Отдаленные цитогенетические и соматические последствия у населения, проживающего вблизи сияп, и состояние иммунного статуса под влиянием различных доз γ-излучения (клинико-экспериментальное исследование) 03. 00. 01 Радиобиология

УДК: 612.014.482+575+616-097.001.6 На правах рукописи

МАДИЕВА МАДИНА РАШИДОВНА

(клинико-экспериментальное исследование)

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Республика Казахстан

Астана, 2010

Работа выполнена в Государственном медицинском университете г. Семей

Защита диссертации состоится «28» декабря 2010 г., в 14⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 09.17.04. при АО «Медицинский университет Астана» по адресу: 010000, г. Астана, ул. Бейбитшилик, 49 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АО «Медицинский университет Астана» по адресу: 010000, г. Астана, ул. Бейбитшилик, 53.

Автореферат разослан: « » ноября 2010 г.

доктор медицинских наук, профессор Мустафина Р.Х.

Несмотря на существование различных теорий биологического действия малых доз ионизирующих излучений, большинство авторов придает первостепенное значение повреждениям ДНК в проявлении генетических эффектов радиации [Абильдинова Г.Ж., 2003; Sevan’kaev A.V.et al, 2008]. В целом, закономерности выхода генетических нарушений в области малых доз характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение характера зависимости и определяется их чувствительность к внешним воздействиям [Tawn E.J. et al,, 2006]. Одним из подходов в оценке радиационных последствий является проведение биологической индикации, основанной на изучении цитогенетических эффектов в лимфоцитах периферической крови лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в различных диапазонах доз. Культура лимфоцитов периферической крови человека представляет собой простую и вместе с тем уникальную по своим свойствам модель для исследований по индуцированному мутагенезу [Замулаева И.А., 2003]. На сегодняшний день цитогенетические исследования являются неотъемлемой частью практически всех международных эпидемиологических программ по изучению воздействия мутагенных факторов на популяцию человека [Бочков Н.П., 2001].

В настоящее время накоплены убедительные доказательства тому, что наиболее тонким и чувствительным индикатором внешнего, и в том числе экологического, влияния на организм человека является состояние иммунной системы [Хаитов Р.М. с соавт., 2005], которая поддерживает антигенный гомеостаз в организме и обеспечивает регуляцию процессов пролиферации и дифференцировки клеточных элементов в гемо- и иммунопоэзе [Жетписбаев Б.А. с соавт., 2006]. Радиационное воздействие вызывает ряд изменений в иммунной системе на клеточном и субклеточном уровнях, а формирующиеся дефекты лежат в основе патогенеза целого ряда заболеваний (рост онкологических заболеваний, увеличение частоты аллергических заболеваний, числа хронических воспалительных заболеваний разной локализации) [Кулжанова Ш.А., 2009; Махамбетов К.О., 2009; Тахауов Р.М. с соавт., 2005].

Современные оценки радиационного риска заболеваемости, смертности, сокращения продолжительности жизни основаны на эпидемиологических исследованиях различных групп пострадавших, величине дозы облучения и условий реализации эффектов (возраст, образ жизни, характер производственной деятельности, состояние иммунитета, генетические особенности, прочие факторы риска). Без учета этих модифицирующих факторов перенос результатов исследования одной группы людей на другую, как с целью прогноза, так и разработки реабилитационно-профилактических программ может оказаться недостаточным. Поэтому научный комитет ООН по действию атомной радиации придает особое значение «любым исследованиям по влиянию облучения на человека, где это только возможно».

Оценка отдаленных последствий для потомков лиц, подвергавшихся ионизирующему излучению от деятельности Семипалатинского испытательного ядерного полигона (СИЯП) не теряет своей актуальности по настоящее время. Естественно происходящая смена поколений привела к тому, что большинство населения, имеющего отношение к радиационным ситуациям в прошлом, составляют лица, рожденные от облученных родителей [Ким А.Л., 2009; Изатова А.Е., 2006]. Отсутствие научно разработанных критериев связи опосредованного влияния радиационного фактора на состояние здоровья лиц, родители которых подвергались прямому радиационному воздействию, обусловило актуальность проведения настоящего исследования.

Цель работы: оценить отдаленные цитогенетические последствия хронического воздействия ионизирующего излучения, риски развития соматической заболеваемости у населения, проживающего вблизи СИЯП, и состояние иммунного статуса под влиянием различных доз γ-излучения в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Определить уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у населения, проживающего вблизи СИЯП и на основе стабильных аберраций (транслокаций), определяемых FISH методом, провести расчет дозы хронического облучения.

2. Исследовать уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у потомков лиц, подвергавшихся радиационному воздействию.

3. Провести анализ и рассчитать риски распространенности соматической заболеваемости у населения, подвергавшегося радиационному воздействию, и их потомков.

4. Провести сравнительную оценку нарушений иммунного статуса у населения, проживающего вблизи СИЯП и у лиц, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения в различных дозах.

5. Экспериментально изучить отдаленные последствия влияния различных доз γ-излучения на клеточное звено иммунитета и на состояние центральных и периферических лимфоидных органов иммуногенеза белых крыс.

6. Изучить экспериментально влияние различных доз γ-излучения на гуморальное и неспецифическое фагоцитарное звенья иммунитета и цитокиновый профиль в отдаленном периоде.

7. Исследовать состояние иммунной системы у потомков облученных белых крыс.

Установлено, что, несмотря на длительный период после воздействия ионизирующего излучения в лимфоцитах крови населения, проживающего в Абралинском и Бескарагайском районах Восточно-Казахстанской области и их потомков, присутствуют нестабильные аберрации хромосом (дицентрические и кольцевые хромосомы), частота которых превышает контрольный уровень, что позволяет использовать их для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия.

Показано, что в лимфоцитах периферической крови жителей исследуемых районов в отдаленном пострадиационном периоде наблюдается высокая частота стабильных (транслокаций) и нестабильных (дицентрических и кольцевых хромосом) аберраций уровень которых значительно превышает уровень в контрольной группе. Полученные данные по частоте транслокаций позволили провести расчет дозы хронического облучения у населения, проживающего вблизи СИЯП.

На основании сформированных групп исследований из населения Абралинского и Бескарагайского районов и их потомков оценены риски развития соматической заболеваемости. Определено, что степень реализации соматических эффектов, вызываемых ионизирующим излучением, была выше в отношении болезней крови и кроветворных органов, эндокринной системы, системы кровообращения, органов дыхания, костно-мышечной системы.

Выявлены характерные иммунологические нарушения у населения, проживающего вблизи СИЯП и у лиц, подвергавшихся радиационному воздействию в различных дозах.

Установлено экспериментально, что в отдаленном периоде после воздействия различных доз гамма-излучения происходят неоднозначные изменения со стороны основных звеньев иммунной системы: после воздействия сублетальных и фракционированных доз гамма-излучения наблюдается активация функционального состояния клеточного звена, а воздействие малых доз вызывает супрессию клеточного звена. В гуморальном звене после сублетального и фракционированного гамма-излучения отмечается депрессия, после малых доз – повышение абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов. Показано, что содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови снижено после воздействия на организм сублетальных и фракционированных доз и повышено после малых доз гамма-излучения. Выявлено, что различные дозы гамма-излучения вызывают активацию неспецифической фагоцитарной резистентности организма.

Изучено состояние иммунного статуса у потомков облученных белых крыс. Иммунологические нарушения были обусловлены повышением содержания В-лимфоцитов, снижением количества субпопуляций общих Т-лимфоцитов, лимфоцитов с хелперной активностью и иммунорегуляторного индекса.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты доказывают, что учет хромосомных аберраций – один из наиболее чувствительных из всех биологических методов для людей, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения в прошлом, и, что стабильные аберрации продолжают существовать и после прекращения радиационного воздействия, и являются одним из достоверных способов реконструкции биологических доз, полученных населением при радиационных инцидентах прошлых лет.

Результаты клинико-эпидемиологического исследования могут служить основанием для последующей разработки программ диагностики, лечения и реабилитации населения, пострадавшего от деятельности СИЯП.

Выявленные особенности реагирования иммунной системы на различные дозовые нагрузки у экспериментальных животных и их потомства определяют важную роль в прогнозировании отдаленных радиационных эффектов, имеющих дозозависимый характер.

Результаты работы позволяют экстраполировать основные закономерности формирования отдаленных эффектов воздействия ионизирующего излучения на популяции людей, проживающих в регионах с неблагополучной радиоэкологической обстановкой.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основании частоты стабильных аберраций (транслокаций) определен диапазон дозы хронического облучения у населения, проживающего вблизи СИЯП: 0,1-2,6 Гр. Повышенный уровень нестабильных хромосомных аберраций у населения Абралинского и Бескарагайского районов Восточно-Казахстанской области и их потомков, по отношению к контрольным значениям, определяется высокой частотой дицентрических и кольцевых хромосом.

2. Отдаленные последствия воздействия ионизирующего излучения у населения, проживающего на территориях Абралинского и Бескарагайского районов, и их потомков, характеризуются повышенными по отношению к контрольному Кокпектинскому району, уровнями распространенности и рисков общесоматических болезней.

3. У населения, проживающего вблизи СИЯП, и у лиц, подвергавшихся радиационному воздействию в различных дозах, выявленная иммунологическая недостаточность проявляется в снижении количественного состава показателей клеточного звена, фагоцитарной активности нейтрофилов и повышении гуморальных факторов иммунитета.

4. После воздействия различных доз гамма-излучения у экспериментальных животных в отдаленном периоде отмечается активация неспецифического фагоцитарного звена. Сублетальные и фракционированные дозы гамма-излучения активизируют клеточное звено иммунитета, вызывают депрессию гуморального звена, малые дозы активизируют гуморальное звено и вызывают нарушение хелперно-супрессорного соотношения. Состояние иммунного статуса у потомков облученных белых крыс, характеризуется иммунологической недостаточностью.

Апробация работы

Результаты работы доложены и обсуждены на: Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (Томск, 2004); 10-м Международном симпозиуме «Dosimetry Workshop on the Semipalatinsk Nuclear Test Site Area» (Хиросима, 2005); III Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (Томск, 2005); II Международной научно-практической конференции «Семипалатинский испытательный полигон. Радиационное наследие и проблемы нераспространения» (Курчатов, 2005); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии и пути их решения» (Семипалатинск, 2007); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Семипалатинск, 2007); Международной научно-практической конференции «Эхо полигона и мир без ядерного оружия» (Семей, 2009).

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр физиологических и биофизических дисциплин, общей гигиены и эпидемиологии Государственного медицинского университета г. Семей. Практические рекомендации, вытекающие из результатов научных исследований, по оценке генетического риска у женщин, проживающих вблизи СИЯП, внедрены в клиническую работу КГКП «Перинатальный центр г. Семей» и применяются врачами-генетиками данного учреждения.

Изданы методические рекомендации «Концептуальные принципы и новые компьютерные технологии создания Государственного научного автоматизированного медицинского регистра населения Казахстана, повергавшегося воздействию ионизирующей радиации».

В процессе выполнения работы получено свидетельство о госрегистрации права интеллектуальной собственности «Способ прогнозирования генетических последствий облучения малыми дозами» (№ 2010/1166.1 от 21.09.2010г.).

Работа выполнена в рамках программы Государственного медицинского университета г. Семей «Состояние здоровья и реабилитация населения, проживающего в регионе Семипалатинского полигона», номер госрегистрации 0105РК0054, шифр 0.0344.

Клинико-эпидемиологическое исследование было выполнено в 2003-2007 гг. и состояло из нескольких этапов. На начальном этапе проведено определение территории и групп обследованных лиц для наблюдения. В качестве территорий наблюдения были выбраны Абралинский и Бескарагайский районы до 1996 года, относящиеся к Семипалатинской области. В данное время оба района находятся в составе Восточно-Казахстанской области, в период испытаний ядерного оружия данные районы находились в 35-160 км от эпицентра и, следовательно, эти территории подвергались неоднократному радиационному загрязнению, а население получило высокие дозы как внешнего, так и внутреннего облучения. Величина эффективной дозы, полученная жителями этих районов в период проведения испытаний ядерного оружия, составляла 100>сЗв. Группа контроля представлена жителями Кокпектинского района, расположенного на расстоянии нескольких сотен километров юго-восточнее от Семипалатинского испытательного полигона и население которого подвергалось минимальному радиационному воздействию в дозах 7<сЗв [Гусев Б.И., 1996].

Выполнение следующего этапа исследований осуществлялось посредством метода диспансерного обследования сформированных групп бригадами врачей в составе терапевта, невропатолога, кардиолога, эндокринолога, гинеколога, генетика, врача УЗИ – диагностики. Общее число обследованных лиц показано в таблице 2.
Таблица 2 - Общее количество обследованных лиц

Группы обследованных лиц	Основная группа (районы)		Всего	Контрольная группа	Всего
	Абралинский	Бескарагайский		Кокпектинский
исследуемое население	307	313	620	250	870
их потомки	108	180	288	202	482
итого	415	493	908	452	1360

При отнесении каждого конкретного лица к той или иной группе использовали факт проживания на данной территории в определенные временные периоды и обязательное наличие кровных родственных связей между поколениями. Так, к исследуемому населению отнесены лица, подвергавшиеся непосредственному облучению, которые родились и постоянно проживали в период 1949-1964 гг. на обозначенных территориях. Их потомки – лица, родившиеся и проживавшие в этих же районах в период с 1965-1980 гг. Выбранный контроль базировался на статистической информации о численности, половом и возрастном составе и был близок по нерадиационным факторам (в частности, этническим) к основной группе.

Материалом для проведения цитогенетического обследования явилась культура лимфоцитов периферической крови человека. Забор крови производили из локтевой вены в пробирки с гепарином у 215 лиц основной и 50 лиц контрольной группы и их потомков. В обследование включались практически здоровые лица, не подвергавшиеся рентген – исследованию в течение последних шести месяцев.

Препараты хромосом готовились по стандартной методике (рутинный метод). От каждого обследованного анализировалось от 350-500 метафаз, содержащие по 23 пары хромосом. Изучались аберрации хромосомного и хроматидного типов и учитывались парные фрагменты, кольцевые, дицентрические хромосомы и хроматидные фрагменты.

Изучение стабильных хромосомных аберраций-маркеров радиационного повреждения проводили FISH-методом. Забор крови, культивирование, фиксация препаратов хромосом проведена в цитогенетической лаборатории Научно-исследовательского института радиационной медицины и экологии (НИИ РМЭ), следующий этап - окраска специальными маркерами - в лаборатории ORISE (США) с использованием ДНК-проб для хромосом 1, 2 и 4. Препараты хромосом анализировали на флуоресцентном микроскопе, на каждого было проанализировано по 1000 метафаз.

Изучение иммунного статуса у населения изучаемых районов проводили путем иммунофенотипирования с использованием набора моноклональных антител. Определяли абсолютное и относительное количество CD3+, CD4+, CD8+, CD21+ лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов и количество основных иммуноглобулинов сыворотки крови IgА, IgМ, IgG методом радиальной иммунодиффузии.

Экспериментальные исследования выполнялись на 200 белых беспородных половозрелых крысах обоего пола массой 180±20 г и их потомках. Влияния сублетального и фракционированного гамма-излучения на иммунологическую реактивность в отдаленном периоде изучалось совместно с соискателем Узбековой С.Е.

Животные были предварительно подготовлены к облучению на рентгенсимуляторе «Terasix» в специальной клетке, с последующим облучением заданной дозой непосредственно на гамма-терапевтическом аппарате «Teragam» [Сандыбаев М.Н., с соавт. 2009].

Первая группа животных подвергалась общему гамма-облучению в дозе 6 Гр, вторая группа животных подвергалась общему фракционированному воздействию гамма-лучами по 1,5 Гр×4 раза, третья группа - в дозе 0,2 Гр. Основанием для выбора дозы облучения 6 Гр в качестве сублетальной послужил тот факт, что по данным ряда исследователей [Вершинина С.Ф., Маркочев А.Б., 1995], при однократном гамма-облучении она является LD₅₀ для белых крыс, подвергнутых эксперименту. Для изучения влияния фракционированного гамма-облучения в суммарной дозе 6 Гр, животных облучали 4 раза с интервалом 7 дней дозой 1,5 Гр. Расчетным способом была определена малая доза - 0,2 Гр, для белых крыс. Облученных животных делили на две группы: первую группу забивали для исследования, вторую - отсаживали в отдельные клетки для получения приплода.

При этом проведены следующие исследования:

1. Влияние общего гамма-излучения в дозе 6 Гр на иммунологическую реактивность организма белых крыс через 30 (ближайший) и 90 (отдаленный период) дней.

2. Влияние общего фракционированного гамма-излучения в суммарной дозе 6 Гр на иммунологическую реактивность организма белых крыс через 30 (ближайший) и 90 (отдаленный период) дней.

3. Влияние общего гамма-облучения в дозе 0,2 Гр на иммунологическую реактивность организма белых крыс через 30 (ближайший) и 90 (отдаленный период) дней.

4. Изучение иммунного статуса у потомков облученных белых крыс.

Кровь для иммунологических исследований брали из хвостовой вены. Спектр изучаемых иммунологических показателей у экспериментальных животных включал: определение количества В- и Т-лимфоцитов и их субпопуляций методом иммунофлуоресцентного окрашивания клеток с использованием антител, конъюгированных с FITC; реакцию торможения миграции лейкоцитов по методу Артемовой А.Г. (1973); циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) по методу Гринкевич Ю.А. (1981); фагоцитарной активности полинуклеаров по методу Кост Е.А и Стенко М.И. (1962); НСТ-тест по методу, разработанному в институте иммунологии МЗ РФ (Москва). Для изучения клеток в лимфоидных органах животных готовили клеточные суспензии из костного мозга, тимуса, селезенки, лимфатических узлов тонкого кишечника. Определяли общее количество лимфоидных клеток, лимфоидного индекса и массу органа [Гольдберг Е.Д., 1972; Жетписбаев Б.А., 1995].