Морфофункциональная характеристика механизмов никотиновой холинергической регуляции нейрон-глиальных взаимодействий и метаболической активности в симпатическом ганглии 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология

Апробация работы

г. Полтава, 1986); VII и VIII конгрессах международной ассоциации морфо-логов (г. Казань, 2004 и г. Орел, 2006); VII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2005); 5-й Всероссийской конференции «Бабу-хинские чтения в Орле» (г. Орел, 2006); Конференциях ГУ НИИ морфологии человека РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии»

(г. Москва, 2005, 2006, 2008), межлабораторной конференции в ГУ НИИ морфологии человека РАМН (декабрь, 2007г.).
Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 8 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 42 рисунками и микрофотографиями, содержит 36 таблиц и одну схему. Список литературы включает 418 источников, из которых 110 отечественных и 308 зарубежных.

Работа выполнена на материале краниальных шейных симпатических ганглиев (КШСГ) половозрелых кроликов породы шиншилла (питомник “Столбовая“). В эксперименте использовано 103 животных, 124 ганглия, проанализировано 3568 симпатических нейронов и 5647 сателлитных глиоцитов.

При работе с экспериментальными животными руководствовались приказами Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. и Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003г. На проведение экспериментов получено разрешение

Комиссии по биоэтике ГУ НИИ морфологии человека РАМН

(Протокол № 3 от.21.04.2005г.)

Экспериментальная модель. Для оценки роли никотиновых холино-рецепторов (нХР) применялось экспериментально индуцированное и управляемое изменение эффективности синаптического влияния через нХР.

С этой целью использовали холинолитик димеколин. Холинолитический эффект препарата заключается в блокировании нХР в синапсах сим-патических нейронов, число которых последовательно возрастает с увеличением дозы ганглиоблокатора (Скок В.И. и соавт.,1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996). Димеколин характеризуется высокой холинолитической активностью, максимальный блокирующего эффект препарата наступает через 1час, с продолжительностью действия около 3-х часов, и слабой выраженностью побочного действия (Шарапов И.М., 1962; Вышинская Т.Е., 1965; Першин Б.Н., 1966).

Эксперимент планировали в соответствии с установленной для кро-ликов фармакодинамикой препарата (Шарапов И.М.1961, 1962; Першин Б.Н., 1966). Применяли однократное подкожное введение ганглиоблокатора в дозах 10, 30 и 50 мг/кг живого веса, первая из которых превышает пороговую дозу и вызывает частичное блокирование, а последняя приводит к практически полному блокированию нХР. После введения препарата в каждой из ука-занных доз в разные сериях опыта материал брали через 1, 3, 5, 7, 9 и 11 часов.

Исследовали:

• 
  рРНК – ключевой параметр белкового синтеза (Grannemann S., Baserga S., 2004; Dresios J. et al., 2006).
  

• 
  Ферментативную систему ЛДГ, которая осуществляет регуляцию субстратного обеспечения энергетических процессов (Зимин Ю.В. и др., 2001; Gladden L., 2004) и принимает участие в ряде других механизмах внутриклеточной регуляции (Popanda O. et al., 1998; Beeckman S., Kanasek E., 1996).
  
• 
  Аденилатные макроэрги (АТФ, АДФ, АМФ), уровень содержания, которых характеризует энергетический статус и общую интеграцию биохимических процессов (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977, 1988; Dzeja P., Terzic A. , 2003).
  

Полученные в нейронах и сателлитных глиоцитах цитохимические сдвиги относили за счет изменений рРНК, так как в цитоплазме нейронов нуклеиновые кислоты в основном представлены рРНК (Гайцхоки В.С., 1980), а в глиоцитах, в которых по существу определяется суммарное количество РНК+ДНК, изменениями глиальной ДНК можно пренебречь, поскольку в зре-лой нервной ткани она характеризуется стабильностью (Peters A., Sethares C., 2004). Объем выборки в контроле и во всех сериях опыта составлял в среднем 100 – 200 клеток каждого типа взятых от отдельного животного.

Активность ЛДГ, Н и М ее изоформ в нейронах и окружающих их сателлитных глиоцитах определяли методом интегральной цитофотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977) на цитофотометре МИФ-1 (фирма ЛОМО) на криостатных срезах после гистохимического окрашивания тетранитро-синим тетразолием по методу Брумберга В.А. и Певзнера Л.З. (1975), позво-ляющему проводить количественную оценку активности фермента. Объем выборки составлял в контроле и в опыте по 150 нейронов и 210 – 300 сателлитных глиоцитов от каждого животного.

Содержание АТФ, АДФ, АМФ в ганглии определяли методом рас-пределительной тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках, с последующим количественным спектрофотометрическим определением раз-деленных нуклеотидов на спектрофотометре СФ-16 (фирма ЛОМО) в УФ диапазоне (260 ммк).

Активность изоферментов ЛДГ определяли в относительных единицах методом фотографической фотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977). Разделение изоферментов осуществляли с помощью диск-элекрофореза в полиакриламидном геле (ПАГ) в микромодификации Панавене Д.П. (1974) после окрашивания нитросиним тетразолием. После фотографирования в максимуме поглощения формазана (569 ммк) на специально подобранную для этой цели Аэрофотопленку, электрофореграммы денситометрировали на микрофотометре ИФО-451 (фирма ЛОМО).

При исследовании всех показателей в контроле и в каждой из серий опыта использовано по 3-5 животных.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием общепринятых методов параметрической (t-критерий, корреляционный ана-лиз) и непараметрической (U-критерий) статистик с помощью компьютерных программ “Microsoft Excel 97”, , “STATISTICA”. При оценке статистичес-кой значимости коэффициентов корреляции (r) применяли преобразование Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение

1. 
   Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на метаболическую активность симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов
   

Такой анализ позволил установить, что при синаптической блокаде нХР динамика формирования метаболических сдвигов в нейронах и соседних с ними сателлитных глиоцитах существенно различается.

В нейронах блокада, независимо от уровня блокирования холинорецеп-торов, вызывает стереотипный цитохимический ответ – выраженные колеба-ния содержания рРНК, которые вместе с ослаблением и окончанием блокиру-ющего воздействия постепенно затухают (рис.1а,б,в). Важной особенностью наблюдаемых колебаний является то, что они происходят на уровне заметно превышающем контрольный.

Отмеченные в цитоплазме нейронов изменения рРНК представляют со-бой в достаточной мере адекватную характеристику функционального потен-циала белок-синтезирующей системы, по крайней мере на уровне трансля-ционных процессов синтеза белка (Grannemann S., Baserga S., 2004; Dresios J. et al., 2006) и свидетельствуют о том, что в ответ на блокаду синаптической передачи через нХР эти процессы в симпатических нейронах заметно активи-зируются.

Именно изменения режима функционирования синаптической передачи являются основной причиной активизации белок-синтезирующего аппарата в нейронах (Gueorguiev V. et al., 2000; Dunckley T., Lukas R., 2003) и продикто-ваны они необходимостью обеспечить материальными ресурсами функцио-нальные и структурные перестройки синаптических образований (Wang H., Tiedge H., 2004).

Таким образом, полученные сдвиги рРНК сами по себе являются прояв-лением метаболического ответа нейронов на изменения внешних условий, связанных с нарушением нормального хода синаптических процессов в ре-зультате блокады синаптической передачи.

Рис.1 Динамика содержания рРНК в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах при разных уровнях блокады никотиновых холинорецепторов

а – незначительное (10 мг/кг) и б – значительное количество (30 мг/кг) первоначально блокированных нХР; в – практически полная блокада (50 мг/кг) нХР. В скобках указаны дозы ганглиоблокатора.

** статистическую достоверность различий в полученных результатах и стандартную ошибку средних значений оценивали по t - критерию с р  005.

Вместе с тем модуляции содержания рРНК в нейронах КШСГ оказы-ваются закономерно связанными с активностью нХР.

В то же время при наличии в ганглии некоторого количества незабло-кированных, и, следовательно, сохраняющих функциональную активность, нХР (через 1 часа после введения ганглиоблокатора в дозах создающих частичную блокаду рецепторов), наблюдается резкий подъем содержания рРНК (рис.1а,б). С позиций предполагаемой роли нХР важно отметить, что величина наблюдаемого при этом сдвига в содержании рРНК оказывается тем больше, чем выше количественный уровень способных к активному функцио-нированию нХР (рис.1).

Кроме того, из сопоставления модуляций при разных условиях блоки-рования следует, что уровень первоначально заблокированных нХР детерми-нирует также и относительную быстроту цитохимического ответа, и размах происходящих при этом колебаний. В самом деле, наблюдаемое максималь-ное увеличение содержания рРНК наступает тем раньше и по величине амплитуды оно тем больше, чем большим является количество сохра-няющихся при данной модели блокады активных нХР (рис.1). Так при минимальном блокировании нХР максимальное отклонение наблюдается через 1 час и его величина относительно контроля составляет 72% (рис.1а). При увеличении численности блокированных нХР максимальное отклонение наблюдается позже, только через 5 часов, и уже со значительно меньшей амплитудой - на 49% выше контрольного уровня, (рис.1б), при полном блокировании максимально возможное отклонение наступают еще позже – через 7 часов и является при этом наименьшим – увеличение только на 35% (рис.1в).

Таким образом, полученные экспериментальные данные дают основа-ния заключить, что нХР в симпатическом ганглии весьма специфично прояв-ляют себя в формировании метаболизма рРНК в нейронах. Не оказывая заметного влияния на базовый уровень этого показателя, характеризующий интактные нейроны, данные рецепторы принимают участие в индуктивных механизмах, которые в ответ на изменения внешних условий запускают дина-мические изменения рРНК в нейрональной цитоплазме и при этом, по всей вероятности, одновременно модулируют необходимый уровень и интенсив-ность цитохимического ответа.

Эффект блокирования нХР проявляется и на морфологическом уровне, что находит свое выражение в структурных перестройках хроматофильной субстанции в цитоплазме нейронов.

Все отмеченные изменения обратимы и, независимо от числа первона-чально заблокированных холинорецепторов, ослабление и окончание блока-ды в последующие сроки (3 – 11 часов) сопровождаются постепенной норма-лизацией хроматофильной субстанции.

Наблюдаемая морфологическая картина позволяет говорить о том, что степень трансформационных изменений хроматофильной субстанции харак-теризует, прежде всего, масштабность количественных модуляций рРНК: зна-чительное увеличение содержания рРНК проявляются в гиперхроматозе, ме-нее выраженные по величине изменения этого показателя, напротив, сопро-вождает умеренный хроматолиз.

Представленные данные, с учетом результатов количественного анали-за цитохимических изменений рРНК и то, что на светооптическом уровне хроматофильная субстанция по существу представляет эргастоплазму ней-рона и ее базофильные гранулы располагаются в местах интенсивного бел-кового синтеза (Pannese E., 1994; Крстич Р.В., 2001), подтверждают конкрет-ный вклад никотиновых холинорецепторов в регуляцию белково-синтезиру-ющего аппарата симпатических нейронов, по крайней мере, на уровне транс-ляции.

Фазный характер количественных сдвигов рРНК в сателлитных глио-цитах скорее всего является частным проявлением общих закономерностей в динамике синтетической активности глиоцитов разных отделов нервной сис-темы, которые при различных воздействиях отвечают, как правило, разно-направленными относительно контрольного уровня модуляциями содержания рРНК (Гейнисман Ю.Я., 1974; Мац В.Н., 1994).

Таким образом, симпатические нейроны и окружающие их глиоциты характеризуются различной метаболической реакцией в ответ на нарушение синаптических процессов, вызванных блокадой.
Нейрон-глиальная метаболическая корреляция при разных уровнях блокирования никотиновых холинорецепторов
В модуляциях содержания рРНК в нейронах и окружающих нейроны сателлитных глиоцитах в условиях частичной блокады, сохраняющей в синапсах некоторое количество незаблокированных и, следовательно, функционально активных нХР, обнаруживается высокая, статистически достоверная положительная корреляционная зависимость (рис.1а,б).

Напротив, при полном блокировании нХР такая корреляционная зависимость между указанными клеточными системами отсутствует (рис.1в).

Высокая согласованность в динамике количественных изменений рРНК между симпатическими нейронами и соседними с ними сателлитными глио-цитами при наличии активных нХР и отсутствие таковой при полном блоки-ровании нХР позволяет полагать, что в симпатическом ганглии существует механизм, координирующий метаболические изменения рРНК в нейронах и глиоцитах. Необходимым компонентом этого механизма координации явля-ется медиаторное взаимодействие с нХР, расположенных в синапсах симпа-тических нейронов.

Таким образом, из анализа полученных данных, следует, что в механиз-мах управления работой симпатического ганглия существует важное функци-ональное звено, представленное никотиновыми холинергическими синапсами (нХР).

На основании полученных экспериментальных данных можно заклю-чить, что, во-первых, синаптический сигнал через нХР оказывает индук-тивное и модулирующее воздействие на активность белок-синтезирующей системы в симпатических нейронах КШСГ вызывая, в ответ на вызванные блокадой изменения синаптической активности, повышение функциональ-ного потенциала этой системы.

Во-вторых, через медиаторное взаимодействие с нХР симпатические нейроны сопрягают свою метаболическую активность с метаболической активностью соседних с ними сателлитных глиоцитов, по крайней мере, на уровне количественных изменений рРНК в этих клетках.
2. Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на энергетические процессы в симпатическом ганглии
Особенности изоферментного спектра ЛДГ интактного ганглия и входящих в его состав симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов
В связи с тем, что спектр изоферментов ЛДГ характеризует высокая органная и тканевая специфичность (Райдер К., Тейлор К., 1983) для решения поставленных в работе задач необходимо было определить в КШСГ кроликов не исследованный до настоящего времени изоферментный состав ЛДГ. На основании полученных электрофореграмм установлено, что в интактном ганглии ферментативная система ЛДГ представлена всеми пятью основными изоферментами (рис.2). Наиболее активны из них анодные фракции ЛДГ-1 и ЛДГ-2, суммарный вклад которых в общую активность ЛДГ составляет более 50% от активности остальных изоформ (ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5).

В связи с этим КШСГ кролика можно отнести к категории органов, в которых превалирует активность, так называемых, изоформ ЛДГ сердечного типа (Райдер К., Тейлор К., 1983; Зимин Ю.В. с соавт., 2001).

Цитохимический анализ изоферментного состава ЛДГ подтверждает основные результаты, полученные при изучении ферментативной системы ЛДГ на уровне симпатического ганглия. Также как и в ганглии, в
Р
ис.2 Изоферментный состав ЛДГ и относительный вклад (в%) каждого изофермента в общую ферментативную активность ЛДГ в интактном симпатическом ганглии.