Мишланов В. Ю., Туев А. В., Агафонов А. В., Обухова О. В
жүктеу/скачать 129.76 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Резюме
- Рис. 1. Возрастная динамика уровня высвобождения холестерина лейкоцитами in vitro у здоровых лиц
|
Мишланов В.Ю., Туев А.В., Агафонов А.В., Обухова О.В. ИЗУЧЕНИЕ СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА ЛЕЙКОЦИТАМИ БОЛЬНЫХ ИБС, АТЕРОСКЛЕРОЗОМ МАГИСТРАЛЬНЫХ СОСУДОВ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СИСТЕМЫ ДЫХАНИЯ ГОУ ВПО «ПГМА Росздрава, г. Пермь. РезюмеМишланов В.Ю., Туев А.В., Агафонов А.В, Обухова О.В. ИЗУЧЕНИЕ СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ БЕЛКОВО-ЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ БОЛЬНЫХ ИБС, АТЕРОСКЛЕРОЗОМ МАГИСТРАЛЬНЫХ СОСУДОВ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ Лейкоциты крови принимают активное участие в атерогенезе, обладают способностью поглощать холестерин (ХС) и синтезировать его de novo, осуществляют синтез белков, в том числе, обладающих способностью связываться с холестерином и жирными кислотами с образованием белково-липидных комплексов (БЛК). Тем не менее, клиническое значение этих реакций остается мало изученным, поэтому целью исследования являлось изучение способности лейкоцитов крови больных различными формами ИБС и воспалительными заболеваниями системы дыхания: бронхиальной астмой, хронической обструктивной болезнью легких, пневмонией, и здоровых людей высвобождать БЛК in vitro. Была разработана методика выделения лейкоцитов крови путем осаждения эритроцитов в растворе декстрана и оценки уровня высвобождения БЛК культурой лейкоцитов. Проведена сравнительная оценка способности различных популяций клеток крови к высвобождению БЛК in vitro, а также способности лейкоцитов крови выживать в условиях культивирования. Изучено влияние некоторых лекарственных препаратов, оказывающих влияние на способность лейкоцитов высвобождать БЛК in vitro в культуре (липидвысвобождающая способность лейкоцитов, ЛВСЛ). Кроме этого выполнено дуплексное сканирование магистральных сосудов, другие исследования. Для оценки клинического значения ЛВСЛ выделено две группы больных ИБС – стенокардией напряжения и нестабильными формами заболевания. Было показано, что ЛВСЛ значительно увеличивается при нестабильных формах заболевания. Уровень ЛВСЛ отражает степень поражения атеросклеротическим процессом магистральных сосудов. Результаты показали, что наибольшей ЛВСЛ обладали нейтрофилы больных ИБС. Увеличение ЛВСЛ часто совпадало с выживаемостью нейтрофилов в культуре. Установлено, что ЛВСЛ увеличивается у больных ХОБЛ и имеет низкие значения у больных БА и пневмонией. На основании проведенного исследования высказано предположение о том, что атерогенные фракции БЛК могут продуцироваться и высвобождаться не только в печени, но и местно, в поврежденной сосудистой стенке, некоторыми воспалительными клетками, прежде всего нейтрофилами, под влиянием стрессогенных факторов (оксидативный и метаболический стресс), некоторых гормонов и цитокинов. ЛВСЛ, вероятно, представляет собой важный фактор риска развития атеросклероза.
STUDY OF STRESS-INDUCED PROTEIN-CHOLESTEROL COMPLEXES RELEASING BY LEUKOCYTES IN CORONARY DISEASE, ATHEROSCLEROSIS OF MAIN ARTERIES AND INFLAMMATORY PULMONARY DISEASES' PATIENTS Leukocytes from blood take an active part in atherogenesis, have a possibility to include cholesterol (CH) and to synthesize it de novo. Also, they synthesize some proteins, which connect CH and lipid acids and form protein-cholesterol complexes (PChC). However, clinical significance of these processes is rather unknown. The aim of our study was to investigate a possibility of human leukocytes to release PChC in vitro in patients with different forms of coronary disease (CD) and some inflammatory pulmonary diseases: bronchial asthma (BA), chronic obstructive lung disease (COPD), pneumonia (Pn) and healthy people. We had elaborated and described the method of leukocytes excluding by sedimentation of erythrocytes in dextran solution and of determining of PChC releasing from leukocytes after 3 days culturing. We had estimated the possibility of different leukocyte populations from blood to release PChC in vitro after 3 days culturing (leukocyte’s lipid release activity, LLRA) and to survive it cultures too. It was determined that some drugs may act these processes. Also we have performed duplex scanning of main arteries too. CD patients were subdivided in two groups: the 1st group of patients with stable stenocardia and the 2nd – unstable forms of disease. Results: values of LLRA were significantly increased in the 2nd group. It was present that neutrophiles have most strong LLRA among other blood cells. Increasing of LLRA was coincided with surviving of neutrophiles in cultures very often. LLRA levels were increased in COPD patients, but had low levels in BA or Pn patients. We have became to prior conclusion that atherogenic classes of PChC may be synthesized and released not only in liver but in injured artery wall (in situ) by some inflammatory cells too, first of all by neutrophiles under stressogenic factors (oxidative and metabolic stress), some hormones and cytokines. Evidently LLRA is a very important risk factor of atherogenesis. Study of stress-induced protein-cholesterol cjmplexes releasing by leukocytes in coronary disease, atherosclerosis of main arteries and inflammatory pulmonary diseases' patients. Key words: atherosclerosis, coronary disease, leukocytes, cholesterol, protein-cholesterol complexes and leukocyte’s lipid release activity. Актуальность. Лейкоциты являются активными участниками воспаления при атеросклеротическом поражении сосудов. Активная роль моноцитов/макрофагов, нейтрофилов и некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов описана в многочисленных научных публикациях [1 - 8]. Известно также, что лейкоциты являются клетками, секретирующими различные биологически активные вещества. Существует точка зрения, что лейкоцит (нейтрофил) функционирует как одноклеточная железа [9, 10]. Лейкоциты способны поглощать липопротеиды плазмы, синтезировать холестерин (ХС) и белки de novo [11]. Однако клиническое значение этих процессов остается мало изученным. Цель работы: изучить способность лейкоцитов крови больных ИБС, воспалительными заболеваниями системы дыхания и здоровых людей высвобождать белково-липидные комплексы (БЛК) in vitro и определить клиническое значение данной реакции. Материал и методы. Обследовано 40 практически здоровых лиц, 40 больных ИБС, стабильной – 1-я группа (14 человек) и нестабильной стенокардией – 2-я группа (26 человек). Обследовано также 32 больных бронхиальной астмой (БА), 15 - с легким, 10 - средней тяжести и 7 – с тяжелым течением заболевания, 10 больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), 6 - с легким и 4 - со среднетяжелым течением болезни, 7 больных пневмонией (Пн). Диагноз ИБС устанавливали на основании комплексного клинико-инструментального и лабораторного обследования. Здоровые лица были разделены на две возрастные группы: от 21 до 40 лет и от 41 до 60 лет. У 14 больных ИБС, 11 больных БА, 5 больных ХОБЛ и 7 контрольных лиц выполняли дуплексное сканирование магистральных сосудов (дуга аорты, сонные артерии, бедренные артерии). Размер выявленных атеросклеротических бляшек определяли как произведение максимального и минимального диаметров сечения бляшки (мм2). В случаях выявления нескольких бляшек при указанной последовательности исследования, вычисляли сумму произведения диаметров каждой бляшки (М2). Оценивали эхоструктуру бляшки, наличие гипер- и гипоэхогенности. Для изучения способности лейкоцитов высвобождать ХС (липидвысвобождающей способности лейкоцитов, ЛВСЛ) венозную кровь забирали в стерильные пробирки с гепарином. Выделение лейкоцитов осуществляли методом отстаивания в течение 40 минут при комнатной температуре в присутствии декстрана. Определяли количество лейкоцитов обычным методом с помощью камеры Горяева. Выделенную суспензию лейкоцитов инкубировали в питательной среде Игла без добавления сыворотки 62 часа при 37° С. В надосадочной жидкости определяли уровень ХС холестериноксидазным методом с помощью набора фирмы Human. Кроме этого, готовили мазки до, и после инкубации, окрашивали по Романовскому-Гимзе и считали лейкоформулу. Аналогичные процедуры были выполнены в 5 случаях после выделения клеток в градиенте фиколл-верографин 1,077, а также после выделения эритроцитов методом отстаивания гепаринизированной крови в присутствии декстрана. В 5 случаях в надосадочной культуральной жидкости оценивали уровни альфа липопротеидов с помощью набора фирмы Human по рекомендуемой методике. Выполнено 366 теста. Проведено изучение влияния преднизолона, ронколейкина, имунофана и милдроната на способность лейкоцитов крови высвобождать холестерин in vitro. Параллельно у всех обследованных больных изучали фагоцитарную активность нейтрофилов, липидный спектр крови, у больных бронхообструктивными заболеваниями выполняли спирометрию с помощью компьютерного спирометра Spirosift 3000. Результаты. Описанный нами метод изучения ЛВСЛ показал хорошую воспроизводимость результатов, средняя величина колебания показателя в дублях составила 0,01±0,002 ммоль/л общего холестерина (сигма 0,009). В культурах лейкоцитов здоровых людей, как правило, уровень ЛВСЛ был выше 0,10 ммоль/л. Средняя величина в группе здоровых лиц в возрасте 21-40 лет составила 0,24±0,035 ммоль/л, в группе 41-60 лет – 0,12±0,015 ммоль/л. Разница между возрастными группами была достоверной (p<0,05, рис. 1). Среди лейкоцитов, выделенные методом отстаивания с добавлением декстрана, преобладали нейтрофилы (50-71%), что аналогично их соотношению в периферической крови. Клетки крови, выделенные на градиенте плотности фиколл-верографина 1,077, были представлены преимущественно лимфоцитами (78-85%), моноцитами и тромбоцитами.  Рис. 1. Возрастная динамика уровня высвобождения холестерина лейкоцитами in vitro у здоровых лицПри определении уровня ХС в культуральной среде, в случаях использования клеток крови, выделенных в градиенте плотности, результаты оказались приблизительно в 3,6 раза ниже, чем в случаях выделения лейкоцитов методом отстаивания в присутствии раствора декстрана. Средние величины составили 0,07±0,015 и 0,24±0,047 ммоль/л соответственно (p<0,01). В надосадочной жидкости культуры эритроцитов уровень ХС составил 0,04±0,010 ммоль/л. При этом надосадочные жидкости культур лейкоцитов этих же пациентов содержали ХС в концентрации 0,29±0,041 ммоль/л, т.е. в 7,3 раза больше (p<0,001). В надосадочной жидкости практически не выявлялись альфа-липопротеиды. Изучение лейкоформулы до и поле культивирования клеток крови, выделенных методом отстаивания, выявило, что у здоровых людей после 3-х суточного культивирования существенно снижалось соотношение нейтрофилов и лимфоцитов. Средняя относительная величина количества нейтрофилов после 3-х суточного культивирования составила 26,3±4,50%, а лимфоцитов – 62,7±5,60%, что свидетельствует о гибели нейтрофилов в процессе культивирования. Корреляционный анализ установил взаимосвязь между способностью нейтрофилов выживать в условиях культивирования и высвобождением ХС r=0,49 (p<0,02, рис. 2).
Рис. 2. Взаимосвязь относительного количества выживших нейтрофилов в культуре с уровнем высвобождения холестерина Добавление в культуральную среду преднизолона в концентрации 15˚мкг/мл вызывало снижение уровня ЛВСЛ в 63,6%, в 5 тестах из 6 (83,3% случаев) изменение ЛВСЛ совпадало с изменением относительного числа выживших нейтрофилов. В пяти тестах из пяти добавление в культуральную среду ронколейкина (500˚ЕД/мл) вызывало увеличение уровня высвобождаемых БЛК в культуральную среду. Имунофан в концентрации 0,025˚мкг/мл (0,01˚мкг/20˚000˚000 лейкоцитов) снижал высвобождение БЛК у 46,1%, увеличивал у 30,8% и не изменял высвобождение БЛК у 23,1% пациентов. Милдронат в концентрации 50˚мкг/мл чаще повышал высвобождение БЛК (52,9% случаев), снижение отмечено у 29,4%, отсутствие динамики у 17,7% пациентов. Кроме этого, выявлено, что у 3-х больных ИБС, получавших милдронат в качестве метаболической терапии и имевших ранее данные об отрицательном влиянии препарата на высвобождение БЛК, после терапии результат менялся на противоположный – препарат усиливал высвобождение БЛК из лейкоцитов in vitro, но уровень высвобождения БЛК существенно снижался во всех случаях подобной терапии. Результаты применения имунофана у 5 больных ИБС и 3-х больных с различными хроническими воспалительными заболеваниями легких показали, что после курса лечения по схеме 50 мкг через день в/м, высвобождение БЛК лейкоцитами in vitro снижалось во всех случаях. У больных ИБС 1-й группы уровень высвобождения БЛК лейкоцитами in vitro, выделенными методом отстаивания в присутствии раствора декстрана, составил 0,12±0,032 ммоль/л, во 2-й группе – 0,25±0,027 ммоль/л (p<0,05, рис. 3). Р  ис. 3. Уровни высвобождения БЛК лейкоцитами in vitro у больных стабильной и нестабильной стенокардией Результаты ультразвукового сканирования магистральных сосудов установили, что у 6 из 7 больных нестабильной стенокардией имели место атеросклеротические изменения магистральных сосудов. У 7 из 8 больных стенокардией напряжения также найдены атеросклеротические бляшки. Получена достоверная разница в уровнях ЛВСЛ в сравниваемых группах больных, в то же время различий в липидном спектре крови и других тестах между сравниваемыми группами больных ИБС не выявлено. При сравнении результатов обследования группы больных ИБС, у которых при ультразвуковом исследовании сосудов были обнаружены атеросклеротические поражения, с контрольной группой из 5 практически здоровых добровольцев старше 40 лет выявлено значительное увеличение ЛВСЛ в первом случае (p<0,001). Причем у тех больных, у которых лейкоциты крови при культивировании высвобождали ХС в концентрации менее 0,15 ммоль/л, средняя величина произведения диаметров сечения бляшки составила 14,3±3,5 мм2, а у больных, имевших уровень высвобождения ХС лейкоцитами in vitro 0,15 ммоль/л и более, - 24,7±0,39 мм2 (p<0,05). Следует отметить, что у больных с высокой ЛВСЛ имели место случаи выявления бляшек низкой эхогенной плотности (рис. 4).
Рис. 4. Атеросклеротическое поражение магистральных артерий у пациентов, имевших различное высвобождение холестерина лейкоцитами in vitro При выполнении корреляционного анализа нами не установлено взаимосвязи между фагоцитарной активностью нейтрофилов венозной крови и ЛВСЛ. Не установлено также достоверной разницы между показателями фагоцитарной активности нейтрофилов между группами больных стенокардией напряжения и нестабильными формами ИБС. Установлено, что в общей группе больных БА среди лиц различных возрастов средняя величина ЛВСЛ составила 0,16±0,029 ммоль/л, у больных БА старше 40 лет – 0,08±0,015, у больных ХОБЛ в возрасте старше 40 лет – 0,28±0,069 ммоль/л, у больных пневмонией 0,11±0,024 ммоль/л. Сравнение с группой здоровых лиц соответствующего возраста показало, что больные пневмонией отличались достоверным снижением ЛВСЛ, а больные ХОБЛ – достоверным увеличением данного показателя. Кроме этого, группа больных ХОБЛ имела достоверно более высокий уровень высвобождения ХС in vitro по отношению к соответствующей по возрасту группе больных БА (p<0,05), а больные БА в возрасте старше 40 лет – тенденцию к снижению показателя (p<0,10). В общей группе больных БА установлена достоверная взаимосвязь между уровнем ЛВСЛ и ОФВ1 (r=0,54, p<0,05). В группе больных ХОБЛ такая взаимосвязь была недостоверной (r=0,68, p=0,20). У больных БА значительно повышена выживаемость эозинофилов в тесте культивирования in vitro. У больных ХОБЛ увеличение выживаемости нейтрофилов в 3-х суточной культуре сопровождается повышением способности нейтрофилов к высвобождению БЛК. Дуплексное сканирование магистральных сосудов, выполненное у больных БА, позволило выявить признаки атеросклеротического поражения у 4 из 10 больных, трое из которых имели клинику стенокардии и еще один пациент – гипертоническую болезнь. В группе больных ХОБЛ 100% обследованных пациентов имели атеросклеротическое поражение магистральных сосудов. Обсуждение. Установленный факт высвобождения БЛК лейкоцитами при культивировании in vitro не вызывает сомнения. Вероятнее всего, именно нейтрофилы принимают непосредственное участие в этом процессе. Проведенные исследования выявили незначительный уровень высвобождения БЛК в клеточных взвесях, обогащенных лимфоцитами, тромбоцитами и эритроцитами. Факт накопления ХС нейтрофилами у больных ИБС известен давно. Предполагалось, что это может быть обусловлено как фагоцитарной активностью клеток, так и синтезом некоторых белков de novo, обладающих способностью связывать ХС с образованием БЛК [11, 12]. Недавно было показано, что моноциты человека в культуре способны превращаться в пенистые клетки [3]. Наши исследования показали, что ЛВСЛ гораздо выше в клеточных взвесях, обогащенных нейтрофилами. Методики выделения чистой популяции моноцитов в стерильных условиях чрезвычайно трудоемки, что не позволило нам провести исследования в отношении этих клеток. В наших исследованиях нейтрофилы не могли захватывать ХС или БЛК из культуральной жидкости, поскольку она не содержала их изначально. Возникают вопросы о механизмах, обуславливающих этот процесс. Возможны три варианта: 1 – высвобождение ХС из мембран разрушенных клеток; 2 - высвобождение БЛК, ранее захваченных нейтрофилами из кровотока; 3 – синтез БЛК de novo. Первое предположение, видимо, несостоятельно, поскольку при культивировании эритроцитов, которые являются идеальной моделью для изучения мембран клеток, высвобождение значимых количеств ХС в использованной методике не установлено. Кроме того, уровень высвобождаемого ХС ассоциировался с увеличением количества выживших нейтрофилов, а не с количеством погибших клеток. Второе предположение могло бы иметь подтверждение в том случае, если бы способность к высвобождению БЛК in vitro была корреляционно зависима с фагоцитарной активностью клеток. Такой взаимосвязи нами не установлено. Мы не исключаем, что основным механизмом накопления БЛК в культуральной жидкости, не содержавшей их ранее, является синтез некоторых белков de novo и образование БЛК в нейтрофилах, стимулированные особыми стрессогенными условиями культивирования (оксидативный и метаболический стресс). Эти клетки имеют соответствующий набор ферментов как для синтеза ХС, так и белков [9, 12]. Уровень высвобождаемых БЛК коррелирует с выживаемостью нейтрофилов в культуре. Добавление преднизолона, влияющего на синтез белков в клетке, в 63,6% случаев снижает высвобождение БЛК, восстанавливая параллельно процессы апоптоза нейтрофилов, что согласуется с данными M. Graefe et al. [14], указавших на зависимость механизмов апоптоза от синтеза белка и оксидативного стресса. Нами показано клиническое значение ЛВСЛ, причем увеличение данной активности сочетается с нестабильным течением ИБС и может служить дополнительным диагностическим критерием этого состояния. Показано, что увеличение высвобождения БЛК in vitro сочетается с более выраженным атеросклерозом магистральных сосудов. Увеличение высвобождения БЛК лейкоцитами больного ИБС in vitro сочетается с нестабильной клинической картиной болезни, а также с наличием бляшек неоднородной структуры с признаками гопоэхогенности (бляшки с активным воспалением). Выявленные различия высвобождения БЛК лейкоцитами in vitro при различных воспалительных заболеваниях системы дыхания, вероятно, можно объяснить с особенностями иммунорегуляции при этих воспалительных процессах, что подтверждают данные о влиянии ронколейкина (синтетического аналога интерлейкина-2). В этом случае предполагается, что цитокиновый спектр, соответствующий воспалительному процессу при ИБС и ХОБЛ, усиливает данную реакцию. Больные БА и пневмонией имеют низкий уровень ЛВСЛ. Результаты проведенного исследования позволяют сделать предположение о том, что атерогенные фракции БЛК выполняют функцию острофазовых веществ и могут продуцироваться не только в печени, но и местно, в поврежденной сосудистой стенке, некоторыми воспалительными клетками, прежде всего нейтрофилами. Способность лейкоцитов высвобождать БЛК in vitro, вероятно, представляет собой важный фактор риска развития атеросклероза. Сам процесс развития атеросклероза, в таком случае, является особым вариантом хронического воспаления в ответ на повреждение сосудистой стенки различными стимулами, среди которых известную роль играет, например, артериальная гипертония или инфекционный процесс. Таким образом, проведенные экспериментальные исследования позволяют говорить о способности лейкоцитов (вероятно, нейтрофилов) к высвобождению (синтезу?) БЛК при культивировании in vitro. Этот процесс связан с выживаемостью нейтрофилов, может быть управляемым с помощью эндогенных модуляторов (цитокинов) и некоторых лекарственных препаратов, и существенно различается в зависимости от нозологической формы заболевания, определяющей тот или иной спектр эндогенных цитокинов-модуляторов. Список литературы:
жүктеу/скачать 129.76 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|
