Образовательная программа «6D060722- молекулярная и клеточная биология»

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

5'UTR – 5'-untranslated region

3'UTR – 3'untranslated region

AJCC – American Joint Committee on Cancer

CDS – coding sequence

CIMP – CpG island methylator phenotype

CIN – Chromosomal instability

dsRBD – double stranded RNA binding domain

ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay

HITS-CLIP - high-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation

L mir – длина микроРНК

MSI – microsatellite instability

PAR-CLIP - photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation

pSILAC - Stable isotope labelling with amino acids in cell culture

qPCR - quantitative real time polymerase chain reaction

TNM – tumor- node-metastasis

RACE – Rapid amplification of 5’complementary DNA ends

RNA-Seq – high-throughput sequencing technologies

RIIID – Rnase III domain

siRNA – small interfering RNA

ssRNA – single stranded RNA

s/l - количество сайтов на определенную длину мРНК

UICC – Union for International Cancer Control

5ФУ – 5 фторурацил

н. - нуклеотид

При-микроРНК – первичная микроРНК

Пре-микроРНК – микроРНК прекурсор

РТК — рак толстой кишки

РСК – роковые стволовые клетки

СК – стволовые клетки

Задачи исследования.

1. 
   1. Определить гены, ассоциированные с развитием рака толстой кишки, и описать их характеристики.
   
2. 
   2. Определить микроРНК, ассоциированные с развитием рака толстой кишки, и описать их характеристики.
   
3. 
   3. Найти сайты связывания межгенных микроРНК с мРНК генов, ответственных за развитие рака толстой кишки, и изучить особенности их связывания.
   

5. Изучить различия между сайтами связывания, предсказанными программами RNAhybrid, TargetScan и miRanda.

6. Изучить филогенетическую консервативность сайтов, расположенных в белок кодирующей последовательности мРНК.

Научная новизна исследования.

Впервые создана база данных 142 генов и 38 микроРНК, которые ассоциированы с развитием рака толстой кишки. Для определения важных микроРНК в онкогенезе рака толстой кишки была создана методика отбора сайтов связывания микроРНК на основе программы RNAhybrid. С помощью этой методики были предложены 185 ранее не описанных сайтов для 120 микроРНК, которые могут быть основными в регуляции генов, ответственных за развитие рака толстой кишки.

Создана новая классификация сайтов связывания по вкладу микроРНК в энергию гибридизации. Впервые было установлено, что во всех сайтах предсказанных программой RNAhybrid, микроРНК связываются с неспаренными нуклеотидами во вторичной структуре мРНК, которые служат основой для образования связи между микроРНК и мРНК.

Впервые сравнены программы RNAhybrid, miRanda и TargetScan по способности предсказывать сайты связывания с высокой комплементарностью и установлены недостатки программы TargetScan в выявлении таких сайтов.

Впервые установлена филогенетическая консервативность сайтов связывания микроРНК, локализованных в кодирующей области мРНК.

Теоретическая значимость исследования. В результате исследования предложены гены и микроРНК, ассоциированные с развитием рака толстой кишки, которые расширяют фундаментальные представления об этом заболевании. В работе показано наличие в геноме человека сайтов связывания микроРНК с высокой комплементарностью. На основе сайтов, отобранных по разработанной нами методике, были показаны отличия между программами RNAhybrid, TargetScan, miRanda.

Практическая ценность работы. Установленные in silico сайты взаимодействия микроРНК с мРНК могут быть основой для экспериментальных работ по верификации сайтов микроРНК. Введенная методика по отбору сайтов может быть использована для выявления сайтов с высокой комплементарностью. Полученные данные по микроРНК могут использоваться для разработки молекулярных маркеров в диагностике рака толстой кишки. Разработанная методика изучения филогенетической консервативности сайтов в кодирующей последовательности мРНК может применяться для подтверждения сайтов связывания микроРНК.

Основные положения, выносимые на защиту:

Созданная база данных по генам и микроРНК, ассоциированным с развитием рака толстой кишки, и их сайты взаимодействия пригодны для разработки молекулярных маркеров этого заболевания.

Геном человека содержит множество генов, которые имеют сайты связывания микроРНК с высокой комплементарностью. В 5'UTR, CDS и 3'UTR мРНК генов человека имеют сайты связывания микроРНК. Плотность сайтов микроРНК в 5'UTR в несколько раз выше, чем CDS и 3'UTR.

Существуют три вида сайтов связывания микроРНК с мРНК в зависимости от вклада микроРНК в энергию гибридизации: 5'-доминантный, 3'-доминантный сайты и сайты с центральным доминированием. Неспаренные нуклеотиды во вторичной структуре мРНК служат основой для образования связи между микроРНК и мРНК.

• 
  на Международном конгрессе студентов и молодых ученых «Мир науки»/КазНУ (2010 и 2012, Алматы, Казахстан);
  
• 
  на Международной конференции “The 7th and 8th international Conference on Bioinformatics of Genome regulation and Structure \ systems biology.” BGRS\SB'10 и BGRS\SB'12 (2010 и 2012, Новосибирск, Россия);
  
• 
  на Международном междисциплинарном симпозиуме «Нанотехнология и ноосферология в контексте системного кризиса цивилизации» (2011, Симферополь-Ялта);
  
• 
  на VI Московском международном конгрессе «Биотехнологя: состояние и перспективы развития» (2011, Москва, Россия);
  
• 
  на Международной конференции «Advances in Stem Cell Rasearch»/ 3^rd EMBO Stem Cell Conference (2011, Paris, France);
  
• 
  на Международной конференции «Non-coding RNA, Epigenetic Memory, and the Environment» (2011, London, UK);
  
• 
  на международной конференции MCCMB'11 (2011, Moscow, Russia);
  
• 
  на Международной конференции «International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Biomedical Engineering» (2011, Paris, France);
  
• 
  на Международной конференции “NCRI Cancer conference” (2011, Liverpool, UK);
  
• 
  на 13-м Международном PhD симпозиуме «The Rhythm of Life: Cycles in biology» (2011, Heidelberg, Germany);
  
• 
  на 2-ой Международной конференции Астана Биотех2011(2011, Астана, Казахстан);
  
• 
  на Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии (2012, Москва, Россия)
  
• 
  на третьей Московской международной конференции “Molecular Phylogenetics” «MolPhy-3» (2012, Москва, Россия);
  
• 
  на 9-ой Международной конференции “Nanosciences & Nanotechnologies” (NN12) (2012, Greece);
  
• 
  на Международной конференции Развитие нанотехнологий: задачи международных и региональных научно-образовательных и научно-производственных центров (2012, Барнаул, Россия).
  

1. 
   Рак толстой кишки и его генезис
   

1.1.1 Рак толстой кишки социально значимое заболевание

Рак толстой кишки (РТК) одно из распространенных онкозаболеваний во всем мире. Часто рак толстой кишки рассматривают как колоректальный рак, то есть рак толстой и прямой кишки. Механизмы возникновения этих новообразований сходные. Согласно данным проекта «Globocan 2008» международной организации исследований по раку, рак толстой кишки занимает третье место по частоте встречаемости у мужчин (после рака легких и рака простаты) и второе у женщин (после рака молочной железы) в мире. Ежегодно в мире регистрируется около миллиона больных колоректальным раком и 440000 смертей от этого заболевания [1]. По смертности это заболевание стоит на четвертом месте (после рака легкого, желудка и печени) среди всех новообразований в мире [19, 20] и составляет примерно 33% летальных исходов в развивающихся странах [21].

В настоящее время колоректальный рак становится все более значимой патологией в Республике Казахстан. Каждый год в республике выявляется более 2000 больных с колоректальным раком [22]. Согласно Приказу Министерства здравоохранения Республики Казахстан № 145 от 16 марта 2011 года в республики Казахстан проводится скрининг для выявления предопухолевых и опухолевых заболеваний толстой и прямой кишки [23]. Основной проблемой малоэффективного лечения рака толстой кишки является выявление заболевания на поздней стадии. Отсутствуют эффективные методы ранней диагностики, вследствие чего заболевание определяется на поздней стадии и часто с сопутствующими метастазами. Выяснение начальных стадий онкогенеза остается актуальным и для этого необходимо установление пусковых причин развития злокачественных опухолей.

1.1.2 Генезис рака толстой кишки

Рассмотрим кратко генетические и эпигенетические нарушения экспрессии белок-кодирующих генов при развитии рака толстой кишки. РТК можно подразделить на две группы: наследственно предрасположенный и спорадический. В разных странах 10-30% случаев развитие рака обусловлено наследственными генетическими изменениями [7]. Принято считать, что спорадический РТК развивается через последовательное накопление генетических и эпигенетических мутаций и, как правило, канцерогенез является многоступенчатым процессом [2]. В некоторых случаях изменяются специфические локусы, детерминирующие активацию онкогенов или инактивацию генов-онкосупрессоров рака. Глобально рак связан с хромосомными и микросателлитными нестабильностями, которые увеличивают возможность приобретения добавочных повреждений генов, значимых для канцерогенеза.

1.1.3 Наследственные синдромы

Существуют несколько факторов риска развития РКТ: возраст старше 50 лет, особенности питания, генетические синдромы, предшествующие заболевания и т.д. Семейные случаи развития рака толстой кишки занимают большой процент этого заболевания. Было показано рядом исследователей, что семейный рак составляет приблизительно 30% [24, 25]. Около 5% всех случаев рака ассоциировано с хорошо изученными наследственными мутациями и охарактеризованной клинической картиной. Этиология оставшихся 20-30% случаев наследственного колоректального рака до конца неизвестна, больные этой группы имеют родственников с полипозом или РТК. Этиология может быть связана с полиморфизмов генов, участвующих в регуляции метаболизма или генов, регулируемых другими генетическими факторами. В ряде случаев причиной могут быть изменения генов в ломких локусах, которые имеют множественные эффекты [9].

К группе генетических синдромов c полипозом относятся диффузный семейный полипоз, синдром Гарднера-Тернера, синдром Пейтца-Джигерса, болезнь Тюрка [26]. Синдромы рака толстой кишки классифицируются на основе клинических, патологических и генетических исследований. В основном синдромы классифицируются по характеристике множественных полипов. Полипозные синдромы делятся на аденоматозные, гамартоматозные и гиперпластические полипозисы [27]. К синдромам с аденоматозными полипами относятся: сидром Линча, семейный аденоматозный полипоз, аттенуированный семейный аденоматозный полипоз, MUTYH-ассоцированный полипоз [28].

Диффузный семейный полипоз, аттенуированный семейный аденомазный полипоз, синдром Гарднера обуславливаются мутациями в гене APC, белок которого отвечает за уровень β-катенина в цитозоле. Белок гена APC негативный регулятор в Wnt/Wingless (Wg) сигнальном пути трансдукции. Разница между этими тремя синдромами в локализации мутации в гене APC. Синдром диффузного семейного полипоза является наиболее распространенным наследственным фактором развития рака толстой кишки, он составляет около 1% от всех случаев возникновения рака [27]. Аденомы развиваются после первой декады жизни. Это заболевание передается по аутосомно-доминантному типу. Диффузный полипоз рассматривается как облигатный предрак, и если его не лечить, то он в 98% случаев перерождается в рак [29]. Средний возраст определения рака 39 лет. В 7% случаях рак развивается к 21 году, а в 95% случаях к 50 годам. Это заболевание может проявляться как остеомы, дентальные нарушения, врожденной гипертрофией пигментного эпителия сетчатки и опухолями вне кишечника (фиброзный рак, рак желудка, щитовидной железы, поджелудочной железы и т. д.) [30].

Аттенуированный семейный аденоматозный полипоз является причиной менее агрессивного вида рака. Заболевание характеризуется меньшим количеством полипов (обычно от 10 до 100). Риск рака толстой кишки составляет 69%, возникновение аденом начинается в более позднем возрасте. Также могут возникать другие патологии [28].

Синдром Гарднера — это вариант диффузного семейного полипоза, который характеризуется симптомами внутри и вне кишечника [31].

Болезнь Тюрка характеризуется диффузным полипозом толстой кишки и опухолями центральной нервной системы [26].

Синдром Линча связывают с возникновением наследственного неполипозного колоректального рака обусловленного мутациями в генах MSH2, MLH1 PMS1, PMS2, MSH6, продукты которых участвуют в репарации ДНК [32]. Синдром Линча является причиной развития РТК в 2-3% случаях этого заболевания. При развитии этого синдрома вероятнее образование небольшого количества полипов. Риск развития рака составляет 80%. Рак толстой кишки и полипы развиваются в раннем возрасте и имеют проксимальное расположение. В 90% случаях синдром Линча возникает за счет мутаций в генах MSH2 и MLH1 [33, 34]. Гены MSH2 и MLH1 также являются причиной развития синдрома Muir-Torre. Синдром Линча характеризуется и наличием микросателлитных нестабильностей. Недавно обнаружено, что делеции в гене EpCAM приводят к развитию одной разновидности неполипозного рака толстой кишки [35].

Группа синдромов гамартоматозными полипами относится к редко встречаемым заболеваниям, при которых полипы развиваются в раннем возрасте. Гамартоматозные полипы образуются при синдроме Пейтца-Джигерса, ювенильного полипозного синдрома, смешанного полипозного синдрома и др. Чаще всего среди гамартоматозных синдромов встречаются синдром Пейтца-Джигерса и синдром ювинильного полипоза. Синдром Cowden тоже относится к этой группе синдромов, но как все остальные синдромы этой группы встречается очень редко [36]. Синдром Пейтца-Джигерса аутосомно-доминантное заболевание, характеризующее гамартоматозными полипами в желудочно-кишечном тракте и пигментными кожно-слизистыми поражениями, которые преимущественно появляются в детстве на губах, слизистой оболочке щек. Сидром может привести к развитию рака желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, легких, груди, мочевого пузыря и т.д. Индивиды с этим синдромом имеют от 81 до 93% риска развития рака в течение жизни [37, 38].

Ювенильный полипозный синдром не имеет фенотипических характеристик как синдром Пейтца-Джигерса. В основном полипы образуются в толстой кишке, также могут быть в желудке, двенадцатиперстной и тонкой кишке. Риск развития рака составляет 39% в течение жизни [39, 40].

1.1.4 Цитогенетика рака толстой кишки (микросателлитные и хромосомные нестабильности)

Генетические и эпигенетические изменения, которые могут привести к развитию опухоли, следующие: точечные мутации, изменение плоидности, вставки или делеции, транслокации и абберантное метилирование, модификация гистонов (ацетилирование и метилирование гистонов).

Для рака толстой кишки приобретение геномных нестабильностей является одной из предпосылок развития этого заболевания. Существуют три основных вида геномных нестабильностей: микросателлитные нестабильности (MSI), хромосомные нестабильности (CIN) и метилирование CpG островков (CIMP) [6, 43].

Микросателлитные нестабильности являются причиной возникновения 15-20% спорадического рака. Это хорошо изученный вид рака, который происходит за счет потери или инактивации генов ДНК мис-матч репарации [44]. В основном при микросателлитной нестабильности сохраняется нормальный кариотип [45].

Хромосомные нестабильности - частая патология при раке толстой кишки, которая встречается примерно в 80-85% случаях [46]. При хромосомной нетабильности характерно наличие перестроек хромосом и большое количество нарушений. CIN используется для описания анеуплоидов и полиплоидов, делеций хромосом или хромосомных плеч, потеря гетерогенности [47]. Хромосомные нестабильности приводят к потере генов супрессоров-рака, таких как APC, TP53, SMAD4 и др. [8]. Развитие рака толстой кишки связано с часто встречаемыми геномными потерями. Аккумуляция потери 8q21, 15q11-q21, 17p12-13, 18q12-21 локусов и вставки в 8q23, 13q14, 20q13 областях ассоциировано с переходом аденомы в карциному [48]. Было показано, что делеции в хромосоме 4 приводят к развитию агрессивной формы рака, плохим прогнозам течения рака. Появление метастаз в печени связано с делециями 8p и вставками в хромосомах 7q и 17q, также на прогрессирующей стадии метастазирования ассоциированы с делециями 14q и вставками 1q, 11, 12p, 19 [49]. Несколько групп ученых провели полный анализ мутаций, связанных с раком толстой кишки, и было выявлены наиболее часто встречающиеся трисомии: + 7, +13, +20, +Х; среди моносомиков -4, -5, -8, -10, -14, -15, -17, -18, -21, -22, -Y [50].

У млекопитающих большинство CpG сайтов (90-98%) метилированы, но в геноме существуют CpG богатые районы, где основная масса островков не метилирована. Также существуют гены, участвующие в импринтинге, которые регулируются за счет метилирования CpG островков в промоторной области.

Продолжение таблицы 2

Гиперметилирование ДНК происходит в специфических регуляторных сайтах в промоторной области или повторяющихся последовательностях. Высокий уровень метилирования цитозина в CpG островках генов супрессоров-опухоли приводит к блокированию трансляции. В опухолях различной локализации были обнаружены аналогичные нарушения. Эпигенетические нарушения являются признаком рака, в том числе и при РТК. Другие эпигенетические нарушения включают ацетилирование гистонов. Таблица 2 представляет эпигенетические нарушения, которые были обнаружены при РТК [51-55].

Другой вид эпигенетического изменения — модификация хроматина, то есть ковалентная модификация гистонов хроматина. Ацетилирование гистонов - признак активного участка хроматина, процессы ацетилирования-деацетилирования происходят за счет ферментов гистон деацетилаз (HDAC) и гистон ацилтрансфераз. Фосфорилирование серина 10 в гистоне H3 коррелирует с инактивацией генов у млекопитающих, метилирование лизина 9 в гистоне H3 связано с выключением гена. Модификации кончиков гистонов распознаются ферментами ремоделирования хроматинов, которые могут модифицировать структуру хроматина. CDH5 (Chromodomain helicase DNA-binding protein 5) ген супрессор-опухоли, который участвует в процессах пролиферации, апоптоза, клеточного старения. Было найдено, что эпигенетическая инактивация гена CDH5 приводит к абберантному структурному изменению хроматина в геномах раковых больных (РТК, рак молочной железы, рак шейки матки, глиома) [56].

Метилирование цитозина в промоторной CpG области генов-онкосупрессоров опухоли подавляет транскрипцию и является причиной развития РТК [58]. По некоторым данным изменения отпечатка метилирования (геномный импринтинг) переданного от родителей может играть важную роль в малигнизации. Геномный импринтинг – эпигенетический феномен, характеризующийся моноаллельной экспрессией генов в зависимости от их родительского происхождения. Молекулярную основу такой экспрессии составляют ковалентные модификации ДНК и гистоновых белков, происходящие при созревании половых клеток. Аномалии формирования геномного импринтинга в гаметогенезе или его поддержания на различных этапах онтогенеза являются причинами развития опухоли. Потеря импринтинга в локусе IGF2 обнаружена при раке толстой кишки [59].

Полиморфизм может быть показателем чувствительности разных индивидов к развитию рака толстой кишки. Связь полиморфизма с раком изучают классическим методом генов кандидатов (на основе известных функций генов и их значимости в метаболических путях, связанных с развитием рака толстой кишки) и с помощью геномных ассоциативных исследований, когда тестируется полмиллиона или более однонуклеотидных полиморфизмов. Генетические варианты или полиморфизмы многих генов ассоциированы с риском развития рака толстой кишки (Таблица 3). Варианты генов ассоциированных с РТК включают APC-I1307K, HRAS1-VNTR, MTHFR, NAT1, NAT2, GSTM1, GSTT1, GSTP1 [60, 61].

Описан целый ряд полиморфизмов, для которых был подтвержден риск развития РТК. Например, диабет ассоциированные варианты гена TCF7L2, который участвует в WNT сигнальном пути. Аллели генов IGF-1, IGFBP-3 вместе с разными факторами окружающей среды и образа жизни по разному влияют на риск развития РТК [63]. Один из вариантов 1-рецептора к TGF-β (TGFBR1*6A) известен как фактор риска развития РТК, который составляет около 3% случаев РТК [64]. Варианты SMAD7 (rs12953717) также связывают с риском развития РТК [65]. Описанные и другие генетические варианты изменяют экспрессию генов, чувствительных к раку толстой кишки. Взаимодействие гена с геном важная детерминанта, которая может определять риск развития рака.

Полиморфизм может влиять на изменения чувствительности гена, например, APC-I1307K вариант гена APC может в 2 раза увеличить риск возникновения аденом. Было показано, что этот вариант чувствителен к мутациям, то есть у обладателей этого варианта повышен риск развития РТК [66, 67].

Другой вариант гена APC (APC-D1822V) имеет очень низкий риск возникновения РТК у женщин после менопаузы, и считается, что обладатели этого варианта толерантны к РТК [68].

Лечение рака толстой кишки предусматривает операционное удаление опухоли и химиотерапию. После такой терапии у большинства больных в течение месяца или года наблюдается ремиссия заболевания. После этого периода в 30-50% случаях происходят рецидивы обычно в виде метастаз. Возобновления рака зависит от стадии, на которой определили рак. На первой стадии колоректального рака у большинства пациентов не возникают рецидивы (95-98%), на второй стадии в 20-25% и на третьей стадии в 40-50% заболевание возобновляется после лечения. Основная доля смертности наблюдается у больных с рецидивами. Основной причиной возникновения рецидивов обусловлено наличием пролиферирующих клеток, против которых не эффективна химиотерапия. В организме только один тип клеток имеет такие свойства, это - стволовые клетки [69].

Нормальные стволовые клетки в толстой кишке расположены в криптах между кишечными субэпителиальными миофибробластами. Эпителий желудочно-кишечного тракта постоянно самообновляется за счет стволовых клеток, большинство дифференцированных клеток желудочно-кишечного тракта обновляются каждые 2-7 дня [70]. В норме СК продуцируют около 10¹⁰ клеток, которые дифференцируются по вертикальной оси [71].

Существует предположение, согласно которому накопление генетических и эпигенетических мутаций приводит к образованию раковых стволовых клеток из стволовых клеток взрослого организма [72]. Эти клетки являются причиной малигнизации тканей, а также причиной развития метастазов. После образования таких клеток химиотерапия и лучевая терапия, как правило, малоэффективны, так как у стволовых раковых клеток множество защитных механизмов.

Частота встречаемости раковых стволовых клеток 1 на 60 000 раковых клеток толстой кишки [73]. Раковые стволовые клетки толстой кишки имеют определенные фенотипические маркеры, такие как CD133+, CD44+, Musashi-1, EpCAM+, CD166+, CD49f. Эти клетки не экспрессируют белки ответственные за дифференцировку (СК20) [74]. Таблица 4 представляет потенциальные маркеры для определения нормальных и раковых стволовых клеток толстой кишки. В основном раковые стволовые клетки толстой кишки выделяют по CD133+ фенотипу. После выделения раковых стволовых клеток проверяется их потенциал самообновления в среде без сыворотки и потенциал к образованию опухоли на иммунно-дефицитных мышах [75].

Обнаружение раковых стволовых клеток изменило понимание канцерогенеза и стратегию терапии. Исследование раковых стволовых клеток показало, что у этих клеток существуют насосы для выведения лекарств, есть изменения в механизмах ДНК-репарации, изменения в чекпоинтах клеточного цикла, неисправный механизм апоптоза. На данный момент медицина может убить дифференцированные и высоко пролиферирующие клетки, а раковые стволовые клетки пролиферативно неактивны, мало дифференцированы, обходят пути апоптоза [76].

На данное время для лечения больных с РКТ при химиотерапии используют комбинацию препаратов из фторурацила (5ФУ), оксалиплатина и леуковорина (FOLFOX) и комбинацию из 5ФУ, оксалиплатина и иринотекан (FOLFIRI). Также для пациентов с метастазами используются моноклональная терапию против anti-VEGF или EGFR [77]. Хотя при наличии РСК это терапия не эффективна. Для борьбы с РСК на данный момент разрабатываются новые подходы лечения. Во-первых, разрабатываются методы стимуляции процессов дифференцировки РСК [78]. Также разрабатываются подходы подавления механизмов выживания, свойственных стволовым клеткам [79]. При обнаружении эффективных методов элиминации РСК можно будет в большинстве случаев побороть рак.

В предыдущей части мы упоминали о стадиях рака толстой кишки. Определение стадии очень важно для прогнозирования и назначения терапии при РТК. Существует анатомическая классификация Дюка (1944), которая рассматривает степень проникновения опухоли в стенку кишечника и вовлечения лимфатических узлов в процесс. В 1950 году в Париже в институте Густава-Росси создали классификацию TNM [81]. В 1987 году Международный Центр против Рака (UICC) и Американский Объединенный комитет по Раку (AJCC) унифицировали TNM классификацию. Последнее седьмое издание TNM классификации с поправками вышло в 2009 году (таблица 5). В TNM классификации показатель Т отражает глубину проникновения первичной опухоли в стенку кишки, показатель N - состояние регионарных лимфоузлов, показатель М - наличие или отсутствие отдаленных метастаз. Недостатком этой классификации является то, что не учитывается размер первичной опухоли [82, 83]. На данный момент обе классификации используются на практике.

Таблица 5 - ТNМ классификация 2009 года [84, 85]

1.1.11 Ключевые пути развития рака толстой кишки

РТК не моногенное заболевание и больные с одинаковой стадией заболевания имеют разный прогнозы течения болезни и разный ответ на лечение, потому что у каждого больного свой набор мутаций в разных генах и очень трудно определить основной путь развития этого заболевания. Хотя считается, что есть набор генов, который в большинстве случаев мутирован при определенном онкологическом заболевании. Вогелстеин с соавторами предполагают, что развитие рака всех локализаций ассоциировано со своим набором ключевых генов [3, 86]. Для РТК это члены Wnt/β-катенин и фосфотидилинозитол-3-киназных путей, онкоген KRAS, ген-онкосупрессор ТР53 и др. (рисунок 1). Ключевые гены нарушены в 50-60% случаев и обнаруживаются у больных с прогрессирующей болезнью на поздних стадиях.

RAS-RAF-MEK-ERK-MAP киназный путь - важный сигнальный путь трансдукции, который обеспечивает клеточный ответ на ростовой сигнал,. Поэтому он участвует в регуляции таких процессов как пролиферация, клеточное выживание, арест клеточного цикла, дифференциация, апоптоз [87]. RAS белок, который находится на внутренней стороне мембраны. RAF, MEK, ERK цитоплазматические протеин-киназы, которые последовательно активируют друг-друга [88]. KRAS активируется посредством протеин-киназы BRAF. Мутации в 12 кодоне гена KRAS были найдены у 8,6% всех пациентов [89] и в среднем у 40% пациентов обнаружены мутации в этом гене [4]. При мутационной активации продукта гена KRAS происходит аберрантная активация EGFR пути. Исследование мутаций в этом гене являются важным прогностическим маркером для лечения с помощью агентов против EGFR (цетуксимаб и панитумумаб). Потому что при наличии мутаций в гене KRAS такое лечение неэффективно. Также мутации в генах этого сигнального пути ассоциированы с раком с микросателлитными нестабильностями [90].

Мутации в гене PIK3CA и делеция гена PTEN также как KRAS являются маркерами для предсказывания устойчивости против EGFR моноклональной терапии. Фосфотидилинозитол 3-киназный путь - сигнальный путь активированный стимуляцией EGFR. В 70% случаях мутации в гене PIK3CA и делеция гена PTEN, которые сопровождаются мутациями в генах KRAS и BRAF, не чувствительны к лечению цетуксимабом и панитумумабом [91, 92].

Wnt/ β-катенин сигнальный путь играет ключевую роль в гомеостазе и поддержании стволовых клеток желудочно-кишечного тракта [93]. Существует градиент Wnt сигнала от основания крипт до ворсинок кишечника [94]. Если у эпителиальных клеток основания крипты нет источника Wnt, то клетки теряют пролиферативную активность и дифференцируются [95, 96]. Ген Adenomatous polyposis coli (APC) играет центральную роль в Wnt сигнальном пути, который действует на деградацию β-катенина [97]. Wnt сигнал ингибирует деградацию β-катенина за счет ингибирования GSK3 [98], параллельно PI3K-зависимый путь стимулирует проникновение β-катенина в ядро [99], где β-катенин взаимодействует с белками семейства LEF/TCF [100]. Этот комплекс активирует транскрипция целого ряда белков: p300, CBP, Hrpt2, Foxo, Bcl9-2, reptin, pontin, Grouchos, Prmt2, CtBP [101]. По одним данным, в 85% случаях спорадического рака толстой кишки есть мутации в гена APC, и в 50% случаях есть активирующая мутация в гене β-катенина [5]. Также за счет ингибирования GSK3 Wnt сигнальный путь активирует mTOR путь, который отвечает за рост и пролиферацию клетки [102]. Один из маркеров раковых стволовых клеток толстой кишки CD44 является мишенью Wnt сигнального пути [103]. Многие исследования показали, что ингибирования Wnt сигнала в РСК может аннулировать их канцерогенные свойства. При блокировании взаимодействия β-катенина с транскрипционным фактором TCF приводит к аресту клеточного цикла на G1 фазе [104, 105]. Для терапии рака разработано множество потенциальных антагонистов Wnt сигнального пути на основе антител, которые могут действовать на разной стадии передачи сигнала. Антагонисты Wnt сигнального пути являются будущим для терапии рака. Основной целью является создание безопасных препаратов, которые целенаправленно будут действовать на раковые клетки или РСК. Еще одна проблема в том, что существует тканеспецифичный и клеткоспецифичный пути, так как есть 19 Wnt лиганд и множество участников этого пути [106].

Термины протоонкоген, онкоген и ген-онкосупрессор часто используются в онкогенетике. Протоонкогены встречаются во всех нормальных клетках, они являются генами белков, многие из которых передают сигнал от мембраны в ядро в процессах клеточной дифференцировки, деления, апоптоза. После мутаций вызывающих онкогенез их называют онкогенами. К онкогенам относятся и гены вирусов, которые встраиваются в геном хозяина. Первый онкоген был обнаружен в опухоли курицы, который являлся встроенным вирусным геном. Гомологи таких генов были найдены у человека, которые тоже относят к онкогенам. К онкогенам человека относятся гены RAS, SRC, BRAF, MYC. v-myc – онкоген вируса миелоцитомы курицы, v-src – онкоген вируса саркомы Рауса.

Рисунок 1 - Сигнальные пути, наиболее часто измененные при раке толстой кишки [110]

Все гены, участвующие в развитии наследственных синдромов, являются одним из ключевых участников онкогенеза рака толстой кишки и при спорадическом течении заболевания (таблица 1). Кроме генов представленных в таблице 1 на поздних прогрессирующих стадиях рака толстой кишки участвуют такие ключевые гены, как TP53. Ген TP53 кодирует транскрипционный фактор, который является хранителем генома, потому что участвует в таких процессах как ответ на оксидативный стресс, ДНК репарация, регуляция клеточного цикла, апоптоз и многих других метаболических путях. Потеря функции TP53 найдена при многих опухолях, в основном происходят мутации в центральном домене, который отвечает за связывания с ДНК. Инактивирующие мутации в этом гене обнаружены в 29% случаях РТК [108, 109].

В последние годы множество исследований посвящено секвенированию полных геномов, транскриптомов всех видов рака [111].

В 2006 году была опубликована работа, в которой провели секвенирование 13023 генов в 11 опухолевых линиях РТК. Выявлено 519 генов с мутациями, которые в разных комбинациях присутствуют в этих линиях, так что в среднем в каждой линии опухоли найдено около 90 генов с мутациями. Из 519 генов только 69 генов были ассоциированы с развитием рака толстой кишки [112]. Кроме этих генов по данным литературы и другие гены участвуют в онкогенезе РТК. Следовательно, можно предположить, что количество ключевых генов ассоциированных с раком толстой кишки гораздо больше. Например, в базе HuGE Navigator (www.hugenavigator.org) 491 ген ассоциирован с развитием рака толстой кишки. Поэтому разработать селективные молекулярные маркеры для диагностики очень сложно.

В диагностике РТК на практике используются следующие инструментальные методы обследования: рентгенологический (ирригоскопия, обзорная рентгенография брюшной полости, компьютерная томография), эндоскопический (колоноскопия) и ультразвуковой. Компьютерная томография является основным современным методом первичного обследования больных с РТК. Метод позволяет оценить местное распространение опухоли, наличие отдаленных метастазов. Для повышения чувствительности метода используется дополнительное контрастирование, которое особенно эффективно для паренхиматозных органов [85].

Исследование кала на скрытую кровь один из неинвазивных методов диагностики, основанный на определении крови в стуле. Метод имеет низкую чувствительность (30-50%) [113, 114]. Пациентов с положительным результатом направляют на колоноскопию. Было выявлено, что этот метод на 16% позволяет уменьшать инциденты рака и ликвидировать заболевание на стадии аденомы [115, 116].

Существуют ряд коммерчески доступных тест систем, которые определяют маркеры РТК. В США для ранней диагностики РТК используется ColoSure^TM тест, который проверяет метилирование гена Vimentin в кале [117]. В нормальном эпителии толстой кишки этот ген выключен. Тест показывает 77% чувствительность и 83% специфичность по сравнению с тестом на скрытую кровь [118, 119]. Метилирование гена Septin9 коррелирует с наличием РТК. Изучение метилирование Septin9 в плазме коммерциализировано как тест ColoVantage® [120].

Существуют прогностические маркеры, которые помогают прогнозировать ответ на лечение. Очень трудно определить вторую и третью стадию. На второй стадии нет метастаз в регионарных лимфоузлах. На практике трудно определить наличие или отсутствие метастаз в регионарных лимфоузлах. Экспрессия гена GCC (тест Previstage^TM) в лимфоузлах коррелирует со стадией заболевания [121]. Также есть коммерческий тест (ColoPrint®) на основе экспрессии 18 генов, который также используется для точного определения группы с повышенным риском больных со стадией II и III РТК [122]. Другой коммерческий тест (OncoType DX®) предназначен для прогнозирования рецидивов у пациентов со второй стадией заболевания на основе экспрессии 12 генов [123]. В таблице 5 представлено описание всех упомянутых тест систем. Универсальных молекулярных маркеров для ранней диагностики РТК на данный момент нет [124].

Талица 5 - Коммерческие доступные тест системы

Надежды в этой области связаны с изучением микроРНК. Обнаружение микроРНК - одно из самых крупных открытий конца XX века. На настоящее время в геноме человека предсказано более 3000 микроРНК, из которых аннотировано более 1000 микроРНК [125]. На микроРНК сфокусировано большое внимание, потому что изменения в их функционировании непосредственно связаны с возникновением, прогрессией и метастазированием злокачественных опухолей. Предполагается, что нарушение синтеза микроРНК является одной из первопричин изменений во многих патологиях, в том числе при раке.

2. 
   
   жүктеу/скачать 2.9 Mb.
   
   Достарыңызбен бөлісу: