Морфологическая вариабельность гипоталамуса в обеспечении конституциональной стресс-реактивности (экспериментальное исследование) 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич

им. И.М.Сеченова Росздрава»

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

доктор медицинских наук Н.В. Григорьева

Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информационная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора общения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека – вот далеко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982; Судаков К.В., 1997, 2002; Крыжановский Г.Н., 1999, 2004; Пшенникова М.Г., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Глазачев О.С., 2006; Oliver G., Wardle J., 1999; Bell M.E. et al., 2002; Sivukhina E.V. et al., 2006; Gibson L.E., 2006].

С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи «Синдром, вызываемый разными повреждающими агентами», теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. На настоящий момент в теории стресса раскрыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс-активирующих и лимитирующих медиаторов, а также ульцирогенные, кардиотропные, иммуномодулирующие, эндокринные и поведенческие эффекты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Котов А.В., 1999; Судаков К.В., 2003; Devries A.C., et al., 1997; Berridge M.J., et al., 1998; Hamano H., et al., 2002; Dube L, et al., 2005; Wu Y.H. et al., 2006; Stone EA, et al., 2006; McCormick CM, et al., 2007].

В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и определяет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002; Бадыштов Б.А., 1998; Соколова Е.Б., с соавт., 2000; Судаков К.В., Юматов Е.А., 2001; Bremner J.D., et al., 1996; Kelley A.E., Berridge K.C., 2002; Pecoraro N., et al., 2004; Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувствительности к действию стрессорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин С.Б., с соавт., 2000; Анохин К.В., Судаков К.В., 2003; Маркина Н.В., с соавт., 2003; Bartolomucci A., et al., 2003; Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003; McGill, et al., 2006; Centeno M.L. et al., 2007; Goto S., et al., 2007; Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].

Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфофункциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом – прежде всего в организации церебральных структур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000; Yehuda R., et al., 1991; Avishai-Eliner S., et al., 2001; Morin SM, et al., 2001; Krady J.K., et al., 2002; Bluthe R.M., et al., 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Inoue K., et al., 2003; Dallman M.F., et al., 2004; Badowska-Szalewska E., et al., 2006; Girotti M., et al., 2006].

Отечественными исследователями были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при конституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распространенных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм. Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность организма и, в итоге, нейроиммуно-эндокринные взаимодействия и органопатологию стрессовой реакции [Писарев В.Б. с соавт., 1990, 2006; Баннов А.Н., 1994; Ерофеев А.Ю., 1995; Смирнов А.В., 1998, 2005; Гуров Д.Ю., 1999, 2005; Фролов В.И., 2004; Капитонова М.Ю. с соавт., 2005, 2007; Морозова З.Ч., 2006; Загребин В.Л., 2007].

За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero A.E., 1995; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1998; Thompson R.H., Swanson L.W., 2003; Okere C.O., Waterhouse B.D., 2004; Kwon M.S., et al., 2006; Ostrander M.M., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Kiss A., 2007; Lowry C.A., et al., 2007].

За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практически важная проблема, как определение особенностей стресс-ассоциированных изменений в тех или иных структурах гипоталамуса у животных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнительном аспекте изменения этих структур при его воспроизведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.

Получение новых данных в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светооптического исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных электронной микроскопии нейронов, нейроглии и других элементов нейронного окружения [Боголепов Н.Н., 2002; Николлс Дж.Г., с соавт., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2007; Bonini P., et al., 2004; Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Block M.L., et al., 2007; Ma S., et al., 2007]. С теоретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографически очерченных ядер и проводников, выделение нейронных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодополняющие при выполнении подобного исследования.

С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфофункциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых структур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.

1. Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

2. Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

3. Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных изменений в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

4. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.

5. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрессорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения гипоталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.

На основании сопоставления результатов светооптического, иммуногистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и привлечения методов современного математического анализа результатов морфометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении ядер и полей гипоталамуса, наиболее значимых с позиции формирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, помимо общепризнанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипоталамическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейроны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обладают общим ультрамикроскопическим признаком – сравнительно более высоким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строения ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов.

Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных градиентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной конституциональной стресс-реактивности животных.

На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс-реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с построением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферентации, взаимоотношений между ядрами гипоталамуса с учетом их конституциональных особенностей и параметров последующего стрессорного ответа.

Полученные данные расширяют имеющиеся представления о структурных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной нейроморфологии. Выделение компонента вариабельности в участии отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существенно проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у различных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.

Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и полной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров любой силы, в том числе умеренной.
Положения, выносимые на защиту.

1. На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое – в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, при этом можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс-реактивностью.

2.Особенности исходного строения отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.

3. Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и течение стрессорной реакции.

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005); Международном конгрессе «Проблемы вегетативной дисрегуляции» (Донецк, 2005); Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); Всероссийской конференции «Новые медицинские технологии» (Волгоград, 2007).

Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета 25 апреля 2008 года.

По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах «Морфология», «Морфологические ведомости», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» и «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенных в действующий «Перечень … ВАК» (медицинские науки, редакция апрель 2008).

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоградском государственном медицинском университете, Волгоградском государственном университете, Волгоградской государственной академии физической культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской государственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного патолого-анатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области.

Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц, иллюстрирована 62 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований с их обсуждением, заключения и выводов. Список использованной литературы включает в себя 370 источников: 147 отечественных и 233 зарубежных.

- максимально адекватного выделения животных с доказанными конституциональными особенностями стресс-реактивности без повреждения головного мозга;

- выделение из большого числа нейроморфологических методик доступного и воспроизводимого набора, на основании которого можно описать различия в строении гипоталамуса у выбранных животных с альтернативной стресс-реактивностью;

- выбора метода и интенсивности стрессорного повреждения, при котором уже имеется морфологический субстрат повреждения гипоталамуса, но еще не утрачена его относительная специфичность, позволяющая количественно оценивать различия между группами;

- выбор адекватного математического подхода для описания происходящих событий в виде модели, пригодной для интерпретации выявленных изменений морфологами.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ, рекомендациями ВОЗ [Червонская Г. П., с соавт., 1998; Zutphen L.F., 1993] и согласован с Локальным независимым этическим комитетом (Протокол №4 от 21 декабря 2004 года).

Сопоставление сочетаемости тестов (конкордантности) показало, что среди 21 животного хотя бы с одним из признаков низкой реактивности у 17 (74%) присутствовали оба признака. Аналогично, среди 22 животных с высоким уровнем хемоиндуцированной стресс-реактивности оказались все 15 животных с высоким уровнем общей неспецифической реактивности организма (конкордантность – 68%).

Для исследования гипоталамуса интактных животных и после воспроизведения стресса из каждой группы крыс отобрано по 10 животных с максимальной экспрессией признаков, то есть минимальным порогом электроболевой вокализации и максимальной термолабильностью – для группы животных с высокой стресс-реактивностью (ВСР) и альтернативными характеристиками – для группы крыс с низкой стресс-реактивностью (НСР).

Стресс моделировали у 5 крыс группы ВСР и у 5 крыс групп НСР путем однократной 24-часовой иммобилизации. С целью верификации стадии стресса проводилось взвешивание органов животных, макро- и микроскопическое исследование желудочно-кишечного тракта, тимуса и надпочечников.

Непосредственно после эвтаназии головной мозг животных извлекали щадящим образом из черепа, помещали в 10%-ный раствор нейтрального забуференного формалина (рН=7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P₀ по Сентаготаи и тангенциальной – от борозды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал дофиксировали в течение 24 ч. С фронтальной поверхности блока В и окципитальной поверхности блока А начинали приготовление серийных срезов толщиной 5-7 микрон – 200-240 для блока В и 100-150 – для блока А. Каждый пятый срез наклеивали на предметные стекла в порядке их получения и маркировали. Это позволяло воспроизвести стререометрическую архитектонику гипоталамуса от фронта А1 до Р4,0 в координатах Хорслей-Кларка, то есть целиком [Paxinos G., Watson C., 1986]. Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы промежуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson C. (1996) и Swanson L.W. (1998).

Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (POM) и латерального преоптических (POL), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоптического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярного (PV) ядер. Помимо ядер, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности - ретрохиазмалъная (RCA).

В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальное (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части. Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.

Латеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляющие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса нейропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах P1,5-P3,0.

Элементы маммилярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, обнаруживали в сечениях Р3,0 – P4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамаммилярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) части премаммилярных ядер, латеральное маммилярное ядро (ML), медиальная (MMm) и латеральная (MMl) части медиального маммилярного ядра. В связи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления MMl у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему маммило-таламическому тракту.

Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002] с использованием автоматического анализатора изображений «Видеотест-Морфо» (СПб, Россия). В каждом ядре раздельно определяли объемную долю нейронов (%), среднее число нейронов в 1 мм³ ткани, средние объемы (СО) перикариона нейронов и нейронного окружения (мкм³), их отношение, а также среднее число граничных нейронов и астроглиоцитов в окружении перикариона нейрона. Выраженность глиальной реакции оценивали по среднему численному соотношению глия/нейрон, среднему размеру ядер глиоцитов и средней суммарной яркости иммунопозитивного материала после окраски на макрофагальный антиген и кислый глиальный протеин.

Результаты при исследовании областей, наиболее «актуальных» по результатам предшествующего анализа, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН. После указания границ объекта и его логического центра (им был выбран геометрический центр ядра) программа самостоятельно разбивала объект на выбранное число секторов и зон. Для нейронов нами было эмпирически подобрано 36 секторов и 10 зон – всего 360 участков (рис. 2). В качестве первичного материала получали матрицу секторального и радиального распределения тинкториальной плотности, в качестве окончательного – коэффициенты, характеризующие графическую функцию распределения: