Квитко К.В., Мигунова А.В. Одноклеточные зеленые водоросли - симбионты беспозвоночных животных

Квитко К.В., Мигунова А.В. Одноклеточные зеленые водоросли - симбионты беспозвоночных животных

Широко известны классические примеры симбиозов хлорелло-подобных водорослей с гидрой (Hydra viridis) и инфузорией (Paramecium bursaria). Данному вопросу были посвящено около четверти монографии1987 года D.C.Smith & A.E.Duglas “The Biology of Symbiosis”. Еще ранее был на эту тему написан обзор по симбиозу в парах «растение-животные». Функции хозяина в этом случае осуществляют животные от Protozoa до Uro­chordata, а в роли симбионтов обычно выступают фотосинтезирующие организмы: цианобак­терии, зеленые водоросли, диатомовые, динофлагелляты (Trench, 1979). После этих обзоров список примеров симбиоза зеленых водорослей с клетками животных многократно возрос. Хотя, по-прежнему, первые два упомянутые случая остаются наиболее популярными примерами симбиотических систем. Вместе с тем, примеры удивительного симбиоза столь многочисленны, что перед изложением наших данных, необходимо дать общую картину данного явления.

Прежде всего, список водорослей, способных установить длительное сосуществование с клетками беспозвоночных (Protozoa и Methazoa) велик и разнообразен. Наиболее изученные среди них представители Dinophyceae и Chlorophyceae, которые способны колонизовать в качестве хозяев как многоклеточных животных (губки, плоские черви и моллюски, кишечно-полостные), так и простейших. Но для тех случаев, когда в качестве хозяев выступают Protozoa, разнообразие групп симбионтов гораздо шире: Haptophyceae, Cryptophyceae, Chrysophyceae, Prasinophyceae (Smith & Duglas, 1987).

В экспедициях на Белое Море мы нашли два примера такого симбиоза, паразитизм Choricystis sp. в моллюсках Mytilus edulis и мутуалистический симбиоз инфузории Paramecium bursaria и Chlorella sp. Об этом и пойдет речь в данном сообщении при изложении наших беломорских экспериментов.

В ходе 15 лет (с 1984 г.) кафедрой микробиологии Санкт-Петербургского Университета, совместно с Ю.С.Миничевым, проводились исследования природных и искусственных поселений Mytilus edulis на Белом море на предмет водорослей-симбионтов. Побудительным стимулом послужили сначала наблюдения а, затем, публикации Н.В.Максимовича с сотрудниками, описывавшие зеленых вселенцев в тканях мидий. В природных поселениях мидий вблизи плантаций марикультуры были обнаружены водоросли - паразитические симбионты мидий. Согласно морфологическим критериям идентификации (Komarek, Fott, 1983) мы описали водоросль - изолят из мидий как Choricystis sp. (Андреева и др., 1988), пресноводный род, отличающийся от Coccomyxa по отсутствию слизи. Мы назвали это явление «хорициститом», т. к. носительство водорослей сопровождалось поражением структуры аддуктора, полуоткрытой раковиной, изъянами в краях створки. У зараженных мидий нарушаются процессы роста и гаметогенеза. По своему воздействию на моллюска эти водоросли сходны с Coccomyxa parasitica, найденной в гемоцитах и тканях Placopecten magellanicus (Naidu, 1971; Stevenson, South, 1975).

Для описания природного разнообразия симбионтов мы решили использовать иммунофлюоресцентный способ идентификации клеток микроорганизмов Культура водоросли, паразита мидии, которую мы использовали в качестве источника поверхностных антигенов - изолят Ф-1-1, штамм с большой долей бобовидных клеток. Специфическая поликлональная сыворотка с антителами к поверхностным антигенам водоросли была получена путем иммунизации кроликов. Гомология изолятов из мидий была однозначна по 5-ти признакам, неспецифическое сходство со шт.Ф-1-1 найдено у фикобионтов из лишайников. Штамм Ф-1-1 был защищен авторским свидетельством (Квитко и др., 1989) как источник антигенов для осуществления идентификации паразитических водорослей - обитателей мидий. У иных водорослей симбиотического происхождения серологического сходства не было найдено. Частота случаев паразитического симбиоза оказалась пропорциональна степени опреснения в банках протоки Подпахта, но это не могло объяснить высокой частоты этого заболевания на банке о. Матренин. К сожалению, на этом работа прервалась, хотя коллекция изолятов Choricystis sp. поддерживается и сыворотки еще сохранились. Сейчас имеются в банках данных сиквенсы свободноживущих Choricystis minor, можно достать культуру паразита Placopecten magellanicus и при возобновлении изучения популяций этого симбионта будет реально планировать современные подходы установления видового и клонового разнообразия (риботипирование), чтобы подтвердить или отвергнуть найденное единообразие.

Мутуалистический симбиоз инфузории Paramecia bursaria и Chlorella sp. интересен тем, что он оказался тройственным союзом. В большей части культур инфузорий и во всех водах, где мы находили эти “зеленые парамеции”, мы находим альгофаг, вирус из группы Chlorovirus, семейства Phycodnaviridae Это один из самых крупных вирусов с линейной ДНК, он сходен с вирусами, находимыми у Chlorophyta (Chlorella sp. из H. viridis), Prasinophyceae, (Micromonas pusilla), Prymnesiophyceae (Chrysochromulina brevifillum) и Phaephyceae (Ectocarpus siliculosis и семь других видов). За исключением хозяев рода Chlorovirus, все остальные водоросли – свободноживущие формы. Детально изучены вирусы Micromonas pusilla и Ectocarpus siliculosis, для них отмечено наличие широкой изменчивости вирусов и их хозяев, В изучаемой нами системе, для симбионтов Paramecia bursaria характерна обратная картина – как и для хорицистиса – единообразие по признакам протеома (Linz et al., 2000, Мигунова, 2002). В последние годы, в результате геномной дактилоскопии по гену 18S рРНК нами выявлены сходство штаммами внутри групп и четкие отличия 2-х экотипов зоохлорелл. При определении сходства нуклеотидных последовательностей этих генов 18S рРНК с известными последовательностями для этого гена разных видов Chlorella установлено, что зоохлореллы 2-х экотипов ближе всего к группе Ch. vulgaris, Ch. sorokinianа, Ch. lobophora. Показано, что все изученные штаммы северного и южного экотипа отличаются наличием интрона в начале гена 18S рРНК от этих свободноживущих видов Chlorella, штаммы южного экотипа отличаются от штаммов северного экотипа наличием интрона на срединном участке этого гена. Мы предполагаем, что наличие интронов у симбионтов может отражать тенденцию к усложнению генома при переходе к симбиотической форме существования.

Таким образом, создается впечатление, что симбиоз хлорелл и, особенно, симбиоз при участии альгофагов, специфичных для этих хлорелл, характеризуется высокой степенью консерватизма в пределах экотипа и резкими различиями групп симбионтов между экотипами. Выяснением справедливости этого предположения мы (и наши ученики) занимаемся в последние годы. С одной из таких работ Вы сможете ознакомиться в стендовом сообщении И.Н.Гапоновой.

К концу опытов максимальных размеров достигали эмбрионы, выращенные в условиях естественной гидродинамики (таблица).

Наименее благоприятными для роста оказались условия ламинаризированного течения. Полученные результаты согласуются с известными фактами, свидетельствующими, что турбулизация способствует лучшему росту литоральных водоросли. Однако в условиях избыточных гидродинамических нагрузок скорость роста может снижаться.

Объект наших исследований – беломорская полихета Nereis virens принадлежит к наименее изученной с точки зрения молекулярных механизмов развития группе Lophotrochozoa. Однако именно в этой группе разнообразие типов животных и разнообразие планов строения их тела особенно велико. Понимание организации генетических программ развития лофотрохозойных животных крайне важно для понимания молекулярных механизмов морфологической эволюции. Полихеты (тип Аннелида) относят к наиболее анцестральным представителям лофотрохозойных животных. Особый интерес представляет изучение экспрессии Нох-генов у гомономно сегментированных животных, к которым относится эррантная полихета Nereis virens, поскольку, как предполагают, они морфологически близки к общему предку лофотрохозойных животных.

В нашем исследовании анализировался характер экспрессии Нох гена срединной группы – Nvi-hох6 в развитии полихеты Nereis virens.

Экспрессия гена Nvi-hox6 анализировалась на различных стадиях развития личинки Nereis virens и у 4-10 сегментных ювенильных червей. Основным методом изучения являлся метод гибридизации in situ на тотальных препаратах (WMISH). Сбор и фиксация личинок осуществлялись в июне-июле 2003 года на МБС СПбГУ, о. Средний.

Было показано, что ген Nvi-hox6 не экспрессируется на стадии трохофоры. Экспрессия данного гена впервые детектируется на стадии ранней метатрохофоры (119 часов развития) в нескольких неповерхностных клетках, лежащих на срединной линии, на границе между третьим сегментом и пигидиальной зоной. Характер экспрессии сохраняется на последующих стадиях средней и поздней метатрохофоры (до 177 часов). К началу стадии нектохеты эта экспрессия затухает.

У поздней нектохеты (298 часов развития) появляется новый домен экспрессии гена Nvi-hox6. Экспрессия этого гена обнаруживается в поверхностных клетках постериальной зоны роста, и домен экспрессии формирует кольцо. Это кольцо сохраняется в период формирования четвертого (первого постларвального) сегмента и у четырехсегментного ювенильного червя. По мере формирования новых сегментов, высокий уровень экспрессии отмечается в каждом вновь образованном сегменте. Уровень экспрессии в остальных постларвальных сегментах начинает снижаться и вскоре формируется постериально-антериальный градиент экспрессии Nvi-hox6.

Таким образом, экспрессия гена Nvi-hox6 в развитии Nereis virens имеет 2 фазы. Первая фаза реализуется во время стадии метатрохофоры и, по-видимому, маркирует границу между средней и задней кишкой. Эта функция не связана с векториальным паттернированием переднезадней оси личинки и является примером коопции. Экспрессии данного гена в зоне роста нектохеты и постларвальных сегментах ювенильного червя сходна с экспрессией ряда других Нох-генов на этих стадиях (Nvi-hox4, Nvi-lox5, Nvi-post2). Мы предполагаем, что градиенты экспрессии различных Нох-генов у полихеты Nereis virens определяют позиционные значения каждого из многочисленных сегментов.

Бегас О.С., Широкова В.Н., Князев Н.А., Самойлович М.П. Выявление консервативных антигенов у беспозвоночных и примитивных хордовых с помощью моноклональных антител

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт

Задачей исследований было изучение экспрессии антигенов, распознаваемых МКАТ, полученными против антигенов Hydra vulgaris, у представителей разных таксономических групп беспозвоночных животных и у примитивных хордовых.

В работе использовали панель из 20-ти МКАТ, полученных против антигенов H. vulgaris. Объектами исследований служили представители различных групп беспозвоночных, а также примитивные хордовые. Использовали клеточные суспензии, гомогенат тканей и гемолимфу. Исследования проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа, твердой фазой служила нитроцеллюлоза.

Три антигена, связывающие МКАТ 1A8, 3G11 и 4A10, являются видоспецифичными для H. vulgaris. Три антигена, распознаваемые МКАТ 4А7, 2D2, 3B10 встречаются у близкородственных видов рода Hydra, относящихся к группе Vulgaris. Их следует обозначить, как группоспецифичные. Один из исследуемых антигенов, реагирующий с МКАТ 4G4, экспрессируется только у гидроидных полипов. Антиген, связывающий МКАТ 4G3, выявлен у представителей нескольких классов кишечнополостных, и является консервативным в пределах этого типа.

Два антигена, выявляемые МКАТ 4С3, 4Н3, являются высококонсервативными, так как обнаружены почти у всех рассмотренных видов беспозвоночных и примитивных хордовых животных. Ряд антигенов мозаично представлен у исследованных животных.

Консервативность антигенных молекул может свидетельствовать о их высоком функциональном значении, вследсвтие чего эти белки не претерпевают принципиальных изменений в ходе эволюции. В то же время мозаичная экспрессия отдельных антигенов может быть результатом связывания МКАТ с белками сходной конформации, но которые при этом не являются консервативными.

Среди антигенов, представленных у H. vulgaris, наряду с видо- и группоспецифичными молекулами выявлены высоко консервативные антигены, которые сохранились в процессе эволюции у беспозвоночных животных с более сложным тканевым строением, а также у примитивных хордовых.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 02-04-49120).

В ходе личиночного развития полихет и при метаморфозе в ювенильную форму происходят существенные морфогенетические изменения. Очевидно, что все они, так или иначе, связаны с изменением формы клеток, реоранжировками и, вероятно, с клеточными делениями.

Метаморфоз – одна из ключевых стадий в онтогенезе полихет, в ходе него создаются предпосылки для организации тела животного на весь постларвальный период онтогенеза. При этом вероятнее всего, активируются новые программы функционирования и построения постларвального тела. Именно в этом смысле Петр Павлович Иванов понимал первичную гетерономность сегментов. Он показал (Iwanoff, 1928), что у некоторых видов Serpullidae и Spionidae во время метаморфоза клетки предпигидиальной зоны дедифференцируются и вступают в активный митотический цикл. Таким образом, формируются предшественники зоны роста.

В настоящей работе мы предприняли попытку оценить динамику клеточных популяций в ходе личиночного развития, метаморфоза и постларвального развития у беломорской полихеты Nereis virens и средиземноморской Platynereis dumerilii. Для этого на разных стадиях онтогенеза животных инкубировали в морской воде содержащей бромдезоксиуредин (BrdU) – меченый предшественник ДНК. Включившийся во время фазы S клеточного цикла BrdU выявляли иммуноцитохимическими методами.

Динамика клеточных популяций у этих двух полихет в целом имеет схожий характер. Личиночные стадии – трохофора и метатрохофора характеризуются высоким пулом меченых клеток в развивающемся простомиуме, стомодеуме и вентральной пластинке, включая ее латеральные участки. Во время развития нектохеты высокая плотность клеток с сигналом отмечена главным образом в формирующейся дефинитивной вентральной нервной цепочке, в параподиях и на заднем конце тела, в начинающих формироваться пигидиальных лопастях.

В ходе метаморфоза, при переходе к постларвальному развитию зона меченых BrdU клеток появляется в передней трети пигидия. Вероятнее всего, именно эти клетки составят зону роста, и будут служить источником клеточного материала для последующего формирования постларвальных сегментов. При более длительном времени инкубации в BrdU была отмечена повышенная пролиферативная активность в только что сформированных сегментах по сравнению с более старшими передними сегментами. Скорее всего, это связано с тем, что вновь сформированные за счет деятельности клеток зоны роста сегменты продолжают расти.

Таким образом, для развития сегментов у полихет сем. Nereidae характерна большая динамика клеточных популяций, особенно на стадиях ларвального и раннего постларвального развития.

Настоящая работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования РФ PD02-1.4-360.

В случае регенерации у полихет описаны два варианта: 1) при регенерации переднего конца тела (если таковая возможна) одновременно восстанавливаются простомиум, перистомиум и все передние сегменты, соответствующие ларвальным; 2) при регенерации заднего конца сначала восстанавливаются пигидиальные структуры и предпигидиальная зона роста, после чего сегменты тела формируются субтерминально и последовательно.

Ряд авторов считают, что у полихет, подобно плоским червям, имеется особая популяция стволовых клеток или необластов, которые в случае повреждения способны дифференцироваться в любой клеточный тип и, мигрируя к месту повреждения, принимать участие в восстановлении тканей.

Процесс задней регенерации во многом напоминает обычный рост. Однако неясным остается вопрос о регенеративных потенциях животного на разных стадиях ларвального и постларвального развития, а также о клеточных источниках вторично формирующейся зоны роста и её действительной роли в развитии сегментов.

В настоящей работе мы рассматриваем регенерацию нереид на примере двух полихет – Nereis virens и Platynereis dumerilii. При отрезании головы - регенерации передних структур у обоих видов не происходит. В случае удалении пигидия и части постларвальных сегментов у ювенильного червя примерно со вторых суток после операции начинает формироваться пигидий с циррами. Только после восстановления пигидия начинают последовательно образоваться новые сегменты. В экспериментах с поздними личинками (нектохеты в конце метаморфоза) формирование постларвальных сегментов происходило при отрезании одних лишь пигидиальных структур. Если удалялся один или несколько ларвальных сегментов – регенерации не происходило и животное гибло.

Для оценки динамики клеточных популяций на разных стадиях нами был использован метод инкубации животных в растворе меченого предшественника ДНК - бромдезоксиуридина (BrdU) - с последующим выявлением сигнала методами иммуноцитохимии.

При регенерации нереид не происходит полного закрытия раны покровным эпителием. На протяжении всего процесса заживления и восстановления кишка сообщается с внешней средой, и новое анальное отверстие формируется на ранних стадиях регенерации. Сразу после операции отмечено сокращение кольцевой мускулатуры, стягивающей края раны. В первые часы происходит процесс замыкание эпителиальных слоев эктодермы и энтодермы, после чего начинаются процессы формирования пигидия. На этой стадии в заднем конце червя обнаружено большое количество меченных BrdU клеток. По мере формирования пигидиальных лопастей становится ясно различима зона роста впереди пигидия. Кроме того, сильный сигнал отмечен в основаниях формирующихся цирр. Меченые клетки отмечены в покровном эпителии в разном количестве вдоль дорсо-вентральной оси. На стадии регенерации суток после операции, в момент, предшествующий наиболее активным формообразовательным процессам в пигидиальной области, клетки наиболее активно синтезируют ДНК на вентральной стороне животного.

Кроме зоны роста, восстанавливающейся во время регенерации за счет клеток покровного эпителия, расположенного непосредственно в близи раны, у исследуемых нереид, нами не было обнаружено других очагов активной пролиферации. Таким образом, свидетельств участия особых стволовых клеток типа необластов в восстановлении утраченных частей у нереид нами получено не было.

Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования РФ PD02-1.4-360.