Визначення кількісного вмісту біологічно активних речовин в бузині чорній та бузині трав’янистій

Дана частина роботи була проведена з метою порівняння двох основних представників одного роду, подальшої розробки проектів АНД для стандартизації перспективного виду сировини, а також отримання даних, які відсутні у літературі про вміст значної кількості ряду груп БАР.

Кількісне визначення загального вмісту полісахаридів проводили гравіметричним методом. Кількісний вміст пектинових речовин було визначено спектрофотометричним методом.

Кількісний вміст сполук фенольного комплексу визначали: окиснювальні поліфеноли (титриметричним методом в перерахунку на танін), гідроксикоричні кислоти (спектрофотометричним методом в перерахунку на хлорогенову кислоту), флавоноїди (спектрофотометричним методом в перерахунку на рутин), антоціани (спектрофотометричним методом у перерахунку на ціанідину хлорид).

Кількісний вміст вільних органічних кислот проводили титриметричним методом в перерахунку на яблучну кислоту. Було визначено вміст аскорбінової кислоти у всіх досліджуваних зразках сировини. Результати досліджень представлені в табл. 2.

Таблиця 2

Кількісний вміст біологічно активних речовин

БАР	Вміст, % (m=5)
	Бузина чорна				Бузина трав’яниста
	Квітки	Листя	Плоди	Кора	Листя	Квітки
Полісаха­риди	4,140,05	4,440,02	9,430,02	2,130,01	7,220,03	7,030,02
Пектин	7,640,02	5,330,02	4,460,03	8,72 0,03	6,380,03	7,820,02
Сума окисню­- вальних фенолів	6,730,03	3,250,01	3,340,04	2,560,02	2,630,03	5,580,01
Гідрокси­коричні кислоти	2,770,03	2,530,02	3,650,04	0,350,01	2,550,02	2,610,02
Флаво­ноїди	11,120,08	2,310,02	3,010,04	1,930,01	4,830,07	10,610,09
Антоцiа­ни	0,030,01	-	2,920,04	-	-	0,070,01
Органічні кислоти	8,670,05	7,420,02	7,270,04	5,820,04	5,040,05	6,840,04
Аскорбі­нова кислота	0,020,01	0,050,01	0,080,01	0,030,01	0,060,01	0,030,01

Визначення полісахаридів за фракціями проводили у шроті, який залишився після отримання ліпофільних екстрактів. Було визначено спирторозчинні полісахариди (СРПС), водорозчинні полісахариди (ВРПС), пектинові речовини (ПР) та геміцелюлоза (ГЦ). Результати представлені в табл. 3.

Таблиця 3

Кількісний вміст полісахаридів за фракціями в досліджуваних органах бузини чорної

Було отримано ліпофільні фракції та визначено їх якісний склад та кількісний вміст. Методом газорідинної хроматографії було визначено кількісний вміст вільних жирних кислот. Результати представлені в табл. 4.

Таблиця 4

Кількісний вміст жирних кислот у ліпофільних екстрактах

Методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначено елементний склад об’єктів, що досліджувалися. Встановлено наявність та визначено кількісний вміст 26 макро- та мікроелементів. У значній кількості накопичуються калій, кальцій, магній, кремній, фосфор, натрій, залізо та алюміній.

З метою створення нових лікарських засобів з достатньою сировинною базою було розроблено спосіб одержання настойок з квіток та листя бузини чорної.

В якості екстрагенту було використано 40% спирт етиловий, який дав змогу вилучити максимальну кількість флавоноїдів та гідроксикоричних кислот, що обумовлюють гепатопротекторну і антиоксидантну активності отриманих настойок. Оптимальне співвідношення між сировиною та екстрагентом 1:10 для квіток бузини чорної і 1:15 для листя бузини чорної. В результаті обидві настойки – це рідини коричневого кольору з характерним запахом бузини та гіркуваті на смак.

Вивчення гострої токсичності та фармакологічних властивостей настойки квіток і настойки листя бузини чорної проводили в Національному фармацевтичному університеті на кафедрі фармакотерапії під керівництвом д.мед.н. Деримедвідь Л.В.

При дослідженні гострої токсичності настойки квіток і настойки листя бузини чорної встановлено, що вони є відносно нешкідливими препаратами (LD₅₀ > 15000 мг/кг).

Вивчення протизапальної активності на моделі карагенінового набряку свідчать про наявність помірної антиексудативної дії настойки квіток та настойки листя, яка поступається традиційному антифлогистику диклофенаку натрію, але перевершує за протизапальною дією настій бузини чорної.

Дослідження антиоксидантної активності проводили на моделі експериментального гепатиту, який було спричинено внутрішньошлунковим введенням чотирьоххлористого вуглецю (ССl₄). Стан антиоксидантної системи визначали у сироватці крові та в тканинах печінки за рівнем ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) та відновленого глутатіону (ВГ). Дані експерименту свідчать про наявність у досліджуваних настойок квіток і листя бузини чорної антиоксидантної активності. Це підтверджується нормалізацією рівня ТБК-АП до рівня інтактних тварин і збільшенням, у порівнянні з нелікованою патологією, кількості ВГ. Таким чином, БАР (переважно поліфенольні сполуки), що входять до складу настойок, мають властивість нормалізувати процеси вільнорадикального окиснення, а також стабілізувати антиокиснювальну систему гепатоцитів.

Вивчення гепатопротекторної активності настойок бузини проводили на моделі гепатиту, що був викликаний введенням парацетамолу. Вплив досліджуваних настойок на функціональний стан печінки контролювали за активністю маркерних ферментів цитолізу – аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ); холестазу – лужної фосфотази (ЛФ); вмісту загального білку в сироватці крові; рівню ТБК-АП, вмісту глікогену та ВГ в тканинах печінки. Зовнішньосекреторну функцію печінки оцінювали за зміною інтенсивності жовчовідділення, рівню жовчних кислот та холестерину в жовчі. В результаті експериментальних досліджень встановлено, що введення тваринам настойок бузини чорної достовірно нормалізує білково-синтетичну і глікогенутворюючу функції печінки, про що свідчить достовірне підвищення вмісту загального білку в сироватці крові і глікогену в тканині органу. При застосуванні настойок бузини також нормалізується функція жовчоутворення, оскільки відмічено позитивну тенденцію до відновлення процесів холато- і холестериногенезу, швидкості секреції жовчі, зниження активності ЛФ до рівня інтактних тварин. Фармакологічні дії настойки квіток та настойки листя бузини чорної, що досліджувалися, за виразністю були на рівні референс-препарату силібору. Покращення функцій печінки під дією настойок бузини та силібору пов’язано, напевне, з наявністю у рослинних поліфенолів мембраностабілізуючої, антиоксидантної, протизапальної, жовчогінної активності, що забезпечують їх гепатопротекторну дію.

Для розробки АНД на сировину нами було визначено основні мікродіагностичні ознаки листя бузини чорної. Дослідження проводили на базі кафедри ботаніки Національного фармацевтичного університету під керівництвом проф. Сербіна А.Г. Визначені мікродіагностичні ознаки листя бузини чорної використано при розробці відповідного розділу АНД на ЛРС «Листя бузини чорної». Також було розроблено проекти АНД на «Настойка квіток бузини чорної», «Настойка листя бузини чорної». Розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий – дієтичну добавку торгівельної марки „Вітагрен”: „Бальзам „Вітагрен” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1085 від 11.07.2006) і „Еліксир „Тим’янівка” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1088 від 11.07.2006), до складу яких входять квітки бузини чорної.
ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено порівняльне фармакогностичне вивчення бузини чорної та бузини трав’янистої з дослідженням груп БАР, отриманням комплексів БАР, стандартизацією сировини та перспективних субстанцій, встановленням їх біологічної активності, що дало можливість отримати лікарські засоби на їх основі.

2. За допомогою якісних реакцій, хроматографічних методів аналізу, тривимірної скануючої спектрофлуориметрії встановлено наявність в квітках і листі бузини чорної та листі бузини трав’янистої вільних та зв’язаних цукрів, полісахаридів, пектинових речовин, амінокислот, органічних кислот, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, антоціанів, дубильних речовин, кумаринів, сапонінів, стероїдів, фосфоліпідів, хлорофілів, каротиноїдів.

3. З квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав’янистої в індивідуальному стані виділено 31 сполуку: 4 похідні коричної кислоти, 9 похідних кумарину, 5 флавоноїдів, 6 антоціанів, 2 тритерпеноїди, 1 стерин, 2 хлорофіли, 1 речовину фосфоліпідної природи і 1 речовину – похідну сечовини. На основі фізико-хімічних властивостей виділених речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ -спектроскопії, порівняння з референт-зразками встановлено їх структуру. З них умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін, ескулін, мірицетин та алантоїн виділені вперше.

4. Визначено кількісний вміст вуглеводів: гравіметричним методом загальний вміст полісахаридів, спектрофотометричним методом – кількість пектинових речовин у всіх досліджуваних зразках. Вперше з квіток, листя, плодів та кори бузини чорної одержано фракції полісахаридів (СРПС, ВРПС, ПР та ГЦ) та визначено їх кількісний вміст.

5. Вперше визначено якісний склад та кількісний вміст амінокислот. Встановлено наявність 16 амінокислот у квітках, листі, плодах бузини чорної і листі бузини трав’янистої; 15 амінокислот – у корі бузини чорної.

6. Отримано ліпофільні фракції з квіток, листя, плодів, кори бузини чорної і листя бузини трав’янистої. Визначено кількісний вміст хлорофілів та каротиноїдів. Вперше визначено кількісний вміст вільних жирних кислот та визначено числові показники ліпофільних фракцій: число омилення, кислотне, ефірне та йодне числа.

7. Вперше проведено визначення якісного складу та кількісного вмісту макро- та мікроелементів у досліджуваних зразках бузини чорної та бузини трав’янистої та встановлено наявність 26 елементів. Визначено кількісний вміст основних груп БАР: флавоноїдів, антоціанів, гідроксикоричних кислот, суми окиснювальних фенолів, вільних органічних кислот, аскорбінової кислоти.

8. Вперше визначено основні анатомо-діагностичні ознаки листя бузини чорної. Встановлено основні відмінні ознаки сировини, що досліджувалася.

9. Проведено фармакологічні дослідження, які підтвердили наявність протизапальної, антиоксидантної та гепатопротекторної активності настойки квіток і настойки листя бузини чорної.

10. Розроблено проекти АНД на «Листя бузини чорної», «Настойка квіток бузини чорної», «Настойка листя бузини чорної».

11. Розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий – дієтичну добавку торгівельної марки „Вітагрен”: „Бальзам „Вітагрен” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1085 від 11.07.2006) і „Еліксир „Тим’янівка” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1088 від 11.07.2006), до складу яких входять квітки бузини чорної. Склад останнього захищений заявкою на патент України а 2007 04412 від 20 квітня 2007 року.

1. 
   Вельма В.В., Кисличенко В.С. Перспективи фітохімічного вивчення бузини чорної // Запорожский медицинский журнал. – 2004. – Т.2, Вип.1. – С. 95-98. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).
   
2. 
   Вельма В.В., Кисличенко В.С. Дослідження ліпофільних екстрактів з квіток та листя бузини чорної // Фітотерапія. Часопис.– 2005.– №3.– С. 51-55. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).
   
3. 
   Кисличенко В.С., Вельма В.В. Изучение аминокислотного состава цветков, листьев и экстракта из цветков Sambucus nigra // Химия природ. соедин.– 2006.– №1.– С.98. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).
   
4. 
   Липиды и липофильные компоненты некоторых растений / В.С. Кисличенко, Е.Н. Новосел, В.Ю. Кузнецова, В.В. Вельма // Химия природ. соедин.– 2006.– №2.– С.182-183. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).
   
5. 
   Вельма В.В., Кисличенко В.С. Мінеральний склад водного екстракту з квіток бузини чорної // Медична хімія. – 2006. – Т.8, №1. – С.78-79. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).
   
6. 
   Заявка а 2007 04412 Україна, МПК А61К 36/35, А61К 36/53, А61К 36/73. Лікувально-профілактичний засіб / В.О. Кабанов, В.В. Вельма, О.Ю. Миткова, В.С. Кисличенко, Л.М. Малоштан. – Заявл. 20.04.2007. (Особистий внесок – участь у патентному пошуку, складу засобу, проведення досліджень, узагальнення результатів, участь в оформленні матеріалів патенту).
   
7. 
   Кисличенко В.С., Вельма В.В. Сравнительный фитохимический анализ листьев бузины черной и бузины травянистой // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Междунар. съезд Фитофарм 2006, 27-30 июня 2006г.– СПб: Адаптоген, 2006.– С.123-127. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).
   
8. 
   Вельма В.В., Кисличенко В.С. Визначення -ситостерину та лецитину у вегетативних та генеративних органах бузини чорної // Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії: Матеріали наук.-практ. семінару, м. Харків, 26 листоп. 2004 р.– Х.: Вид-во НФаУ, 2004.– С.256-259. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
   
9. 
   Вельма В.В., Кисличенко В.С. Вивчення елементного складу рослинної сировини Sambucus nigra // Створення, виробництво, стандартизація, фармако-економіка лікарських засобів та біологічно активних добавок: Матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю.– Тернопіль: Укрмедкнига, 2004.– С.87-89. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
   
10. 
    Вельма В.В., Кисличенко В.С. Визначення хлорофілів та каротиноїдів в бузині чорній // Дні науки ‘2005: Матеріали Міжнар. наук.-практ. конф. – Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2005. – Т. 1. Біологія. – С.52-54. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
    
11. 
    Вельма В.В., Кисличенко В.С. Про необхідність створення нового лікарського засобу з квіток бузини чорної // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: Матеріали VI Нац. з’їзду фармац. України, 28-30 верес. 2005 р. – Х.: Вид-во НФаУ, 2005. – С. 685. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
    
12. 
    Вельма В.В., Кисличенко В.С. Вивчення мономерного складу полісахаридних комплексів з квіток та листя бузини чорної // Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів: Матеріали 1-ї Міжнар. наук.-практ. конф., 6-7 квіт. 2006 р.– Тернопіль: Укрмедкнига, 2006.– С.34-35. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
    
13. 
    Вельма В.В., Кисличенко В.С. Дослідження елементного складу плодів представників роду Sambucus L. // Лікарські рослини: традиції та перспективи досліджень: Матеріали міжнар. наук. конф.– К.: Вид-во Укр. фітосоціологічного центру, 2006.– С. 276-278. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
    
14. 
    Вельма В.В., Кисличенко В.С. Розробка та впровадження у виробництво продукта спеціального харчового – дієтичної добавки «Бальзаму «Вітагрен» // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок: Тез. доп. ІІ Міжнар. наук.-практ. конф., 12-13 жовт. 2006 р. – Х.: Вид-во НФаУ, 2006. – С.42. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).
    
15. 
    Kislichenko V.S., Velma V.V. The study of Sambucus ebulus leaves lipophilic extract // 7^th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds, Oct. 16-18 2007. – Tashkent, 2007. – P. 247. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).