Перенос энергии

Глава 10 Перенос энергии

Флуоресцентный перенос энергии - это перенос энергии возбужденного состояния от донора d к акцептору а. Он происходит без промежуточного испускания фотонов и является в основном результатом диполь-дипольных взаимодействий между донором и акцептором. Скорость переноса энергии зависит от степени перекрывания спектра испускания донора со спектром поглощения акцептора, относительной ориентации дипольных моментов пере­ходов и расстояния между молекулами. Именно эта зависимость от расстоя­ния привела к широкому использованию переноса энергии для измерения расстояний между донорами и акцепторами. Для таких измерений необходи­мо, чтобы пара d -а была разделена расстоянием, которое не изменялось бы за время жизни возбужденного состояния донора. В дополнение к этому мы также рассмотрим применение переноса энергии для определения распределения расстояний между парами d - а, скорости взаимной диффузии d и а и расстояния максимального сближения. Зависимость флуоресцентного пере­носа энергии от всех перечисленных факторов обеспечивает значительные возможности использования метода для биохимических исследований.

В этой главе будет рассмотрен безызлучательный перенос, который про­исходит в результате диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором и не является простым испусканием и перепоглощением фотонов. Последнее — излучательный перенос, зависящий от менее интересных оптичес­ких свойств образца, таких, как размер кюветы с образцом, оптические плот­ности образца на длинах волн возбуждения и флуоресценции и точная геомет­рия пучков возбуждающего и испускаемого света. В противоположность этим тривиальным факторам безызлучательный перенос энергии содержит богатую информацию касающуюся подробностей строения молекул донорно-акцепторных пар. Константа скорости переноса энергии от специфического донора к специфическому акцептору k_Т определяется выражением

(10.1)

где т_d - время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора; r - расстояние между донором и акцептором; R₀ - характеристическое расстояние, называемое фёрстеровским радиусом, при котором эффективность переноса составляет 50% [1]. Такая зависимость скорости переноса от рас­стояния привела к многочисленным применениям переноса энергии в биохими­ческих исследованиях, в особенности потому, что фёрстеровский радиус нахо­дится в пределах 20 - 50 Ǻ. Этот диапазон расстояний сравним с диаметром большинства белков и толщиной биологических мембран. Любые явления, кото­рые оказывают влияние на расстояние d - а, будут влиять на скорость пере­носа энергии, что позволяет их количественно охарактеризовать. Например, измерение переноса энергии было использовано для оценки расстояния между связывающими центрами белков, расстояния между хромофорными группами белков и другими, связанными с мембранами хромофорами, латеральной ас­социации мембранных компонентов, реакций ассоциации между макромолеку­лами. В этих приложениях используется степень переноса энергии между фиксированными донорами и акцепторами для установления расстояния между ними [2,3].

Новое и в равной степени интересное приложение метода переноса энер­гии — определение статических и динамических конформационных свойств макромолекул в растворе [ 4]. При детальном анализе кинетики затухания флу­оресценции донора можно в принципе определить распределение расстояний . между парами d - а и скорость, с которой донор и акцептор диффундируют относительно друг друга. С помощью таких измерений можно было бы вы­являть детали структурной гетерогенности макромолекул и структурные флу­ктуации этих молекул на сравнительно больших расстояниях (~ 40 Ǻ). В настоя­щее время подобный детальный анализ требует тщательной оценки как при по­лучении, так и при интерпретации спектральных данных. Тем не менее выяв­ленные возможности метода переноса энергии скорее всего приведут к не­прерывному развитию необходимых методов.

В заключение будет рассмотрен перенос энергии в предельном случае быстрой диффузии. В этом случае не имеют значения ни пространственное рас­пределение донора и акцептора, ни их скорости диффузии. Эффективность пере­носа энергии ограничивается только расстоянием максимально возможного сближения между донором и акцептором. Это явление может быть использова­но для определения глубины залегания хромофоров в мембранах или белках по отношению к поверхности раздела макромолекула/вода.

Следует отметить, что изучение переноса энергии дает молекулярную ин­формацию, отличающуюся от той, которая может быть получена из релаксации растворителя, реакций в возбужденном состоянии, тушения и поляризации флуоресценции. Все перечисленные спектральные свойства флуорофоров характе­ризуют в первую очередь их взаимодействие с другими молекулами в окружаю­щей сольватной оболочке. За исключением влияния на спектральные свойства донора и акцептора, эти взаимодействия менее важны для переноса энергии. Безызлучательный перенос энергии эффективен на расстояниях до 50 Ǻ. Нахо­дящийся в этом промежутке растворитель или макромолекула слабо влияют на эффективность переноса энергии, которая главным образом зависит от рассто­яния d - а. В следующем разделе изложена простейшая теория безызлучатель-ного переноса энергии и обсуждены те факторы, которые ограничивают ее использование. Эта теория приложима к парам d - а, находящимся на фикси­рованном расстоянии. Для анализа других часто встречающихся ситуаций не­обходимо более сложное математическое описание. Для иллюстрации широких возможностей метода переноса энергии будут приведены типичные примеры.

10.1. Теория переноса энергии для донорно-акцепторных пар

Рассмотрим донор и акцептор, находящиеся на фиксированном рас­стоянии r. Константа скорости переноса энергии от d к а определяется выра-жением

Его размерность М^-1 • см³. F_d(λ) — безразмерная величина. Размерность ε_a (λ) - М^-1 см^-1. Постоянные члены в уравнении (10.2) обычно объединяют для определения фёрстеровского радиуса R₀ как расстояния, на котором кон­станта скорости переноса энергии k_Т равна константе скорости затухания флуоресценции донора в отсутствие акцептора (Г_d = τ _d^-1 ). На этом расстоянии половина молекул донора дезактивируется за счет переноса энергии, а поло­вина — по обычным излучательным или безызлучательным механизмам. Из уравнения (10.2) и k_Т = т_d^-1 получаем

Используя определение R₀ и уравнение (10.2), легко показать, что константа скорости переноса энергии определяется простым выражением:

Постоянные члены в уравнении (10.5) могут быть объединены:

Часто измеряют эффективность переноса энергии Е, которая определяется как отношение числа поглощенных донором фотонов к числу фотонов, перенесенных на акцептор:

Эффективность переноса энергии часто вычисляют, исходя из относительного квантового выхода флуоресценции в присутствии (F_da) и в отсутствие (F_d) акцептора или времен затухания в этих же условиях (τ_da, и τ_d соответ­ственно):

Уравнение (10.10) можно получить из (10.9), если учесть

Уравнение (10.11) можно вывести, если принять во внимание, что F_da/F_d = = Г_d/(Г_d + k_Т). Эффективность переноса энергии можно непосредственно свя­зать с расстоянием:

Это уравнение получается при подстановке (10.6) в (10.9).

Важно осознать, что предположения, использованные при выводе этих уравнений, применимы только к донорно-акцепторным парам, разделенным фиксированным расстоянием. Эта ситуация часто встречается для маркирован­ных белков, но фиксированных донорно-акцепторных расстояний, как правило, не бывает ни для смеси донора и акцептора в растворе, ни для доноров и ак­цепторов, равномерно распределенных в мембране. В этих случаях необ­ходимы более сложные выражения, и их, как правило, выводят путем усред­нения константы скорости переноса в соответствии с предполагаемым про­странственным распределением донорно-акцепторных пар. Далее, фиксирован­ные расстояния d -а приводят к единственной скорости переноса, и, как следствие, кинетика затухания интенсивности флуоресценции должна быть одноэкспоненпиальной. Одноэкспоненциальные кинетики затухания флуорес­ценции донора не ожидаются и не наблюдаются для случаев, когда расстоя­ние d -а не является фиксированным (разд. 10.6).

Если считать модель с единственным расстоянием d - а приемлемой, то легко заметить, что скорость переноса энергии зависит от расстояния R₀ , ко­торое в свою очередь определяется величинами к, n, φ_d и J , которые должны быть известны для вычисления расстояния. Показатель преломления обычно известен из состава растворителя, φ_d определяют путем сравнения со стан­дартными соединениями, а интеграл перекрывания для пары d -а должен быть вычислен. Чем больше интеграл перекрывания спектра испускания доно­ра со спектром поглощения акцептора, тем больше значение R₀ . Акцепторы с большим коэффициентом экстинкции приводят к большим значениям R₀. Важ­но отметить, что в уравнениях, приведенных выше, предполагается, что при связывании с акцептором время затухания флуоресценции донора не изменя­ется по каким-либо иным причинам кроме безызлучательного переноса энер­гии. Для маркированных макромолекул это не всегда может быть так. Аллостерические взаимодействия между центрами связывания донора и акцептора могут изменить время затухания для донора за счет или усиления других про­цессов затухания, или, наоборот, предотвращения этих процессов [6]. В та­ких случаях необходим более сложный анализ кажущейся эффективности пе­реноса (разд. 10.7).

Зависимость R₀ от спектрального перекрывания иллюстрируется рис. 10.2, на котором представлены данные для переноса энергии от изомеров маркиро­ванного дансилом фосфатидилэтаноламина (DPE) к маркированному эозином липиду (ЕРЕ). Все изомеры DPE обладают разными спектрами испускания [7] Чем боль­ше спектр изомеров DPE сдвинут в длинноволновую область, тем сильнее пере­крывание со спектром поглощения ЕРЕ и тем больше значение R_о(табл. 10.1). Видно, что R₀ не сильно зависит от J . Это происходит из-за зависимости от корня шестой степени в уравнении (10.7).

Важным в анализе эффективности переноса энергии является ориента-ционный фактор к² , который определяется выражением

где θ_т, - угол между диполем испускания донора и диполем поглощения акцеп­тора; θ_d и θ_a — углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор (рис. 10.1).

РИС. 10.1. Диполи донора и акцеп­тора, находящиеся на фиксированном расстоянии r.

РИС. 10.2. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции маркирован­ных дансилом и эозином липидов [7]. 1 - испускание; 2 - возбуждение, Дан­силом и эозином маркированы произ­водные фосфатидилэтаноламина. Числа соответствуют расположению диэтил-аминовой и сульфонильной групп в на­фталиновом кольце. Коэффициент эк-стинкции ЕРЕ равен 85000 М-1. см-1 при 527 НМ. (С разрешения American Chemical Society.)

Таблица 10.1. Вычисленные значения R₀ [7]

a Маркированный дансилом фосфатидилэтаноламин.

б Маркированный эозином фосфатидилэтаноламин.

Это значение обычно и используют для вычисления R₀ . Альтернативно можно принять, что имеется диапазон статических ориентации донора и акцептора, не изменяющихся за время жизни возбужденного состояния. В этом случае к² = 0,476 [ 3]. Для флуорофоров, связанных с макромолекулами, сегменталь­ные движения донора и акцептора могут разупорядочивать ориентацию. Более того, если поляризация донора и акцептора мала (< 0,3), то погрешность в расстоянии, вероятно, будет менее 10% [10].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ ОТ r⁶. Согласно теории безызлучательного диполь-дипольного пере­носа энергии, для фиксированных расстояний между донором и акцептором эффективность переноса энергии зависит от r⁶, где г — расстояние между мо­лекулами донора и акцептора. Предсказанная зависимость от расстояния была подтверждена экспериментально, и полученные результаты иллюстрируют ин­терпретацию данных по переносу энергии. В работах [ 11] и [12] изучены олигомеры поли-L-пролина, маркированного по противоположным концам нафтилом (донор) и дансилом (акцептор) (рис. 10.3). Число пролиновых остатков (п) между этими флуорофорами варьировалось от 1 до 12. Поли-L-пролин обра­зует жесткую спираль с известными атомными размерами, что обеспечивает фиксированное расстояние между донорными и акцепторными участками в диапазоне от 12 Ǻ (n = 1) до 46 Ǻ (n = 12).

Спектры возбуждения этих производных приведены на рис. 10.4. Эффек­тивность переноса энергии определяли по проявлению флуоресценции акцепто­ра при возбуждении донора. Дансил-L-пролилгидразид не содержит донора, и, следовательно, его спектр возбуждения принимается за спектр, соответствую­щий 0% переноса. При любой данной длине волны об эффективности переноса энергии Е можно судить по амплитуде спектра возбуждения акцептора а в со­ответствии с А = ε_a + Eε_d, где ε_a и ε_d , - коэффициенты экстинкции акцептоpa и донора соответственно.

РИС. 10.3. Структура дансил(L-пропил)_n-α-нафтила, использованного для изуче­ния переноса энергии [11].

РИС. 10.4. Спектр возбуждения дансил-пролиповых молекул.

1 — дансил-L-пролил-а-нафтил, 100% переноса; 2— дансил(L-пролип)_n- α -нафтил (п =5, 7, 8, 10 и 12); 3 — дансил-L-пролилгидразид, 0% переноса.
Для дансил-L-пролил-α-нафтила, в котором до­нор и акцептор расположены близко, эффективность переноса энергии состав­ляет 100%. Для этой донорно-акцепторной пары наибольшая чувствительность спектра возбуждения к переносу энергии наблюдается при 290 нм — максиму­ме поглощения нафтилового донора. Для других производных эффективность переноса имеет промежуточное значение и зависит от длины прокладки из L-пролина. Эффективность переноса энергии определенно уменьшается с уве­личением длины прокладки.

РИС. 10.5. Зависимость эффективности переноса энергии в дансил(L-пропип)-a-нафтипе от расстояния (n = 1 — 12).

где R₀ и r имеют их обычный смысл, а j — показатель степени, который не­обходимо определить из наблюдаемой зависимости Е от r. Преобразование уравнения (10.14) дает

Следовательно, график зависимости lg(E -1- 1) от lg r имеет наклон j (рис. 10.5). Наклон равен 5,9 ±0,3 [11, 12]. Из этого превосходного соответ­ствия с предсказываемым значением j = 6 авторы работ [11, 121 заключили, что перенос энергии описывается теорией Фёрстера. В этих экспериментах по­ляризация акцептора, возбуждаемого за счет переноса энергии, была равна нулю, даже когда она измерялась в застеклованном растворителе. Это указы­вает на разупорядочивание поляризации в ходе переноса энергии и корректность использования к²= 2/3. Важным аспектом рассматриваемых экспериментов является наличие жесткой прокладки между донором и акцептором. Если бы прокладки были гибкими, то существовало бы распределение расстояний меж­ду донором и акцептором, что сильно усложнило бы анализ. Более того, если бы прокладка не была жесткой, то расстояние между парами донора и акцепто­ра могло бы меняться в течение времени жизни возбужденного состояния, что также могло бы привести к значительному усложнению анализа данных. В разд. 10.4 будет показано, как такие усложняющие обстоятельства могут быть учтены при использовании кинетики затухания флуоресценции донора.

В работе [13] проверялась зависимость скорости переноса энергии в пер­вой степени от интеграла перекрывания. Эти эксперименты обсуждаются в задаче 10-1 в конце главы.

10.2. Измерение расстояний методом переноса энергии

В предыдущем разделе была описана теория, пригодная в случае фикси­рованного расстояния между донором и акцептором. Измерение скорости пе­реноса энергии позволяет вычислить расстояние между донором и акцептором -метод, широко используемый в биохимических исследованиях. Превосходный пример применения флуоресцентного переноса энергии для определения рас­стояния между различными связывающими центрами белка можно найти в ра­боте [14]. При подходящих обстоятельствах по этим расстояниям можно сде­лать вывод о форме белка и локализации связывающих центров. Был изучен родопсин — фоторецепторный белок пластинчатых мембран в палочках сетчат­ки глаза позвоночных. Хромофорной областью родопсина является 11-цис-ре-тиналь. Хромофор (ретиналь) изомеризуется при поглощении света, и это слу­жит сигналом поглощения фотона. Максимум поглощения находится при 500 нм, т.е. в области, благоприятной для проявления ретиналем акцептирующих свойств по отношению к большому числу флуорофоров.

Родопсин маркировали в трех различных точках (А, Б и В) семью различ­ными флуорофорами (рис. 10.6). Каждый из этих флуорофоров может дониро-вать энергию ретиналю с R , находящимся в диапазоне 33 - 51 А. Эффектив­ность переноса энергии измерялась и по относительным квантовым выходам в отсутствие (Q b ) и в присутствии (Q_d) акцептора, и по временам затухания T_b и -t_d (присутствие акцептора указывается индексом d). Под воздействием света ретиналь обесцвечивается (индекс b ), и исчезает его полоса поглощения при 500 нм (рис. 10.7). Это благоприятное обстоятельство позволяет измерять времена затухания и квантовые выходы в отсутствие переноса энергии просто по обесцвечиванию акцептора. Вслед за обесцвечиванием ретиналя времена затухания и квантовые выходы всех доноров возросли (табл. 10.2). Была получена совершенно одинаковая эффективность переноса и по временам затухания, и по измерению квантового выхода. Во всех случаях эффективность была низкой, что для различных донорно-акцепторных пар указывает на расстояния, больше чем R.

Как было описано ранее, если связывание жесткое, то относительная ориентация донорно-акиепторных пар может влиять на значение к² и, следова­тельно, на вычисляемые значения расстояний г. В рассматриваемом случае было использовано несколько разных доноров для каждого центра связывания и получены приблизительно одинаковые расстояния для каждого центра связы­вания и для каждого донора. Так как мало вероятно, чтобы относительная ориентация диполей излучения каждого донора была одна и та же, соответствие между индивидуальными измеренными расстояниями указывает на то, что вли­яние фактора ориентации на вычисленные расстояния мало.

Одним из интересных выводов работы [14] является большое вычислен­ное расстояние между центром А и областью ретиналя, которое составляет 75 А. Если бы молекула родопсина была сферической, ее диаметр не превы­шал бы 40 - 45 А. Следовательно, расстояние 75 А между центром А и об­ластью ретиналя указывает на вытянутую структуру молекулы (рис. 10.8). Было также измерено расстояние между центрами А, Б и В.

Таблица 70.2. Характеристики переноса энергии на цис-рети-наль [14]

Таблица 70.3. Характеристики перекоса энергии между хромофорами в центрах А, Б и В обесцвеченного родопсина [14]

РИС. 10.8. Модель молекулы родопсина, базирующаяся на наблюдаемых расстоя­ниях между центрами.

Во многих случаях полезная информация об ассоциации макромолекул мо­жет быть получена методом переноса энергии, даже если эти данные не исполь­зуются для определения расстояния между молекулами донора и акцептора. Так, авторы работы [15] использовали перенос энергии между маркированны­ми молекулами Мg²⁺-Са²⁺-АТРазы для того, чтобы определить, находятся ли молекулы АТРазы в мембране в агрегированном состоянии.

Mg²⁺-Ca²⁺-ATPaзы из саркоплазматического ретикулума маркировалась отдельно 5-[ 2-(иодацетил)аминоэтил-5-аминонафталин-1-сульфокислотой (1,5-IAEDANS) и отдельно иодацетамидофлуоресцеином (IAF) (рис. 10.9). IAEDANS является донором, a IAF - акцептором. Раздельно маркированные молекулы АТРазы встраивались в разные фосфолипидные везикулы. В результате сме­шивания раздельно встроенных молекул АТРазы было получено, что спектр испускания представляет собой сумму спектров испускания раздель­но маркированных молекул. Следовательно, во временной шкале данно­го эксперимента не происходит переноса энергии между IAEDANS и IAF. Это указывает на медленный обмен молекулами АТРазы между раздель­но реконструированными везикулами. Однако если маркированные IAEDANS и IAF молекулы АТРазы встраиваются в одни и те же липидные везикулы, то флуоресценция IAEDANS частично тушится, а флуоресценция IAF усиливается (рис. 10.9). Эти результаты согласуются с появлением переноса энергии между молекулами донора и акцептора. Возможно, наблюдаемый перенос энергии может быть вызван просто близким расположением маркированных молекул АТРазы при встраивании в одни и те же везикулы. Или точно так же перенос энергии может быть обусловлен латеральной диффузией мономеров АТРазы в плоскости липидного бислоя. Эти возможности были проверены добавлением избытка липида к разбавленному раствору АТРазы. Добавление липида, приво­дящее к 10-кратному разбавлению АТРазы, не влияет на степень переноса энергии. Наоборот, добавление 10-кратного избытка немаркированной АТРазы ликвидирует перенос энергии. Оба наблюдения находятся в соответствии с об­разованием агрегатов АТРазы в мембране.

Эти эксперименты иллюстрируют, каким образом метод переноса энергии может быть использован для прямой проверки наличия ассоциации между ма­кромолекулами. Дальнейшая характеристика этой системы требует более де­тальных экспериментов. Из приведенных данных нельзя сделать вывод, обра­зует ли АТРаза димер, тетрамер или другие агрегаты. Действительно, в экспериментах не ставилась цель — выявить эти свойства. Степень маркирования была различной - обстоятельство, которое может сильно усложнить более тщательный анализ, но не влияющее на приведенные выше выводы.