведении 1:40	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-
Взвесь эритроцитов кур 1%	Выдерживание 1 час при комнатной температуре
	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Возможный результат Диагности- А(Н1N1) +++ +++ +++ +++ +++ ++ - ческие А(Н2N2) +++ +++ +++ +++ +++ +++ - сыворотки А(Н3N2) - - - - - ++ - (нейтрализация)

РТГА ставят и для определения наличия и титра антител в сыворотке больного. Для этого готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в объёме 0,25 мл и соединяют их с 0,25 мл известного антигена (содержащего 4 гемагглютинирующие единицы), чтобы произошла нейтрализация вируса. Затем в пробирки вносят по 0,5 мл взвеси эритроцитов. За титр сыворотки принимают то наибольшее её разведение, в котором ещё наблюдается торможение гемагглютинации (1:160).

2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo

Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая:

1. 
   предварительный контакт вируссодержащего материала с соответствующей иммунной сывороткой (один из этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется);
   
2. 
   введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам);
   
3. 
   учёт наличия или отсутствия нейтрализации.
   

Антигены (вируссодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей заражённых вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.

Биологические объекты выбирают с учётом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования.

Постановка реакции нейтрализации (I вариант)

Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37⁰С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов.

За заражёнными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учёт реакции проводят путём сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50%-ную смертельную дозу – LD₅₀, проводя подсчёт по Риду и Менчу. Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:

Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой

ИН = --------------------------------------------------------------------

Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой

ИН менее 10 – отрицательный;

ИН – 11-49 – сомнительный;

ИН равный 50 и выше – положительный.

Заражённые эмбрионы инкубируют при температуре 35-37⁰С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки.

Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD₅₀ вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.

При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее её разведение, которое ещё способно задержать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов.
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций

К таким методам относятся молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция, которые позволяют обнаружить присутствие в исследуемом материале даже единичных копий генов определяемых вирусов (ДНК или РНК с определённой нуклеотидной последовательностью), и тем самым доказать наличие соответствующей инфекции.

Метод основан на способности двухспиральной ДНК к денатурации и ренатурации. Денатурация – это расхождение цепей при нагревании ДНК до 80-100⁰С или обработке её щёлочью. Ренатурация – воссоединение цепей с помощью водородных связей при снижении температуры до 40-60⁰С (отжиг) и приобретение ДНК первоначальной двухспиральной структуры. Разъединённые цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других односпиральных ДНК, имеющих комплементарные участки расположения нуклеотидов. К гибридизации комплементарных нитей способна также РНК, образуя комплексы ДНК – РНК или РНК – ДНК.

Необходимые для молекулярной гибридизации фрагменты ДНК или РНК, с помощью которых выявляют наличие в исследуемом материале комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, называются молекулярными зондами. Молекулярные зонды готовят из нуклеиновых кислот, выделенных из различных вирусов, иногда используют вирусную и-РНК, но чаще зондом служит клонированная рекомбинантная ДНК. Имеются наборы молекулярных зондов для определения многих вирусов.

При постановке реакции молекулярной гибридизации зонды метят радиоактивной (Р₃₂), флюоресцентной или биотиновой меткой, соединяют с исследуемым материалом, содержащим определяемую нуклеиновую кислоту, подвергающуюся денатурации. Если зонд комплементарен цепи определяемой нуклеиновой кислоты, происходит гибридизация в комплементарном участке.

После отжига зонд оказывается включённым в ренатурированную нуклеиновую кислоту и может быть обнаружен по имеющейся метке. Выявление наступившей молекулярной гибридизации позволяет установить природу определяемого вируса. Чувствительность этого метода составляет 10^-14 г/мл.

2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная

амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)

ПЦР, как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарности цепей ДНК. Важным принципом реакции является использование термостабильной ДНК-полимеразы, при участии которой происходит амплификация – умножение определяемых генов или фрагментов с определённой нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Чувствительность этой реакции составляет 10^-18 г/мл.

В реакции участвуют следующие ингредиенты:

• 
  определяемая ДНК вирусов в испытуемом биологическом материале, который предварительно концентрируется;
  
• 
  праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) – короткие цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью комплементарной 3^,-концам каждой из двух цепей определяемой ДНК. Праймеры получают из нуклеиновых кислот различных вирусов, их нуклеотидную последовательность определяют методом секвенирования;
  
• 
  свободные нуклеитиды (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 4-х типов с различными азотистыми основаниями) – необходимый материал для осуществления амплификации;
  
• 
  фермент термостабильная ДНК-полимераза – производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Фермент выделяют из бактерий Thermus aquaticus или получают генно-инженерным методом.
  

В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается, то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 25-40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов.

ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амплификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации – денатурации ДНК, отжига и достройки – необходима инкубация образцов при различном температурном режиме.

1. 
   Денатурация – разъединение определяемой двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90-95⁰С в течение 0,5-1,0 мин.
   
2. 
   Отжиг – восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера – проводится при температуре 40-60⁰С 0,5 мин.
   
3. 
   Удлинение (элонгация) – достройка каждой цепи определяемой ДНК доисходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК-полимеразы – проводится при температуре 70-75⁰С в течение 2-5 мин.
   

С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК-вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскриптазу). ПЦР особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекции.

Рис. 8. Схема полимеразной цепной реакции

1. 
   Индикация вируса по его цитопатическим действиям (ЦПД) и определение титра вируса. Идентификация вируса по нейтрализации ЦПД.
   
2. 
   Метод гемадсорбции, его практическое применение, идентификация вируса в реакции задержки гемадсорбции.
   
3. 
   Метод бляшек. Идентификация вирусов методом бляшек, титрование антител.
   
4. 
   Метод цветной пробы, методика постановки, практическое применение.
   
5. 
   Реакция нейтрализации по цветной пробе, её сущность, применение.
   
6. 
   Реакция гемагглютинации (РГА), вызываемая вирусами. Практическое применение РГА. Методика постановки.
   
7. 
   Сущность реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Методика постановки. Практическое применение.
   
8. 
   Реакция нейтрализации вирусов in vivo, способы постановки. Практическое применение.
   
9. 
   Молекулярно-генетические методы исследования, их сущность. Принцип метода молекулярной гибридизации.
   
10. 
    Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Ингредиенты реакции, их характеристика, значение амплификации. Сущность ПЦР.
    
11. 
    Техника постановки ПЦР, практическое применение и оценка, как экспресс-метода диагностики вирусных инфекций.
    

1. 
   Современные методы диагностики распространённых вирусных инфекций.
   
2. 
   Индикация и идентификация вирусов гриппа.
   
3. 
   Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов.
   
4. 
   Молекулярно-генетические методы анализа экспрессии генов.
   

1. 
   Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982.
   
2. 
   Большой словарь медицинских терминов / Сост. Федотов В.Д. – М.: ЗАО Центрполиграф, 2007.
   
3. 
   Вирусология. Методы / Под ред. Б. Мейхи. – М.: Мир, 1988.
   
4. 
   Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003.
   
5. 
   Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.
   
6. 
   ПЦР «в реальном времени» / Под ред. Д.В. Ребрикова; 2-е изд., испр. И доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.
   
7. 
   Филдс Б., Найп Д. Вирусология. Т. 1-3. – М.: «Мир», 1989.
   
8. 
   www. infections.ru/rus/all/mvb journals.shtml
   
9. 
   www.blackwellmedstudent.com
   
10. 
    www.medmaster.net
    

СОДЕРЖАНИЕ

Раздел 1. Культивирование вирусов ……………………………………………4

1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований…………….4

1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории…………………....4

1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях…………….........5

1.1.3. Обработка вируссодержащего материала………………………………5

1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии…………….6

1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения………………..9

1.2.1. Питательные среды…………………………………………………….11

1.2.2. Типы клеточных культур………………………………………………12

1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах……...16

1.3.1. Строение куриного эмбриона………………………………………….17

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку....18

1.3.3. Заражение в аллантоисную полость……………………………...........20

1.3.4. Заражение в полость амниона………………………………………….20

1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных…22

1.4.1. Интраназальное заражение………………….……………………….....23

1.4.2. Интрацеребральное заражение…………………………………............24

Контрольные вопросы………………………………………………………..….25

Тематика докладов……………………………………………………………….25

Литература………………………………………………………………………..25

Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов………………………………26

2.1. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах..26

2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток…….......27

2.1.2. Реакция гемадсорбции…………………………………………………29

2.1.3. Метод бляшек…………………………………………………………..30

2.1.4. Цветная проба…………………………………………………………..32

2.2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции

торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических

моделей для индикации и идентификации вирусов……………………...35

2.2.1. Техника постановки РГА………………………………………………36

2.2.2. Техника постановки РТГА……………………………………………..37

2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo………………………………39

2.3. Молекулярно-генетические методы исследования

в диагностике вирусных инфекций……………………………………..41

2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)………42

2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная

амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)……………………...........43

Контрольные вопросы ………………………………………………………...45

Тематика докладов……………………………………………………………...46