Оценка аутофагии в Т-лимфоцитах по уровню экспрессии LC3 белка

Аналогичные результаты были получены и на проточном цитофлуориметре, с помощью которого возможно количественно оценить интенсивность флуоресценции (рис. 13, а). Статистический анализ показал, что экспрессия LC3B белка достоверно выше (р˂0,05) в группе с тяжелой формой астмы (рис. 13, б).

а

б

в

а б

Для переваривания клеточных компонентов, подлежащих удалению, необходимо слияние аутофагосом с лизосомами, содержащие гидролазы, в результате чего образуются аутофаголизосомы (Mehrpour, 2010). Поэтому количество аутофагосом в клетках должно коррелировать с количеством лизосом.

В результате проведенных исследований мы установили наличие лизосом в Т-клетках больных как легкой, так и тяжелой формами астмы (рис. 14, б, в). Их количество и интенсивность экспрессии была выше в группе больных с тяжелой формой АБА (рис. 14, в).

LC3 белок (микротубилин-связанный белок легкой цепи 3) присутствует в цитозоле большинства типов клеток и существует в трех изоформах (А, В и С). При запуске аутофагии под воздействием цистеиновой протеазы Atg4 он протеолитически разрушается, образуя LC3-I форму (Kabeya, 2000). Отщепленный LC3-I белок затем активируется с помощью E1-подобного фермента Atg7 и переносится к Atg3 белку до его коньюгации с фосфатидилэтаноламином и образования LC3-II формы (Klionsky, 2003). LC3-II белок вовлекается в растущую фагофору и распологается на внутренней и внешней мембране аутофагосомы. Преобразование LC3-I (18 кДа) в LC3-II (16 кДа) может быть использована для мониторинга аутофагии.

а

б

в

Результаты иммуноблоттинга согласовывались с результатами электронной и флуоресцентной микроскопий. Мы установили, что у здоровых доноров маркерный белок аутофагии присутствует в общей (LC3-I) форме, которая находится в цитоплазме и не связана с мембраной аутофагосом. При этом дексаметазон не оказывал влияния на образование LC3-II формы (рис. 15, лунки 2,3).

1 2 3 4 5 6 7 М - + - + - +	Рис. 15. Экспрессия LC3B белка в двух изоформах (I и II) в Т-лимфоцитах после 3 дней: М – белковый маркер 2,3 - здоровый донор 4,5 – легкая форма АБА 6,7 – тяжелая форма АБА (+) - культивирования с дексаметазоном (-) - культивирования без дексаметазона.

Результаты исследования влияния дексаметазона на преобразование форм LC3 белка показали, что глюкокортикоид не отвечает за образование LC3-II белка, т.е. проявляет резистентность по отношению к формированию аутофагосом (рис. 15, лунка 5). Дополнительным подтверждением полученным результатам являются данные электронно-микроскопического изучения Т-лимфоцитов больных легкой формой заболевания, которые показали, что дексаметазон способствует интенсивной активации апоптоза клеток, но не аутофагии (рис. 10, г).

В лизатах клеток больных тяжелой формой астмы LC3 белок присутствовал и в форме I, и в форме II (рис. 15, лунка 6). Причем под воздействием дексаметазона большая часть LC3 белка преобразована во II форму (рис. 15, лунка 7).

Подводя итог по полученным результатам можно сказать, что стрессовые условия влияют на активацию аутофагии в Т-лимфоцитах больных астмой в отличие от здоровых доноров. Но проявления аутофагии были различными в зависимости от тяжести астмы.

Мы предполагаем, что в группе с легкой формой астмы изначально в Т-клетках активируется аутофагия и затем переходит в ПКГ II типа (аутофагическую гибель), компенсируя, таким образом, недостаточное проявление апоптоза.

В группе с тяжелой формой астмы интенсивная активация аутофагии на фоне снижения апоптотической активности является причиной длительного функционирования клеток и персистенции бронхиальной астмы.

Поэтому на следующем этапе исследований была поставлена задача провести анализ содержания белков теплового шока Hsp70 и Hsp90, которые могут выступать в качестве регуляторов программированной клеточной гибели в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой.
Оценка экспрессии белков теплового шока HSP70 и HSP90 в процессе культивирования Т-лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой
В результате проведенных исследований мы показали, что культивирование Т-лимфоцитов больных легкой формой астмой в течение 3 дней инициирует повышение внутриклеточного белка теплового шока Hsp90, в отличие от другого белка - Hsp70 (рис. 16, лунка 4). Схожая картина была отмечена и в клетках, которые культивировались с дексаметазоном (рис. 16, лунка 5).

В Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмой установлено повышение содержания как белка Hsp90, так и Hsp70 (рис. 16, лунка 6). Учитывая цитопротекторное свойство БТШ и результаты морфо-биохимических исследований Т-клеток можно предположить, что экспрессия Hsp90 и Hsp70 у больных тяжелой формой АБА приводит к торможению апоптоза и одновременной активации аутофагии. Дексаметазон снижал содержание обоих белков теплового шока в клетках (рис. 16, лунка 7), что сопровождалось повышением уровня апоптоза (рис. 7, 8).

1 2 3 4 5 6 7 М - + - + - +	Рис. 16. Содержание внутриклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90 после 3 дней культивирования: М – маркер 2, 3 - здоровый донор 4, 5 – легкая форма АБА 6, 7 - тяжелая форма АБА «+» - культивирование с дексаметазоном. «-» - культивирование без дексаметазона

Мы также проанализировали содержание белков теплового шока во всех исследуемых группах на 6 сутки культивирования (рис. 17). Сравнительный анализ белкового состава (HSP70 и HSP90) показал наличие белка теплового шока 90 в Т-лимфоцитах больных астмой с разной степенью тяжести заболевания. Установлено появление белка HSP70 только в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмой (рис. 17, лунка 6).

Культивирование Т-лимфоцитов с дексаметазоном в течение 6 суток снижало содержание БТШ у здоровых доноров и больных тяжелой формой астмой (рис. 17, лунки 3,7). В Т-лимфоцитах больных легкой формой астмой отмечено незначительное снижение экспрессии HSP90 (рис. 17, лунка 5). При этом содержание HSP70 не было установлено в Т-клетках, которые культивировались с дексаметазоном.

1 2 3 4 5 6 7 М - + - + - +	Рис. 17. Содержание внутриклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90 после 6 дней культивирования: М – маркер 2, 3 - здоровый донор 4, 5 – легкая форма АБА 6, 7 - тяжелая форма АБА «+» - культивирование с дексаметазоном «-» - культивирование без дексаметазона

Ранее считалось, что белки теплового шока являются внутриклеточными белками, однако в последнее время доказано их существование во внеклеточной среде – в тканевых жидкостях человека и животных и кондиционной среде культур клеток (Евдонин, 2009).

Поскольку в клеточных лизатах белки HSP70 и HSP90 были установлены не во всех исследуемых группах, либо их содержание было не значительным, мы предположили, что это может быть связано с их выходом во внеклеточное пространство. С целью выяснения содержания внеклеточных белков теплового шока мы исследовали содержание культуральной среды, в которой находились Т-лимфоциты. Исследование проводилось на 3 и 6 сутки культивирования.

Проведенный анализ показал секрецию белка теплового шока 70 из Т-лимфоцитов во внеклеточную среду на 3 сутки культивирования в группе больных тяжелой формой астмой (рис. 18, лунка 6). Аналогичные результаты получены при культивировании клеток с дексаметазоном (рис. 18, лунка 6). Анализ культуральной среды, в которой находились Т-лимфоциты здоровых доноров и больных легкой формой астмой, показал отсутствие внеклеточных белков у этих групп (рис. 18, лунки 2,3,4,5).

На 6 сутки культивирования Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы выход HSP70 во внеклеточную среду сопровождался выходом другого шаперона – HSP90 (рис. 19, лунка 6). Присутствие дексаметазона в культуральной среде сказывалось на снижении внутриклеточного белка HSP90 и не влияло на содержание HSP70 (рис. 19, лунка 7). Результаты исследований двух других групп (здоровых доноров и больных легкой формой астмы) на 6 сутки культивирования совпадали с результатами, полученными на 3 сутки (рис. 19, лунки 2,3,4,5).

1 2 3 4 5 6 7 М - + - + - +	Рис. 18. Содержание внеклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90 в культуральной среде после 3 дней культивирования: М – маркер 2, 3 - здоровый донор 4, 5 – легкая форма АБА 6, 7 - тяжелая форма АБА «+» - культивирование с дексаметазоном «-» - культивирование без дексаметазона

1 2 3 4 5 6 7 М - + - + - +	Рис. 19. Содержание внеклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90 в культуральной среде после 6 дней культивирования: М – маркер 2, 3 - здоровый донор 4, 5 – легкая форма АБА 6, 7 - тяжелая форма АБА «+» - культивирование с дексаметазоном «-» - культивирование без дексаметазона

В настоящее время в литературе накапливаются сведения о том, что внеклеточный Hsp70 обладает множественными функциями (Евдонин, 2009). Показано, что растворимый рекомбинантный белок Hsp70 способен стимулировать пролиферацию NK-клеток, увеличивать их миграцию к опухолевым клеткам и цитолитическую активность против этих клеток (Multoff, 1999).

Опираясь на эти результаты можно предположить, что в случае периферической крови больных тяжелой формой астмы внеклеточный Hsp70 способен активировать NK-клетки и стимулировать их миграцию в зону воспаления, что приводит к уменьшению их содержания в периферической крови, в отличие от больных легкой формой АБА.

В отношении Hsp90 имеются данные относительно его роли в активации комплекса прекалликреин-кининоген на поверхности эндотелиальных клеток сосудов человека, который, как считается, участвует в развитии гиперреактивности бронхов при астме (Joseph, 2002).

Полученные результаты о содержании Hsp90 во внеклеточном простанстве больных тяжелой формой АБА в условиях in vitro, могут послужить основой более глубокого и детального изучения данного белка теплового шока in vivo.
Характеристика клеточного и гуморального звеньев иммунитета

На первом этапе исследования, мы определили содержание Т-клеток в периферической крови больных астмой и здоровых доноров. Результаты показали, что суммарное количество CD3 позитивных Т-лимфоцитов во всех исследуемых группах статистически не различалось (р<0,1) (рис. 20).

Рис. 20. Содержание CD3+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА) и у здоровых доноров. Достоверных отличий между исследуемыми группами не было выявлено.

В случае клеточно-опосредованного иммунного ответа главная роль принадлежит CD8+ Т-лимфоцитам и натуральным киллерам (NK) (Ройт, 2007). Изменения в содержании этих клеток в группе с легкой формой АБА были незначительными и находились на уровне контроля (рис. 21). Однако необходимо отметить большой разброс индивидуальных показателей в содержании натуральных киллеров (рис. 21, б). При легкой форме АБА патологические изменения, лежащие в основе заболевания, выражены незначительно, реакция иммунной системы на антиген не носит постоянного характера, воспалительные явления минимальны. Именно этим может быть объяснен широкий разброс индивидуальных показателей и разнонаправленные изменения.

У больных с тяжелой формой АБА установлено достоверное снижение количества цитотоксических Т-лимфоцитов и NK клеток по сравнению с группами контроля и легкой формой астмы (рис. 21), что подтверждает участие клеточного звена иммунитета в патогенезе больных тяжелой формой АБА. Уменьшение количества натуральных киллеров даже до 4-5% менее чем в половине случаев сопровождается угнетением функциональной (цитотоксической) активности этих клеток. Снижение количества обоих типов цитотоксических клеток — как CD8+Т-лимфоцитов, так и CD16+/56+ NK-клеток при тяжелой форме атопической бронхиальной астмы связано с заболеванием и носит устойчивый характер.

В развитие бронхиальной астмы могут быть вовлечены различные иммунопатогенетические механизмы и клетки иммунной системы (Wills-Karp, 2004), одними из которых являются NKT-лимфоциты. NKT-клетки - уникальная популяция Т-лимфоцитов, характеризующаяся коэкспрессией рецепторов Т-клеток и различных рецепторов NK-клеток (Umetsu, 2010).

Мы установили, что в периферической крови всех исследуемых групп, присутствует популяция Т-лимфоцитов, коэкспрессирующая маркеры NK-клеток (рис. 22). Их содержание было значительно выше у больных тяжелой формой заболевания по сравнению с другими группами. В группе легкой формы астмы содержание NKT-клеток практически не отличалось от контроля. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что NKT-клеткам принадлежит одна из ключевых ролей в патогенезе тяжелой формы заболевания.

В развитии воспаления дыхательных путей при бронхиальной астме важная роль принадлежит CD4+ Т-лимфоцитам (Zosky, 2009). Установлено, что большую часть CD4+ Т-клеток в очаге аллергического воспаления составляют Th2-лимфоциты (Colavita, 2000), которые продуцируют IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и участвуют в формировании гуморального иммунного ответа (Колхир, 2010). Они имеют прямое отношение к феноменам, наблюдаемым при аллергии и бронхиальной астме.

а

б

* достоверные отличия между группой больных тяжелой АБА и нормой (р<0,05);

** достоверные отличия между группой больных тяжелой АБА по сравнению с двумя другими группами (р<0,05);

*** достоверные отличия между группами с легкой и тяжелой АБА (р<0,05).

Рис. 22. Содержание NKT-клеток (CD3+CD16+56+) в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы (АБА) и здоровых доноров. * достоверные отличия между группой больных тяжелой формой АБА и двумя другими группами (р<0,05)

В нашей работе было проведено исследование содержания СD4+ Т-лимфоцитов в зависимости от степени тяжести астмы (рис. 23). Подсчет относительного числа СD4+ Т-лимфоцитов показал отсутствие изменений в численности данной субпопуляции у больных с легкой формой астмы по отношению к контрольной группе. Количество СD4+ клеток коррелировало с уровнем В-лимфоцитов, которое соответствовало норме, а содержание IgЕ, А, М и G в группе практически не отличалось от контроля (рис. 24). Несмотря на то, что активация гуморального иммунитета в группе с легкой формой заболевания выражена незначительно, имеется тенденция к повышению количества сывороточных иммуноглобулинов, на что указывает однонаправленный разброс значений, схожий с группой больных тяжелой формой АБА (рис. 24).

Увеличение количества CD4+ Т-лимфоцитов в группе с тяжелой формой АБА свидетельствует о значительной напряженности гуморального иммунитета (рис. 23). В сравнительном анализе иммуноглобулинов сыворотки крови больных тяжелой формой АБА установлено увеличение всех классов иммуноглобулинов, в частности IgE (рис. 24), что связано с высоким уровнем CD4+ Т-клеток, стимулирующие синтез специфических IgE-антител В-лимфоцитами.

Результаты проведенных иммунологических исследований свидетельствует об изменении функционального статуса Т-клеток у больных с тяжелой формой астмы. Особенность иммунологической реактивности при тяжелой форме АБА, в отличие от группы контроля и легкой формы, связана со снижением активности клеточно-опосредованного иммунного ответа с участием цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. Снижение уровня CD8+ Т-лимфоцитов сопровождается повышением другой субпопуляции Т-клеток – CD4+. Увеличение содержания CD4+ Т-лимфоцитов коррелирует с повышением уровня В-лимфоцитов и иммуноглобулинов класса E.

* достоверные отличия по отношению к норме (р<0,05).

		Рис. 24. Содержание иммуноглобулинов классов A, M, G и E в сыворотке крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА) и здоровых доноров.

Большое значение в оценке состояния иммунной системы имеет соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов (величина иммунорегуляторного индекса (ИРИ)) (Симонова, 2001). В литературе имеется много данных относительно изменения ИРИ при астме. Однако они очень противоречивы.

В нашем исследовании показатель ИРИ значительнее менялся у больных с тяжелой формой АБА (рис. 25). Величина индекса у больных с легкой формой находилась на уровне контроля. Однако необходимо отметить больший разброс значений индивидуальных показателей, чем в контроле, что, видимо, свидетельствует об отсутствии однозначного ответа иммунной системы на антигенную стимуляцию.

Поскольку Т-клетки играют важную роль в иммунной реактивности, локус Т-клеточного рецептора уже давно считается важным кандидатом, восприимчивый к таким заболеваниям иммунной системы, как астма, атопия и аутоиммунные заболевания (Rottem, 2003). Концепция аутоиммунитета как одной из составляющих в развитии бронхиальной астмы признается не всеми авторами. Однако имеется ряд работ, подтверждающие участие аутоиммунных процессов в патогенезе данного заболевания (Мельницкая, 1973; Rottem, 2003; Ye, 2006).

Рис. 25. Изменение соотношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы (АБА) и здоровых доноров. ** - достоверные отличия между группой больных тяжелой АБА по сравнению с двумя другими группами (р<0,01)

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что в сыворотке крови больных как легкой, так и тяжелой формой АБА наблюдается достоверное (p<0,05) по сравнению с контролем повышение уровня ЦИК. В частности наблюдалось повышение мелких и средних иммунных комплексов, которые играют важную роль в патологических процессах (рис. 26).

		Рис. 26. Концентрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) гигантских, крупных, средних и мелких размеров в сыворотке крови здоровых доноров и больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА). *Достоверные отличия по отношению к норме (р<0,05).

При исследовании содержания ЦИК во всех группах, было установлено, что соотношение концентраций ЦИК (коэффициент аутоиммунизации (К_А)) в сыворотке больных АБА по отношению к здоровым донорам возрастало (по медиане) линейно с уменьшением размера ЦИК.

При легком течении АБА: коэффициент К_А гигантских ЦИК (3%) увеличивался в 0,96 раз; крупных ЦИК (3,5%) - в 1,6 раз; К_А средних ЦИК (4%) - в 1,51 раз; К_А мелких ЦИК (7%) - в 1,86 раз.

При тяжелом течении АБА: коэффициент К_А гигантских ЦИК (3%) увеличивался в 1,06 раз; К_А крупных ЦИК (3,5%) - в 2 раза; К_А средних ЦИК (4%) - в 2,03 раза; К_А мелких ЦИК (7%) - в 2,30 раза.

Если коэффициент К_А выше 1,5, то наличие аутоиммунного компонента становится достоверным. Таким образом, у больных с легкой и тяжелой формами АБА установлено участие иммунопатологических реакций в патогенезе заболевания.

При оценке патогенности ЦИК мы установили, что коэффициент патогенности достоверно (p<0,05) повышается у больных АБА по отношение к контрольной группе (рис. 27). Выявленное повышение уровня ЦИК мелких и средних размеров в сыворотке больных АБА, а также повышение иммунорегуляторного индекса у больных тяжелой формой АБА до 2,5 может быть показателем предрасположенности этой категории больных к развитию аутоиммунных реакций.

Рис. 27. Содержание патогенных субфракций в популяции ЦИК в группе контроля и больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА). *Достоверные отличия по отношению к норме (р<0,05).

Концепция относительно роли программированной клеточной гибели в патогенезе атопической бронхиальной астмы, несмотря на обширные данные литературы, оставалась не до конца изученной и противоречивой. Повышенный в последние годы интерес к процессу аутофагии при различных физиологических и патологических состояниях стал основой для ее изучения в представленной работе. Полученные результаты позволяют говорить, что процесс ПКГ Т-лимфоцитов при развитии бронхиальной астмы не так однозначен, как считалось ранее. Помимо апоптоза, свой вклад в патологическое развитие астмы может вносить аутофагия. А в качестве регуляторов переключения с одной программы гибели на другую могут выступать белки теплового шока Hsp70 и Hsp90.