ДНК-маркеры для изучения ЦМС у Brassica

Для исследований были взяты фертильные и стерильные растения капусты пекинской B. pekinensis (Lour.) Rupr., капусты абиссинской (горчицы эфиопской) В. carinata A. Braun, турнепса B. rapa L. var. rapa (L.) Thell., капусты цветной B. oleracea convar. botrytis (L.) Alef. var. botrytis L., капусты белокочанной В. oleracea L. convar. capitata L. Alef. var. capitata L. f. alba DC, горчицы сарептской B. juncea (L.) Czern., брюквы B. napus L. var. napobrassica (L.) Rchb., редиса Raphanus sativus L. var. radicula Pers., рапса B. napus L. ssp. oleifera (Metzg.) Sinsk. В опыте использовались стерильные растения как с типом ЦМС ogura, так и с неизвестным типом. Для изучения молекулярной структуры митохондриальной ДНК фертильных и стерильных форм растений использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). На основании литературных данных о нуклеотидных последовательностях, специфичных для того или иного типа ЦМС, были синтезированы 12 пар праймеров. Для ПЦР анализа на тип ЦМС Ogura использовали семь пар праймеров, специфичных на данный тип стерильности – Og1 и Og2, ogu-5' и ogu-3', orf138-5' и orf138-3^', orf138-F1 и orf138-R, orf138-F2 и orfB-R1, orfB-F и orfB-R2, TRNAFM-F и TRNAFM-R (Motegi et al., 2003; Giancola et al., 2007). При проведении ПЦР с этими праймерами амплифицировались фрагменты ДНК ожидаемых размеров. В результате было выявлено, что у образца с неизвестным типом ЦМС, спонтанно возникшей в результате межвидовой гибридизации, амплифицируется ДНК только с прамерами на Ogura тип ЦМС. Клонирование и секвенирование полученных продуктов подтвердило их полную гомологию с митохондриальной ДНК специфичной для Ogura типа ЦМС.

Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов. Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам. Информация о структуре локусов у неустойчивых форм растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости. В нашем исследовании был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав I2 и Ve, у неусточивых форм томата.

Для сравнительного анализа локуса I2 у устойчивых и неустойчивых к фузариозу генотипов томата были использованы два праймера UP78 и LF79. Праймеры были синтезированы на основании нуклеотидной последовательности ранее клонированного гена I2C-2 (Ori N. etal., 1997). При проведении ПЦР с данными праймерами синтезировались ПЦР-продукты размером около 1100 п.н. Причем фрагменты одинакового размера синтезировались как на устойчивых, так и на неустойчивых генотипах. Для выявления полиморфизма между устойчивыми и неустойчивыми к фузариозу генотипами томата, ампликон был обработан ретриктазами. При гидролизе ПЦР-продукта рестриктазой Acc I были выявлены отличия между устойчивыми и неустойчивыми генотипами. При анализе рестрикционной картины было выявлено, что сумма размеров рестрикционных фрагментов у устойчивого генотипа значительно превышает размер ПЦР-продукта до рестрикции. Нами было сделано предположение, что с помощью данной пары праймеров синтезируются ПЦР-продукты с нескольких генов-гомологов, входящих в состав кластера I2, и каждый из них имеет свои сайты рестрикции для рестриктазы Acc I. Важно отметить, что структура локуса I2 у устойчивых генотипов достаточно хорошо изучена, и данный локус перенесен в S.lycopersicum из дикого вида S.pimpinellifolium (Segal et al., 1992; Ori N. et al., 1997; Simons et al., 1998; Sela-Buurlage et al. 2001; Couch, 2006). С другой стороны, структура аналогичного локуса у S.lycopersicum не изучена, и остается неизвестным, какие гены-гомологи входят в его состав у неустойчивых генотипов. Анализ клонированных ПЦР-продуктов показал, что с праймерами UP78-LF79 на гомозиготных устойчивых растениях синтезируются два гена гомолога из локуса I2. Один из гомологов имеет два сайта рестрикции для рестриктазы Acc I, а второй не имеет сайтов рестрикции для этой рестриктазы. Секвенирование показало, что один из клонированных генов-гомологов имеет высокую степень гомологии к ранее изученному гену I2C-5 (Simons, G. et al., 1998), входящему в состав локуса I2 S. pimpinellifolium и, также как и ген I2C-5, не имеет сайта рестрикции Acc I в исследованном регионе. Второй клонированный ген-гомолог хотя и имеет высокую степень идентичности к ранее клонированным генам из локуса I2, является уникальным по наличию одного сайта рестрикции Acc I, а также по его положению. Ни один из ранее изученных генов-гомологов локуса I2 не имел сайта рестрикции в положении, характерном для клонированного нами участка ДНК из локуса, аналогичного I2.

Таким образом, нами впервые было показано, что в состав локуса I2 у S. lycopersicum входит, по меньшей мере, два гена-гомолога. Один из них имеет высокую степень сродства к ранее клонированному гену I2C-5, и, возможно, данный ген входит в состав кластера у неустойчивой формы. Второй клонированный нами фрагмент ДНК является ранее неизвестной, уникальной последовательностью ДНК, входящей в состав локуса I2.

На основании обнаруженных различий в строении локуса I2 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата, нами был разработан ДНК-маркер устойчивости томатов ко 2-й расе фузариоза. Созданный ДНК-маркер является кодоминантным, т.е. позволяет выявлять скрытых носителей неустойчивого аллеля – гетерозиготные по данному признаку генотипы. Еще одной важной особенностью предложенного нами маркера является то, что маркерная последовательность находится внутри локуса I2. Таким образом, исключается несцепленное наследование ДНК-маркера и признака.

Для сравнительного анализа локуса Ve у устойчивых и неустойчивых

форм томата, нами были синтезированы две пары праймеров (VVF1+VVR1; VVF2+VVR2), которые позволяют амплифицировать участок гена Ve1 (Kawchuk, 2001) протяженностью около 1500 п.н. Данный участок расположен в начале гена. В результате ПЦР с синтезированными праймерами и на устойчивых, и на неустойчивых генотипах были получены ампликоны одинакового размера. Таким образом, можно сделать вывод, что у неустойчивых генотипов томата локус в целом присутствует, однако его функциональность нарушена в результате изменений на молекулярном уровне. Так как явных различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами непосредственно после ПЦР выявить не удалось, было проведено клонирование ПЦР-продуктов, полученных на устойчивой и неустойчивой формах томата.

Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных участков гена Ve показал высокую степень гомологии по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата. Поиск последовательностей с высокой гомологией к клонированным фрагментам в базе данных GenBank дал схожие результаты на устойчивом и неустойчивом к вертициллезу генотипах. Как и ожидалось, была обнаружена высокая степень гомологии к ранее клонированным генам Ve1 и Ve2. Анализ нуклеотидных последовательностей полученных клонов не выявил никаких крупных (делеций, инсерций, дупликаций) различий между локусами Ve устойчивых и неустойчивых форм томата. Следующим шагом нашей работы был поиск полиморфизма по сайтам рестрикции в этом локусе между устойчивым и неустойчивым генотипами. Обнаружение такого полиморфизма позволило бы создать молекулярный маркер непосредственно на ген Ve. При анализе ПЦР-продукта, полученного с парой праймеров VVF1+VVR1, полиморфизма по сайтам рестрикции между устойчивым и неустойчивым генотипами нами обнаружено не было. ПЦР-продукты, полученные с парой праймеров VVF2+VVR2, были также проверены на полиморфизм по сайтам рестрикции на устойчивых и неустойчивых генотипах. Одна из рестриктаз – Xba I – позволила выявить различия между устойчивыми и неустойчивыми к вертициллезу формами томата. Было выявлено, что в регионе, амплифицируемом с помощью указанной пары праймеров, у неустойчивого генотипа имеется один дополнительный сайт рестрикции для рестриктазы Xba I по сравнению с устойчивым генотипом. Такой сайт возникает благодаря однонуклеотидной замене в последовательности ДНК, в результате чего появляется новый стоп-кодон.

Таким образом, нами показано, что в локусе Ve у неустойчивых генотипов томата (S. lycopersicum) находятся последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологии к ранее изученным генам Ve1 и Ve2, расположенным в аналогичном локусе устойчивых форм. В данном регионе нам удалось выявить полиморфизм по сайту рестрикции Xba I между устойчивыми и неустойчивыми формами томата. На основании выявленного полиморфизма был создан эффективный кодоминантный ДНК-маркер (Рис.20).

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 20 . Рестрикция ПЦР-продуктов с рестриктазой Xba I (1 – Мегана (устойчивый гомозиготный); 2 – Moneymaker (неустойчивый); 3 – Белый налив (неустойчивый); 4 –Ампаро (устойчивый гомозиготный); 5 – Indiko (гетерозигота); 6 – Durason (гетерозигота); 7 –Pitenza (гетерозигота).
Примененный нами методологический подход – сравнительный анализ локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых к фузариозу и вертициллезу генотипов томата – позволил нам выявить нуклеотидные последовательности новых генов-гомологов у неустойчивых форм томата. Анализ данных локусов у неустойчивых форм томата был проведен впервые. На основании выявленных нами различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата по локусам устойчивости к фузариозу и вертициллезу созданы новые эффективные ДНК-маркеры, а на их основе ДНК-диагностикумы. Эти диагностикумы были испытаны на расщепляющихся популяциях и продемонстрировали высокую эффективность при оценке селекционного материала на наличие генов устойчивости к фитопатогенам. Применение таких диагностикумов позволяет снизить затраты и сократить сроки создания устойчивых форм томата в два раза.

3.3. Использование межмикросателлитного полиморфизма для создания ДНК маркеров. Для создания ДНК-маркера на пол хмеля обыкновенного был использован метод анализа межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR-PCR), который продемонстрировал высокую эффективность в ранее проведенных нами исследованиях на этой культуре. Двадцать два ISSR праймера были применены для амплификации ДНК на 53 женских и 33 мужских образцах растений хмеля различного географического происхождения. В результате два праймера после амплификации продемонстрировали специфичные бенды для мужских растений. Эти бэнды были клонированы и секвенированы. На основе этих сиквенсов были созданы пол-специфичные STS маркеры (Рис. 21).

Рис. 21. Результат амплификации STS-маркеров STS-K10 (a) и STS-K22 (b) на мужских и женских образцах хмеля обыкновенного.

Для проведения массового скрининга растительного материала с использованием ДНК-маркеров требуются удобные и высокопроизводительные методики выделения ДНК. Нами были протестированы семь методов выделения ДНК на 8 культурах. В результате часть методик демонстрировала воспроизводимые результаты только на отдельных культурах. В связи с низким содержанием полифенольных соединений и других ингибиторов полимеразной цепной реакции в растительном материале огурца, на этой культуре возможно применение упрощенной методики выделения ДНК, основанной на инкубации материала в слабом растворе щелочи с последующей нейтрализацией его соляной кислотой. Следует отметить, что на этой культуре амплификацию специфичных продуктов отмечали и при экстракции ДНК кипячением в стерильной воде. Однако в целом для всех культур наилучшие результаты показал экспресс-метод выделения ДНК с наличием в экстракционном буфере SDS.

При массовых анализах стадия электрофореза, необходимая для визуализации результатов ПЦР, остается достаточно трудоемкой, занимает до половины времени, необходимого для скрининга популяций, расщепляющихся по маркируемому признаку. Избежать данную стадию, а также автоматизировать детекцию и хранение результатов и предотвратить контаминацию ПЦР-продуктом, позволяет метод флуоресцентного маркирования, основанный на применении молекулярных беконов.

Нами был синтезирован зонд на нуклеотидную последовательность, отсутствующую у неустойчивых форм растений, который используется в комбинации с ранее подобранными праймерами VF+VR (рис. 22). В ходе ПЦР, при наличии устойчивого аллеля, зонд гибридизуется на ДНК-мишени и разрушается Taq-полимеразой, в результате чего флуоресцентная метка освобождается, и мы можем детектировать излучение определенной длины волны.

Рис. 22. Сайты гибридизации праймеров (зеленый) и флуоресцентного зонда (красный) в локусе Ve томата.

1. 
   Адаптированная методика геномной in situ гибридизации позволяет идентифицировать геномный состав межвидовых гибридов лилий, получаемых с использованием 2n-гамет. Установлен механизм формирования 2n-гамет основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). С использованием разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации для лилий впервые установлена возможность создания трехгеномных гибридов (2n=36). Показана возможность преодоления стерильности межвидовых гибридов лилий и получения форм с различным геномным составом при использовании образцов формирующих 2n-гаметы.
   
2. 
   Оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяет проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале.
   
3. 
   Высокоповторяющиеся геномспецифичные последовательности ДНК на примере GenBR-1 (специфичного для генома В) могут быть использованы в качестве молекулярно-цитогенетических маркеров геномов капустных.
   
4. 
   Высокоповторяющиеся последовательности ДНК Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов являются эффективными молекулярно-цитогенетическими маркерами для изучения организации геномов растений. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Прицентромерная локализация ретротранспозонов указывает на невысокую эффективность ДНК маркеров создаваемых на их основе для маркирования хозяйственно- ценных признаков томата. В тоже время для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением C-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.
   
5. 
   Клонирована высокоповторяющаяся последовательность ДНК хмеля – размером 378 п.о., которая является эффективным цитогенетическим маркером для идентификации половых хромосом хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на аутосомах. Для Х и Y хромосом выявлено характерное распределение сайтов гибридизации. Поиск в геномных базах данных не выявил гомологий с ранее клонированными последовательностями ДНК.
   
6. 
   Установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.
   
7. 
   Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри- и межвидовой гибридизации, а также форм растений с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR-маркеров создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.
   
8. 
   Созданы эффективные SCAR маркеры для выявления пола растений хмеля.
   
9. 
   Идентифицированые молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса и молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности Rf4, могут быть использованы в селекционных программах по созданию гибридного риса.
   
10. 
    Клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.
    
11. 
    Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа локусов генов устойчивости устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Сравнительный анализ ДНК последовательностей показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями локусов Ve и I2 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата. У аллеля i2 неустойчивого генотипа S.lycopersicum выявлены последовательность, имеющая высокую степень гомологии к гену I2C-5, и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену I2 S. pimpinellifolium. Создан ДНК маркер гена устойчивости к фузариозному увяданию томата. Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы Xba I между аллелями гена Ve устойчивых и неустойчивых генотипов и на основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS- маркер.
    
12. 
    Установлено наличие Ogura-типа ЦМС, возникшей в растениях капусты пекинской Brassica pekinensis Jusl, в результате межвидовой гибридизации с турнепсом и капустой абиссинской.
    
13. 
    Созданные ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля – на определение пола растений, риса – на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированые условия применения ДНК-маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу позволяют в значительно мере (в два раза) ускорять селекционный процесс по вышеуказанным генам.
    
14. 
    Предложеные оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК позволяют проводить массовый скрининг селекционного материала.
    
15. 
    Разработаные методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК-технологий дают возможность создавать перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, в частности в созданном коммерческом гибриде F₁ Албаши.
    

1. 
   Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim K.B., Tuyl J.M.van. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH).// Genome, 1999, Vol.42,N 4. - P. 681-686.
   
2. 
   Karlov G.I., G.N.Andreeva, I.A. Fesenko, L.I. Khrustaleva Characterization and chromosome location of Ty1-copia group retretransposons in some Alliaceae, Liliaceae and Iridaceae species.// Cytogenetics and Cell Genetics, 1999, v.85, 1-2. P.135.
   
3. 
   Lim, K.B., van Tuyl, J.M., Khrustaleva, L.I., Karlov, G.I. and de Jong, J.H.. INTROGRESSION OF INTERSPECIFIC HYBRIDS OF LILY USING GENOMIC IN SITU HYBRIDIZATION (GISH).// Acta Hort. (ISHS) 2000, 508:105-112
   
4. 
   Karlov G. I., Babina D. V., Tikunov Y. M., Khrustaleva L. I. Chromosome organization of Ty1-copia-like retrotransposons in tomato.// Abs. of Fifth International Solanaceae Conference. Botanical Garden of the University of Nijmegen, 2000, p. 40 – 42.
   
5. 
   Карлов Г.И., Андреева Г.Н., Хрусталева Л.И. Характеристика линии тритикале, несущей пшенично-ржаную транслокацию. С.-х. биотехнология. - М., 2000; Т.1. - С. 39-43.
   
6. 
   Карлов Г.И., Хрусталева Л.И., van Tuyl J.M. Использование геномной in situ гибридизации для изучения гомеологичной рекомбинации в межвидовых гибридах лилий, формирующих 2n-гаметы. С.-х. биотехнология. - М., 2000; Т.1. - С. 44-52.
   
7. 
   Андреева Г.Н., Карлов Г.И., Семенов О.Г., Мохаммед Резаул Карим Характеристика аллоцитоплазматических форм яровой пшеницы T. aestivum на цитоплазме Secale cereale с использованием методов геномной in situ гибридизации и белковых маркеров. С.-х. биотехнология. - М., 2000; Т.1. - С. 53-58.
   
8. 
   Тикунов Ю.М., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Использование межмикросателлитного полиморфизма ДНК для идентификации сортов и видов томата. Междунар.науч.-практ.конф."Селекция и семеноводство овощных культур в XXI в.":[Материалы]. - М., 2000; Т.2. - С. 238.
   
9. 
   Иванова С.В., Долгодворова Л.И., Карлов Г.И., Кучковская Е.В. Морфометрическая и цитогенетическая характеристика гаплоидов томата// Генетика, 2000, т.36, № 1. - с. 52-61.
   
10. 
    Данилова Т.В., Карлов Г.И. Физическая локализация 45S- и 5S-рибосомной ДНК на хромосомах хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.). Материалы конференции Памяти Грегора Менделя. - М., 2001. - С. 32.
    
11. 
    Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК культурного и диких видов томата. C.-х. биотехнология. - М., 2001; Т.2. - С. 27-40.
    
12. 
    Данилова Т.В., Тикунов Ю.М., Weber G., Карлов Г.И. Молекулярное маркирование пола у хмеля (Humulus lupulus L.) с использованием ISSR-ПЦР. C.-х. биотехнология. - М., 2001; Т.2. - С. 47-54.
    
13. 
    Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Изучение межмикросателлитного полиморфизма ДНК видов томата. Материалы конференции Памяти Грегора Менделя. - М., 2001. - С. 136.
    
14. 
    Соловьев А.А., Кирюхова О.Б., Карлов Г.И., Андреева Г.Н., Комахин Р.А., Бабина Д.В. Выделение и цитологическая характеристика моносомно дополненной линии культурного томата со 2-й гомеологичной хромосомой Solanum lycopersicoides. C.-х. биотехнология. - М., 2001; Т.2. - С. 61-67.
    
15. 
    
    жүктеу/скачать 7.09 Mb.
    
    Достарыңызбен бөлісу: