Определение содержания абсцизовой и индолилуксусной кислот методом тфифа фиксация материала
жүктеу/скачать 92.82 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 2. Экстракция
|
Определение содержания абсцизовой и индолилуксусной кислот методом ТФИФА 1. Фиксация материала Замораживание в жидком азоте с последующим лиофильным высушиванием является наиболее щадящим способом фиксации и хранения растительного материала для определения АБК и ИУК. Если такая возможность отсутствует, то можно для определения АБК (но не ИУК!) провести фиксацию в термостате при +105 °С и высушить материал до воздушно-сухого состояния при +60 °С. Хранить при +1...+2 °С (в холодильнике) в эксикаторе с притертой крышкой над прокаленным хлористым кальцием. 2. Экстракция 2.1. Фиксированный жидким азотом материал гомогенизировать на холоде, поместить в пробирки и залить для экстракции холодным 80%-м этанолом из расчета 10 мл на 1 г сырого веса. На стадии гомогенизации и экстракции необходимо добавить один из антиокислителей (меркаптоэтанол, диэтилдитиокарбамат натрия, метабисульфит натрия и др.). Если материал фиксирован и высушен в термостате для определения только АБК, взять измельченную навеску сухого материала 200—300 мг и залить 15 мл холодного 80%-го этанола. В обоих случаях экстракцию проводить при температуре +2 ...+4 °С (в холодильнике) в течение 12 — 16 ч при периодическом встряхивании пробирок. После чего для увеличения и ускорения выхода гормонов из растительной ткани пробирки еще встряхивать на качалке в течение 5—10 мин. Внимание! Гомогенизация, экстракция и все последующие процедуры проводят на рассеянном свету, защищая 25 образцы от прямого воздействия света, который ускоряет деградацию фитогормонов. 2.2. После окончания экстракции содержимое в пробирках перенести количественно в центрифужные пробирки, несколько раз смывая новыми порциями 80%-го этанола пробирки, в которых проводили экстракцию. Центрифугировать на холоде при 13—15 тыс. g в течение 5—10 мин. Супернатант слить в маленькие фарфоровые чашки, а осадок растительного материала еще дважды промыть 3—5 мл этанола и центрифугировать, объединив супернатанты с первой порцией. Полученный спиртовой экстракт упарить до водного остатка в токе холодного воздуха. Для этой цели можно использовать вентилятор «Ветерок» в положении «Холод». Объем водного остатка после выпаривания этанола должен составлять не более 3,5—4,0 мл. Последующее выделение АБК и ИУК из водного остатка и определение их содержания с помощью ТФИФА проводится по схемам с использованием иммуноферментных тест-систем, разработанных Г. Р. Кудояровой, С. Ю. Веселовым с сотр. (1990; 1994; 1998). 2.3. Схема экстракции и концентрирования АБК и ИУК из водного остатка включает уменьшение объемов растворителей на каждом этапе. Водный остаток довести водой до 10—12 мл, подкислить 1 N соляной кислотой до рН = 2—3 (несколько капель, важно не перекислить, так как возможна деградация гормонов). Подкисленный водный остаток перенести в мерные цилиндры с притертой пробкой, довести объем водой до 15 мл и провести экстракцию очищенным от перекисей, подкисленным диэтиловым эфиром. Для этого добавить 5 мл эфира, закрыть пробкой и осторожно перемешивать водный остаток и эфир покачиванием цилиндра. После разделения фаз эфир собрать пипеткой (он сверху) и перенести в чистые пробирки. Операцию повторить, добавив к водному остатку 3 мл эфира. Обе эфирные фракции, где содержатся свободные ИУК и АБК, объединить, а водный остаток отбросить, если он не используется для определения связанных форм гормонов. 2.4. К эфирному экстракту добавить 4 мл 1%-го раствора бикарбоната натрия, перемешать осторожным покачиванием и, дождавшись разделения фаз, эфир собрать и отбросить. При этом ИУК и АБК находятся в растворе бикарбоната, а вместе с эфиром удаляются нейтральные производные гормонов, которые могут мешать определению свободных форм при иммуноанализе. Оставшуюся фракцию соды подкислить 1 N соляной кислотой до рН = = 2—3 (0,3—0,4 мл) и дважды экстрагировать гормоны из раствора соды диэтиловым эфиром, добавляя каждый раз по 2 мл эфира. После перемешивания и разделения фаз эфирную фракцию собрать и поместить в маленькие (лучше «пальчиковые») пробирки. Объединенный эфирный экстракт выпаривать в пробирках под током холодного воздуха. 2.5. Сухой остаток на дне пробирки, содержащий ИУК и АБК, сразу метилировать диазометаном и использовать для иммуноанализа либо ИУК, либо АБК. В случае определения АБК метилирование не обязательно. Описанная схема экстракционной очистки, основанная на уменьшении объема экстрагента на каждой стадии экстракции и реэкстракции, обеспечивает довольно высокий выход ИУК и АБК. В то же время уменьшает выход иммунореактивных предшественников ИУК (индолилацетальдегид, индолилацетонитрил), а также позволяет освободиться от основной массы интерферирующих иммунореактивных компонентов. Вторичный эфирный экстракт содержит в основном главные иммунореактивные компоненты — ИУК и АБК. Такой очистки достаточно для определения ИУК и АБК методом ТФИФА благодаря высокой специфичности, чувствительности и избирательности применяемых иммуноферментных тест-систем. В данной работе для проведения модифицированного непрямого варианта ТФИФА используются тест-системы, производимые НПО «Фармхиминвест» (г. Уфа). жүктеу/скачать 92.82 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|