Моделирование светорассеяния клетками крови с помощью метода дискретных диполей 03. 00. 02 биофизика

Общая характеристика работы

Оптические методы широко используются для изучения и характеризации клеток крови, поскольку они неинвазивны и обладают высокой скоростью анализа. Наиболее важными среди этих методов являются методы, основанные на измерении (упругого) светорассеяния и флуоресценции (либо автофлуоресценции, либо при использовании флуоресцентных меток). Для анализа крови оптические методы широко применяются в проточных цитометрах, которые позволяют одновременно измерять сигналы светорассеяния и флуоресценции от одиночных клеток со скоростью десяток тысяч частиц в секунду. Светорассеяние определяется морфологией клеток, а именно распределением показателя преломления внутри клетки в масштабе порядка длины волны. Флуоресцентные же метки используются для изучения химической структуры клетки в масштабе нанометров. Они определяют наличие определённых макромолекул на поверхности или внутри клетки, тем самым разделяя клетки, которые экспрессируют или не экспрессируют эти макромолекулы. Автофлуоресценция используется очень редко в связи с её чувствительностью ко многим факторам, которые тяжело контролировать.

Исторически методы, основанные на светорассеянии, быстро развивались в проточной цитометрии в 1980-х. Но в начале 1990-х многоцветный флуоресцентный анализ перехватил инициативу и в дальнейшем определял развитие проточной цитометрии. Флуоресцентные метки позволяют быстро и достоверно разделять и подсчитывать любые подтипы любых типов клеток крови известных специалистам. В обычных проточных цитометрах светорассеяние только предоставляет неточную оценку объёма клетки и используется для разделения основных типов клеток крови. Измерение объёма частично дополняется использованием ячейки Култера, измеряющей электрический импеданс клетки.

Несмотря на своё триумфальное использование в проточной цитометрии, флуоресцентные метки имеют два основных ограничения. Во-первых, они обычно не предоставляют никакой информации о морфологии клетки, т.е. об её размере и форме, ядре и других элементах внутренней структуры. Во-вторых, флуоресцентные метки нельзя назвать полностью неинвазивными. Мечение занимает некоторое время (обычно полчаса) и может слегка модифицировать живые клетки. Это особенно важно для кинетических исследований, когда требуется отслеживать состояние системы в определённые моменты времени в течение биологического процесса. Более того, флуоресцентные метки довольно дороги. Их цена добавляется к себестоимости каждого анализа крови, в то время как методы, основанные на светорассеянии, требуют только определённого количества электричества и воды для каждого анализа. Анализ, проведённый В.П. Мальцевым в российских больницах, показал, что себестоимость анализов является основным препятствием для массового применения проточных цитометров. То же самое относится и к применению проточной цитометрии для диагностики таких заболеваний, как малярия, в Африке.

Поэтому светорассеяние является перспективным направлением для медицинских систем для массового анализа крови. Особенно это актуально для развивающихся стран, где такие системы могут существенно улучшить качество здравоохранения. Более того, светорассеяние потенциально может характеризовать морфологию клеток, в том числе и их внутреннюю структуру, расширяя тем самым информативность анализа крови. Эта информация может быть немедленно применена для диагностики заболеваний, для которых, например, известна корреляция между морфологией и стадией заболевания, как при некоторых видах рака крови. Однако в данном контексте существуют ограничения для методов, основанных на светорассеянии. Во-первых, стандартные проточные цитометры предоставляют очень мало информации о светорассеянии, которая обычно сводится к интенсивности светорассеяния, интегрированной в нескольких угловых интервалах, обычно только в двух: так называемые рассеяние вперёд и вбок. Некоторые цитометры также измеряют деполяризованное рассеяние вбок. Во-вторых, проблематично точно моделировать светорассеяние клетками крови ввиду их большого размера и сложной внутренней структуры. В-третьих, характеризация клеток крови по измеренным сигналам светорассеяния требует решения обратной задачи светорассеяния, что нетривиально.

Первое ограничение снимается новыми экспериментальными методами, такими как сканирующий проточный цитометр и методы, основанные на эллипсоидальной полости, которые измеряют индикатрису светорассеяния, разрешённую по одному или двум углам соответственно.

1. 
   Провести строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и разработать методику экстраполяции для улучшения точности и оценки погрешностей, а также разработать способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации.
   
2. 
   Разработать компьютерную программу на основе метода дискретных диполей для моделирования светорассеяния произвольными частицами, в частности, клетками крови в жидкости, изучить её возможности для рассеивателей много больших длины волны и провести сравнение этой программы с аналогами на основе этого же и других методов.
   
3. 
   Разработать метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с базой данных теоретических индикатрис, и экспериментально проверить его в сравнении с эталонными методами определения объёма и концентрации гемоглобина. Также, используя базу данных индикатрис, уточнить и проверить спектральный метод определения диаметра эритроцитов.
   
4. 
   На основании моделирования светорассеяния упрощённой моделью гранулоцита в виде зернистого шара объяснить наблюдаемое различие в интенсивности деполяризационного бокового рассеяния между двумя подтипами гранулоцитов, и рассмотреть эту же задачу светорассеяния в рамках приближения Релея-Дебая-Ганса и его второго порядка.
   
5. 
   Измерить индикатрисы нейтрофилов с помощью сканирующего проточного цитометра и сравнить их с теоретическими индикатрисами модели зернистого шара с сегментированным ядром, а также исследовать зависимость модельных индикатрис от размера гранул.
   

Впервые проведён строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и показано, что ошибки ограничены суммой линейных и квадратичных по размеру диполя членов.

Предложена методика независимой оценки погрешности метода дискретных диполей и способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации, а также проведено систематическое сравнение этого метода с методом конечных разностей во временной области для рассеивателей много больше длины волны.

Разработан метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис светорассеяния с базой данных из 40 000 теоретических индикатрис.