МөЖ. Белковая комплементация как инструмент для изучения межбелковых взаимодействий в живой клетке
а-CRE сплитрекомбиназасын белсендіру механизмі
жүктеу/скачать 1.5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- АҚУЫЗ КОМПЛЕМЕНТАЦИЯСЫ ҚҰРАЛ РЕТІНДЕ
- ФЛУОРЕСЦЕНТТІ АҚУЫЗДАРҒА НЕГІЗДЕЛГЕН РЕПОРТЕРЛІК ЖҮЙЕЛЕР
| а-CRE сплитрекомбиназасын белсендіру механизмі.
АҚУЫЗ КОМПЛЕМЕНТАЦИЯСЫ ҚҰРАЛ РЕТІНДЕ а-сплит дигидрофолатредуктазалық репортер жүйесінің әсер ету механизмі. Метотрексатқа сезімтал емес мутантты DHFR (mDHFR) фрагменттері зерттелетін ақуыздармен біріктіріледі. Егер ақуыздар өзара әрекеттеспесе, онда жасушаларды метотрексатпен емдеу эндогендік DHFR мен өлімнің жолын кесуге әкеледі. Егер ақуыздар өзара әрекеттессе, онда mDHFR фрагменттері рекомбинацияланады және жасушаларда метотрексатқа сезімтал емес белсенді DHFR пайда болады. АҚУЫЗ КОМПЛЕМЕНТАЦИЯСЫ ҚҰРАЛ РЕТІНДЕ B-белгілі бір мақсаттарға жақындығы бар ақуыздардың нұсқаларын іздеудің екі сатылы жүйесі. А ақуызының нұсқалары цитозиннің урацилге айналуын катализдейтін цитозиндезаминазаның N-терминалды фрагментімен (NoyCD), ал осы ферменттің С – терминалды ақуызымен (c#oyCD) байланысады. Екі ақуыз да эндогендік oy CD жоқ ашытқы жасушаларына енгізіледі және урацилсіз ортада өсіріледі. АҚУЫЗ КОМПЛЕМЕНТАЦИЯСЫ ҚҰРАЛ РЕТІНДЕ Урацил болмаған кезде жасушалар белсенді oyCD болған кезде ғана өмір сүре алады, ол А ақуызының (mA) нұсқасы в ақуызымен байланысқан кезде пайда болады. 2-1 сатысында анықталған, В ақуызымен байланысқан, с ақуызымен де әрекеттеседі, бұл жағымсыз. АҚУЫЗ КОМПЛЕМЕНТАЦИЯСЫ ҚҰРАЛ РЕТІНДЕ MA опциялар кітапханасы N oyCD – мен, ал ақуыз c-c oyCD-мен байланысады. Екі құрылым да ашытқы жасушаларына 1-де бірдей сызықта енгізіледі. Жасушалар 5 - фторцитозин (5-FC) қосылған ортада өсіріледі. oyCD уытты емес 5-FC - ны улы 5-FU-ға айналдыра алады, нәтижесінде жасуша өледі. Осылайша, белсенді oyCD жоқ жасушаларды ғана таңдауға болады, нәтижесінде с ақуызымен байланыспайтын mA бар. ФЛУОРЕСЦЕНТТІ АҚУЫЗДАРҒА НЕГІЗДЕЛГЕН РЕПОРТЕРЛІК ЖҮЙЕЛЕР Флуоресцентті комплементацияға негізделген репортерлік жүйелер (BiFC, bimolecular fluorescent complementation) қолдануға өте ыңғайлы. Олар ферментативті белсенділігі жоқ ақуыздарды пайдаланады, ферменттердің субстраты емес, бірақ олар басқа қосымша репортер ақуыздарымен бірдей принцип бойынша құрылады. Флуоресцентті ақуыз белсенді емес жартыға бөлінеді, олар жақындаған кезде қайталама құрылым мен флуоресцентті белсенділікті қалпына келтіре алады. Мұндай флуоресцентті емес жартысы зерттелген ақуыздармен біріктірілмейді, ал флуоресценцияның пайда болуы осы ақуыздардың өзара әрекеттесуін көрсетеді. Басқа BiFC тілшілерінен бөлек, sfGFP қолданылатын жүйелер бар. SfGFP модификацияланған GFP (EGFP) негізінде құрылған, әлсіз құрылымдалған ақуыздармен біріктірілген EGFP-нің белсенді қайталама құрылымды қалыптастыру қабілетін жақсарту. Sfgfp қайталама құрылымы жоғары қарсылықпен сипатталады, ал хромофордың өзі өте қысқа пісетін уақытқа ие Бір ақуыз лигандының екіншісіне бәсекелестік алмастыру динамикасын, сондай-ақ үш және төрт компонентті ақуыз кешендерін көп түсті флуоресцентті комплементацияны қолдана отырып зерттеуге болады. Флуоресцентті ақуыздың спектрлік қасиеттері Оның N терминалды доменінің құрылымымен анықталады, сондықтан екі түрлі флуоресцентті ақуыздардың N терминалды домендерін (мысалы, сары Venus және көк Cerulean) бір рецептордың екі түрлі лигандына, ал бір флуоресцентті ақуыздың терминалды доменінен мақсатты ақуыздың өзіне қосу арқылы флуоресцентті сигналдың спектрлік қасиеттері бойынша лигандтардың қайсысының ақуызбен, нысанамен байланысады анықтауға болады А ақуызының әртүрлі мақсаттармен әрекеттесуін анықтауға арналған көптеген түсті белгілер. А ақуызы флуоресцентті ақуыздың соңғы фрагментімен, ал В және С мақсатты ақуыздар – Venus және Cerulean флуоресцентті ақуыздардың N соңғы фрагменттерімен біріктіріледі. А-мен В-мен әрекеттескенде белсенді Venus қалпына келеді, ол 528 нм шыңымен флуоресцентті, ал А – мен С-мен әрекеттескенде белсенді Cerulean қалпына келеді, оның флуоресценциясы 475 нм шыңына жетеді. Осы принцип бойынша мономерлі көк, көк, жасыл, сары және қызыл флуоресцентті ақуыздар негізінде BiFC жүйелері құрылды . Олардың ішінде сары (Venus) және көк (Cerulean) флуоресцентті ақуыздарға негізделген жүйелер кеңінен қолданылады. BiFC жүйесін қолдана отырып өлшеу жүргізудің көптеген басқа тәсілдерінен айырмашылығы, қосымша өңдеу қажет емес: бояу, репортер субстраттарын немесе лигандтарды енгізу. Мұның бәрі алынған нәтижелердің сенімділігін арттырады жүктеу/скачать 1.5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|