Обзор литературы Эпизоотология бруцеллеза
Аллергическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота
жүктеу/скачать 487.7 Kb.
|
| 2.4.3 Аллергическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота
Изготовление аллергена для диагностики бруцеллеза животных В настоящее время весьма важно на вооружении иметь мобильные препараты при помощи, которых можно было бы многократно (вплоть до ежемесячного), без особых трудовых затрат, проводить диагностические исследования с целью выявления инфицированных животных. При этом перспективно, если при помощи этих препаратов можно было бы проводить провоцирование латентные формы бруцеллеза тем самым довыявлять инфицированных, на месте отмечать реагирующих животных и в кратчайшие сроки изолировать их из стада, где находятся условно здоровые животные. Кроме того, необходимо отметить, что применения таких препаратов (аллергены) для прижизненной аллергической диагностики бруцеллеза животных выгодно отличаются от антигенов используемые для постановки серологических реакций и позволяет исключить трудоемких процессов связанных с взятием крови в специально подготовленные посуды (пробирки, контейнера, вакутейнеры), постановкой затратоемких серологических реакции (необходима специальная посуда, реактивы, приборы, возможно аппаратура). Так же следует отметить, что аллергически метод диагностики является более безопасной для исполнителей при работе в условиях неблагополучия и в экологическом плане. Поэтому, перед нами были поставлены задачи изыскания более оптимального варианта приготовления высокочувствительного аллергена с использованием авирулентного шт. B. abortus 19. Это решение было принято по причине того, что он является наиболее безопасным штаммом, который характеризуется следующими признаками: Происхождение штамм B. abortus 19. Данный штамм получен 1923 г. в США из молока коровы. Идентифицирован по определителю бактерий Берджи, М. (1997, т. 1, С. 81-82). Сравнен с типовым штаммом коллекционный №В - 0027 В. Abortus 54 (эталонный). Штамм получен путем отбора колоний в S - форме. Штамм при серологической типизации с S-бруцеллезной и моноспецифической антиабортусной сыворотками дает позитивные реакции, а с моноспецифической антимелитензисной и R - бруцеллезной сыворотками негативную реакцию. Биотехнологические характеристики: штамм типовой, слабовирулентный, используется для приготовления вакцинных и диагностических препаратов. Хорошо растет в агаре Д, эритрит агаре, МПА, МППГГА, не растет на средах с добавлением пенициллина в дозе 2,5-5 тыс. ед/мл среды. Растет на среде с добавлением фуксина (1:50000) и не растет на среде с тионином (1:25000 и 1:50000). Проба с трипафлавином (1:500) и реакция термоагглютинации отрицательные. Морфолого - культуральные свойства: хорошо растёт на эритрит - агаре, Т°+37-38 °С, 48 час в термостате; овоиды, длина 0,4-2,5 мкм, ширина 0,4-0,6 мкм; очертания концов округлые, грамотрицательные, кислотонеустойчив, неподвижные, тип клеточной стенки липополисахарид, специализированные клетки не образует, колоний плотные, гладкие, поверхность блестящая, S - форма. Физиолого - биохимические свойства: хемоорганотроф, аэроб, тип катаболизма - дыхание, внутриклеточный паразит, чувствителен к пенициллину 2,5-5 ЕД/мл среды, рост стимулируется добавлением крови и сыворотки; источник углерода - глюкоза, глицерин, источник серы - цистин, обладает уреазной, оксидазной, каталазной активностью, образует Н2S, желатин не разжижает, индол не образует, не лизирует эритроциты, не образует ацетилметилкарбинол, выявляются иммунохимическими методами - РА, РСК, ИФА, ПЦР, слабопатогенен для животных. Культуру B. abortus 19, содержащий в своём составе S-формы бруцелл выращивали на твердой питательной среде в течении 3 суток с последующим их смывом 0,5%-ный физиологическим раствором, полученную бактериальную массу фильтровали через тройной марлевый фильтр, затем взвесь бруцелл стерильной дистиллированной водой доводили до концентрации 100 млрд микробных клеток в 1,0 см³. Далее полученную суспензию автоклавировали при 1 атм. в течении 30 мин. и оставляли при комнатной температуре на 2-3 сут., затем фильтровали через стерильные фильтры, полученный фильтрат разводили в 10 раз 0,85%-ный физиологическим раствором, в качестве консерванта использовали формалин 37 - 38%, который добавляли в количестве 0,2 см³ в 100 см³ фильтрата и использовали его в качестве целевого продукта. Определение стерильности аллергена проводили путем высева на эритрит - агаре и мясо - пептонном бульоне. В результате проведенных исследований высевы оставались в течении 10 дней (период наблюдения) стерильными, что свидетельствуют об отсутствии бактериальной загрязнённости аллергена. При испытании безвредности из общей пробы аллергена стерильной пипеткой взяли 3-4 см³ и ввели подкожно по 0,5 см³ 5 белым мышам массой 18-20 г. в области паха. При этом аллерген не вызывал воспалительных реакций на месте введения, общее состояние животных были нормальные, случаи их заболевания и гибели в течении 10 дней не отмечались, что свидетельствует о безвредности испытуемого аллергена. Определение специфичности предлагаемого аллергена проводили на 10 здоровых морских свинках массой 350-400 г., путем внутрикожного введения его в дозе 0,1 см³ в депилированный участок на боковой поверхности туловища. Одновременно на симметричном участке другой стороны туловища вводили по 0,1 см³ противопоставляемого аллергена (известного аллергена). Учет реакции проводили через 24-48 часов. Оба аллергена не вызвали воспалительной реакции у опытных животных в течении 48 часов, что свидетельствовало о специфичности аллергенов. Определение активности проводили на 10 сенсибилизированных морских свинках массой 350-400 г., сенсибилизированных путем подкожного введения двухсуточной агаровой культуры B. abortus 19 в дозе 1 млрд. микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича. Через 25-30 суток после прививки на морских свинках проводили определение активности аллергена. Животные с этой целю использовались в опытах не более 6 месяцев с интервалом между испытаниями не менее 25 суток. Предлагаемый и противопоставленный противобруцеллезные аллергены вводили 10 морским свинкам внутрикожно в депиллированные участки в дозе 0,1 см³ в разные стороны туловища. Иглу вводили в складку кожи морской свинки, зажатую между большим и указательным пальцами, параллельно поверхности кожи с таким расчетом, чтобы иглы были не менее 3 мм погружено в кожу. Затем складку кожи отпускали и нажимом на поршень вводили точно 0,1 см³ препарата. На месте инъекции образовалась припухлость величиной с маленькую горошину. С целью предупреждения вытекания аллергена иглу после введения задерживали на 2-3 секунды в коже и затем извлекали. Для введения аллергенов применяли маркированные вместимостью 1 см³ шприцы, не пропускающие раствор под поршень или иглу. Каждый аллерген вводили отдельным шприцем, в том числе иглой. Интенсивность реакций проверяли через 48 час. После введения аллергенов, измеряя два взаимно перпендикулярных диаметра отеков, образующихся в месте введения, и вычисляли среднее значение, которое и является показателем интенсивности реакции. При этом на месте введения аллергенов у морских свинок появлялись воспалительные реакции в виде различной отечной припухлости различного размера и гиперемии кожи. Следует отметить, что реакция на предлагаемый и противопоставленный аллерген была идентичными, размеры, которых в среднем составляли соответственно 4,5+ 0,25 и 4,4 + 0,21 мм, что свидетельствует об их достаточной активности (таблица 3). Для определения специфичности и чувствительности предлагаемого аллергена в различных по эпизоотологической характеристике агро формированиях (благополучный, условно благополучный) исследовали сельскохозяйственных животных на бруцеллёз. Работа проводилась на территории Аксуатского сельского округа (КХ «Асем»; КХ «Аксуат»; КХ «Нур»; ТОО «МОЛ-ЕТ»). Бруцеллезные аллергены вводили крупному рогатому скоту внутрикожно в среднюю треть шеи безыгольным инъектором БИ - 7М. Учет и оценку реакции у животных на внутрикожное введение аллергена учитывали через 48 часов путем осмотра и пальпации складки кожи на месте введения препарата в сравнении со складкой кожи из нормального участка тела. При этом через 48 часов у больных бруцеллезом животных на месте введения аллергена появлялась воспалительная реакция в виде плотного отека с ярко выраженным контуром и достаточной плотной консистенцией, обычно хорошо видимого при визуальном осмотре. У здоровых животных местная аллергическая реакция не возникала. Оценку реакции проводили по схеме: Положительная реакция - утолщение кожной складки против физиологической нормы на 10 мм и более; Сомнительная реакция - утолщение кожной складки против физиологической нормы от 4 мм и более; Отрицательная реакция - отсутствие каких-либо признаков на введение аллергена. Полученные данные отражены в таблице 4 Таблица 3. Результаты испытания аллергена на активность
Таблица 4. Результаты сравнительных исследований животных на бруцеллез предлагаемым и противопоставленным аллергеном
Как видно из таблицы 4, при аллергическом исследовании крупного и мелкого рогатого скота, находящиеся в благополучных по бруцеллёзу хозяйствах, получены отрицательные результаты, что свидетельствуют о специфичности аллергена. При исследовании животных разных видов из неблагополучного по бруцеллёзу хозяйств предлагаемым аллергеном на 4 (21,1%) положительных результатов получено больше, чем противопоставленным аллергеном. Сомнительных результатов с предлагаемым аллергеном не было, тогда, как с известным аллергеном они отмечены у 4 (21,1%) животных. Эти данные свидетельствуют о специфичности и большей чувствительности предлагаемого аллергена. Использование предлагаемого аллергена позволит быстро и эффективно выявить заражённых бруцеллезом животных, тем самым ускорить сроки оздоровления неблагополучных по бруцеллёзу хозяйств. Новизну на способ изготовления аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных Комитет по правам интеллектуальной собственности Министерства юстиции Республики Казахстан подтвердил выдачей инновационного патента за №19907, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Республики Казахстан 28.05.2011 года. жүктеу/скачать 487.7 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||