Морфологическая вариабельность гипоталамуса в обеспечении конституциональной стресс-реактивности (экспериментальное исследование) 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология



бет1/3
Дата02.07.2016
өлшемі1.17 Mb.
#172446
түріАвтореферат диссертации
  1   2   3



На правах рукописи


Потанин Михаил Борисович
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГИПОТАЛАМУСА

В ОБЕСПЕЧЕНИИ КОНСТИТУЦИОНАЛЬНОЙ СТРЕСС-РЕАКТИВНОСТИ

(экспериментальное исследование)

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология




Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Волгоград - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»



Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич


доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич
доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская академия

им. И.М.Сеченова Росздрава»




Защита состоится «_____» _________________ 2008 года в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан «___» ___________ 2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

доктор медицинских наук Н.В. Григорьева


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность.

Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информационная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора общения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека – вот далеко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982; Судаков К.В., 1997, 2002; Крыжановский Г.Н., 1999, 2004; Пшенникова М.Г., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Глазачев О.С., 2006; Oliver G., Wardle J., 1999; Bell M.E. et al., 2002; Sivukhina E.V. et al., 2006; Gibson L.E., 2006].

С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи «Синдром, вызываемый разными повреждающими агентами», теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. На настоящий момент в теории стресса раскрыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс-активирующих и лимитирующих медиаторов, а также ульцирогенные, кардиотропные, иммуномодулирующие, эндокринные и поведенческие эффекты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Котов А.В., 1999; Судаков К.В., 2003; Devries A.C., et al., 1997; Berridge M.J., et al., 1998; Hamano H., et al., 2002; Dube L, et al., 2005; Wu Y.H. et al., 2006; Stone EA, et al., 2006; McCormick CM, et al., 2007].

В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и определяет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002; Бадыштов Б.А., 1998; Соколова Е.Б., с соавт., 2000; Судаков К.В., Юматов Е.А., 2001; Bremner J.D., et al., 1996; Kelley A.E., Berridge K.C., 2002; Pecoraro N., et al., 2004; Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувствительности к действию стрессорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин С.Б., с соавт., 2000; Анохин К.В., Судаков К.В., 2003; Маркина Н.В., с соавт., 2003; Bartolomucci A., et al., 2003; Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003; McGill, et al., 2006; Centeno M.L. et al., 2007; Goto S., et al., 2007; Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].

Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфофункциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом – прежде всего в организации церебральных структур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000; Yehuda R., et al., 1991; Avishai-Eliner S., et al., 2001; Morin SM, et al., 2001; Krady J.K., et al., 2002; Bluthe R.M., et al., 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Inoue K., et al., 2003; Dallman M.F., et al., 2004; Badowska-Szalewska E., et al., 2006; Girotti M., et al., 2006].

Отечественными исследователями были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при конституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распространенных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм. Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность организма и, в итоге, нейроиммуно-эндокринные взаимодействия и органопатологию стрессовой реакции [Писарев В.Б. с соавт., 1990, 2006; Баннов А.Н., 1994; Ерофеев А.Ю., 1995; Смирнов А.В., 1998, 2005; Гуров Д.Ю., 1999, 2005; Фролов В.И., 2004; Капитонова М.Ю. с соавт., 2005, 2007; Морозова З.Ч., 2006; Загребин В.Л., 2007].

За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero A.E., 1995; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1998; Thompson R.H., Swanson L.W., 2003; Okere C.O., Waterhouse B.D., 2004; Kwon M.S., et al., 2006; Ostrander M.M., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Kiss A., 2007; Lowry C.A., et al., 2007].

За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практически важная проблема, как определение особенностей стресс-ассоциированных изменений в тех или иных структурах гипоталамуса у животных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнительном аспекте изменения этих структур при его воспроизведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.

Получение новых данных в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светооптического исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных электронной микроскопии нейронов, нейроглии и других элементов нейронного окружения [Боголепов Н.Н., 2002; Николлс Дж.Г., с соавт., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2007; Bonini P., et al., 2004; Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Block M.L., et al., 2007; Ma S., et al., 2007]. С теоретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографически очерченных ядер и проводников, выделение нейронных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодополняющие при выполнении подобного исследования.

С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфофункциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых структур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.


Цель работы – установить закономерности варьирования отдельных гипоталамических структур у животных с различным уровнем конституциональной стресс-реактивности и уточнить на этой основе участие гипоталамуса в обеспечении силы и выраженности стрессорной реакции.
Задачи исследования.

1. Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

2. Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

3. Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных изменений в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

4. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.

5. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрессорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения гипоталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.


Научная новизна.

На основании сопоставления результатов светооптического, иммуногистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и привлечения методов современного математического анализа результатов морфометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении ядер и полей гипоталамуса, наиболее значимых с позиции формирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, помимо общепризнанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипоталамическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейроны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обладают общим ультрамикроскопическим признаком – сравнительно более высоким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строения ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов.

Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных градиентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной конституциональной стресс-реактивности животных.

На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс-реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с построением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферентации, взаимоотношений между ядрами гипоталамуса с учетом их конституциональных особенностей и параметров последующего стрессорного ответа.


Научно-практическая значимость.

Полученные данные расширяют имеющиеся представления о структурных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной нейроморфологии. Выделение компонента вариабельности в участии отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существенно проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у различных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.

Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и полной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров любой силы, в том числе умеренной.
Положения, выносимые на защиту.

1. На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое – в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, при этом можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс-реактивностью.

2.Особенности исходного строения отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.

3. Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и течение стрессорной реакции.




Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005); Международном конгрессе «Проблемы вегетативной дисрегуляции» (Донецк, 2005); Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); Всероссийской конференции «Новые медицинские технологии» (Волгоград, 2007).

Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета 25 апреля 2008 года.

По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах «Морфология», «Морфологические ведомости», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» и «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенных в действующий «Перечень … ВАК» (медицинские науки, редакция апрель 2008).


Реализация и внедрение результатов исследования.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоградском государственном медицинском университете, Волгоградском государственном университете, Волгоградской государственной академии физической культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской государственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного патолого-анатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области.


Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц, иллюстрирована 62 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований с их обсуждением, заключения и выводов. Список использованной литературы включает в себя 370 источников: 147 отечественных и 233 зарубежных.



МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Специфика настоящего исследования потребовала решения нескольких методических задач:

- максимально адекватного выделения животных с доказанными конституциональными особенностями стресс-реактивности без повреждения головного мозга;

- выделение из большого числа нейроморфологических методик доступного и воспроизводимого набора, на основании которого можно описать различия в строении гипоталамуса у выбранных животных с альтернативной стресс-реактивностью;

- выбора метода и интенсивности стрессорного повреждения, при котором уже имеется морфологический субстрат повреждения гипоталамуса, но еще не утрачена его относительная специфичность, позволяющая количественно оценивать различия между группами;

- выбор адекватного математического подхода для описания происходящих событий в виде модели, пригодной для интерпретации выявленных изменений морфологами.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ, рекомендациями ВОЗ [Червонская Г. П., с соавт., 1998; Zutphen L.F., 1993] и согласован с Локальным независимым этическим комитетом (Протокол №4 от 21 декабря 2004 года).



На основании изложенных принципов после скрининга в основной части работы было проведено сравнительное изучение головного мозга у 20 крыс: по пять в каждой подгруппе в зависимости от стресс-реактивности, вне стресса и после его воспроизведения (табл. 1).

Таблица 1

Общая характеристика материала исследования по сериям

Серии экспериментов

Характеристика серии

Кол-во животных

Скрининговый этап (неинвазивные тесты)

определение уровня

общей неспецифической

реактивности организма

низкий уровень

18

средний уровень

91

высокий уровень

15

определение уровня

хемоиндуцированной

стресс-реактивности

низкий уровень

20

средний уровень

82

высокий уровень

22

Основной этап

интактные

животные

высокая реактивность

5

низкая реактивность

5

Моделирование 24-часового

иммобилизационного стресса

высокая реактивность

5

низкая реактивность

5

Первым тестом для разделения животных на группы было определение универсального критерия стандартизации биомоделей - уровня общей неспецифической реактивности организма. Метод основан на определении болевой (ноцицептивной) чувствительности посредством дозированного электроболевого воздействия [Мулик А.Б., 1993, 2002]. Вторым относительно малоинвазивным тестом стало определение термолабильности животных при действии сверхмалых доз бактериального липополисахарида. Для такого свойства организма предложено соответствующее название - уровень хемоиндуцированной стресс-реактивности [Горизонтов П.Д., 1984]. В результате этого тестирования для исследования было выделено 20 крыс с низким и 22 – с высоким уровнем реактивности.

Сопоставление сочетаемости тестов (конкордантности) показало, что среди 21 животного хотя бы с одним из признаков низкой реактивности у 17 (74%) присутствовали оба признака. Аналогично, среди 22 животных с высоким уровнем хемоиндуцированной стресс-реактивности оказались все 15 животных с высоким уровнем общей неспецифической реактивности организма (конкордантность – 68%).

Для исследования гипоталамуса интактных животных и после воспроизведения стресса из каждой группы крыс отобрано по 10 животных с максимальной экспрессией признаков, то есть минимальным порогом электроболевой вокализации и максимальной термолабильностью – для группы животных с высокой стресс-реактивностью (ВСР) и альтернативными характеристиками – для группы крыс с низкой стресс-реактивностью (НСР).

Стресс моделировали у 5 крыс группы ВСР и у 5 крыс групп НСР путем однократной 24-часовой иммобилизации. С целью верификации стадии стресса проводилось взвешивание органов животных, макро- и микроскопическое исследование желудочно-кишечного тракта, тимуса и надпочечников.

Непосредственно после эвтаназии головной мозг животных извлекали щадящим образом из черепа, помещали в 10%-ный раствор нейтрального забуференного формалина (рН=7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P0 по Сентаготаи и тангенциальной – от борозды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал дофиксировали в течение 24 ч. С фронтальной поверхности блока В и окципитальной поверхности блока А начинали приготовление серийных срезов толщиной 5-7 микрон – 200-240 для блока В и 100-150 – для блока А. Каждый пятый срез наклеивали на предметные стекла в порядке их получения и маркировали. Это позволяло воспроизвести стререометрическую архитектонику гипоталамуса от фронта А1 до Р4,0 в координатах Хорслей-Кларка, то есть целиком [Paxinos G., Watson C., 1986]. Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы промежуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson C. (1996) и Swanson L.W. (1998).

Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (POM) и латерального преоптических (POL), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоптического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярного (PV) ядер. Помимо ядер, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности - ретрохиазмалъная (RCA).

В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальное (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части. Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.

Латеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляющие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса нейропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах P1,5-P3,0.

Элементы маммилярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, обнаруживали в сечениях Р3,0 – P4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамаммилярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) части премаммилярных ядер, латеральное маммилярное ядро (ML), медиальная (MMm) и латеральная (MMl) части медиального маммилярного ядра. В связи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления MMl у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему маммило-таламическому тракту.

Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002] с использованием автоматического анализатора изображений «Видеотест-Морфо» (СПб, Россия). В каждом ядре раздельно определяли объемную долю нейронов (%), среднее число нейронов в 1 мм3 ткани, средние объемы (СО) перикариона нейронов и нейронного окружения (мкм3), их отношение, а также среднее число граничных нейронов и астроглиоцитов в окружении перикариона нейрона. Выраженность глиальной реакции оценивали по среднему численному соотношению глия/нейрон, среднему размеру ядер глиоцитов и средней суммарной яркости иммунопозитивного материала после окраски на макрофагальный антиген и кислый глиальный протеин.

Результаты при исследовании областей, наиболее «актуальных» по результатам предшествующего анализа, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН. После указания границ объекта и его логического центра (им был выбран геометрический центр ядра) программа самостоятельно разбивала объект на выбранное число секторов и зон. Для нейронов нами было эмпирически подобрано 36 секторов и 10 зон – всего 360 участков (рис. 2). В качестве первичного материала получали матрицу секторального и радиального распределения тинкториальной плотности, в качестве окончательного – коэффициенты, характеризующие графическую функцию распределения:



Достарыңызбен бөлісу:
  1   2   3




©dereksiz.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет