Рукописи Калашников Андрей Анатольевич новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме
Объекты, материалы и методы исследований
жүктеу/скачать 0.56 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной
- ,3 ±0,1 4 , 1±0,2
- Культивирование штаммов P. ostreatus на различных питательных средах
- Зависимость роста мицелия от рН среды
Объекты, материалы и методы исследованийВ работе использованы два штамма Pleurotus ostreatus БС и P. оstreatus L, полученные из коллекции грибов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук. Исследование проводили по следующей схеме (рис. 1). Вегетативный мицелий данных штаммов культивировали на модифицированной среде Семерджиевой с добавлением экстракта дубовой коры. Гибридизацию исходных штаммов проводили по методу Г. Фритше (1969), используя для этих целей моноспоровую селекцию. Глубинное культивирование мицелия проводили в ферментере "Анкум-2М" в 6 л вышеуказанной жидкой среды, а также на шуттель-аппарате оригинальной конструкции. Субстрат для посевного мицелия готовили из зерна пшеницы по традиционной методике (Бисько, 1983; 1987; Бухало, 1988; Методы приготовления…, 1982). Для изучения оптимального состава субстрата для получения плодовых тел готовили следующие материалы: древесные опилки хвойных и лиственных пород деревьев, пшеничная солома. Производственные испытания проводили на базе грибоводческого хозяйства комплекса ОАО «Совхоз-Весна», расположенного в г. Саратов. В качестве контрольного штамма в производственных экспериментах использовали штамм P. ostreatus HK-35 Duna, полученным из коллекции данного хозяйства. Для создания дополнительной степени стерильности, при необходимости (рекомендуется для мелкотоварного производства), в субстрат при запаривании добавляли 6% перекись водорода (150 мл/л). Фунгицидное воздействие препарата "Фитоспорин-М" изучали в процессе подготовки субстрата, культивирования и образования плодовых тел. Раствор препарата (1,5:1000) добавляли непосредственно в воду после запаривания субстрата и достижения температуры воды от 38-42ºС. Через 12 часов выдержки субстрата в воде с биофунгицидом, затем воду сливали, а субстрат использовали непосредственно для экспериментов. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «STATISTICA 6.0» MS Office.
Рис. 1. Схема проведения эксперимента РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной В результате проведенных экспериментов по скрещиванию исходных штаммов было получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордий при 22-25ºС, обозначенные, соответственно, Т1- Т5 (табл. 1). Таблица 1 – Динамика образования примордиев
Предварительные эксперименты показали, что наиболее активным ростом мицелия на плотных питательных средах, а также более ранними сроками появления примордий обладает штамм Т5, что и позволило отобрать его для дальнейших исследований. Полученный штамм способен так же, как и родительские, образовывать кластеры (сростки плодовых тел) от 2-4 до 20-30 шт. Шляпка 1-8 см в диаметре, в молодом возрасте выпуклая, светло-коричневая, затем – плоская, тарелкоподобная, более темная. Пластинки сероватые, ножка, как правило, центральная или слегка эксцентрическая, 4-6х0,5-1,6 см, серовато-белая. Мякоть плотная, сероватая (рис. 2).
Рис. 2. Морфология гибрида Т5 Культивирование штаммов P. ostreatus на различных питательных средах В соответствии с поставленной целью по разработке технологии культивирования мицелия и плодовых тел P. ostreatus, были изучены показатели роста клеток штамма P. ostreatus Т5 на плотных питательных средах. В качестве субстратов были выбраны модифицированная среда Семерджиевой МС и минеральная синтетическая среда, обычно применяемая для выращивания мицелия. Подбор питательной среды для проведения дальнейших экспериментов проводили при помощи сравнения коэффициентов роста мицелия на среде МС и минеральной синтетической среде (табл. 2). В последующих экспериментах изучено влияние состава питательной среды на рост мицелия изучаемых штаммов. Таблица 2 – Зависимость интенсивности роста мицелия изучаемых штаммов от состава среды
Примечание. Ростовой коэффициент (Рк) - модифицированный ростовой коэффициент, который рассчитывали по формуле: Pk=Dhg/t; где D - диаметр колонии, в мм, g - плотность колонии, в баллах по 3-х балльной шкале, h - высота колонии, в мм, t - возраст колонии (сут). Для исследования интенсивности роста мицелия в жидкой среде, оценивали степень влияния различных стимуляторов роста. Были использованы следующие добавки: подсолнечное масло, углекислый кальций, агар-агар, дубовый экстракт. Установлено, что мицелий P. ostreatus наиболее интенсивно растет на средах с добавлением экстракта дубовой коры. Интенсификация роста происходит в результате стимулирования активности грибных фенолоксидаз, что подтверждается проведенными исследованиями при определении ростового коэффициента (Рк) (табл. 3). Таблица 3 – Коэффициент зависимости роста мицелия (Рк) штаммов изучаемых грибов от различных стимуляторов
П  ри выращивании клеток мицелия наиболее перспективного гибрида Т5 на лабораторном ферментере «Анкум-2M» также установлено, что добавка экстракта дубовой коры и скорость перемешивания существенно влияют на динамику нарастания клеток мицелия (рис. 3).
Рис. 3. Динамика роста мицелия штамма Т5 на ферментере «Анкум-2М» Примечание: а– с добавлением или отсутствием ДЭ: 1 – с ДЭ, 250 об/мин; 2 – без ДЭ, 250 об/мин; 3 – с ДЭ, дробное перемешивание.
1 – 250 об/мин, 2 – 500 об/мин, 3 – без механического перемешивания (барботирование воздухом).
Анализ полученных данных о росте мицелия в жидкой среде с аэрацией на шуттель-аппарате и ферментере «Анкум-2» при различных показателях рН, позволил установить, что наиболее оптимальное значение рН для выхода биомассы равно 5,8 (рис.4). Исследованный штамм P.ostreatus Т5 отличался по скорости обрастания субстрата мицелием и времени появления плодовых тел от родительских штаммов. Наиболее быстро плодовые тела появлялись у штамма Т5. Известно, что распределение урожайности между волнами плодоношения является индивидуальной характеристикой штамма (табл. 4). Из таблицы 4 видно, что гибрид Т5 по сравнению с другими гибридами и родительскими штаммами БС и L наиболее быстро колонизирует субстрат, а также дает максимальный выход плодовых тел, т.е. характеризуется повышенной урожайностью. 
Рис. 4. Зависимость выхода биомассы от значения рН Таблица 4 – Показатели урожайности исследуемых штаммов
Новый гибрид Т5 способен к образованию единичных и срощенных плодовых тел при выращивании на опилочном и соломенном субстратах. Всего было получено до 95 плодовых тел за 1,5 месяца инкубации (с одного контейнера). Из них на субстрате с соломой - 92 плодовых тела, общим весом 80 гр., с опилками - 95 плодовых тел, общим весом 91 гр. Эти данные позволяют констатировать, что гибрид Т5 значительно превышает активность плодообразования родительских штаммов, а также штаммов Т3 и Т4. Для сравнения, штаммы Т3 и Т4 образовывали не более 65 базидиом на обоих субстратах (за тоже время выращивания) общим весом 69-72 г. Следовательно, полученный гибрид Т5 по своим показателям превосходит исходные штаммы, что позволяет также рекомендовать его для дальнейшего внедрения в промышленное культивирование. Обнаружено, что образование плодовых тел товарного вида гибридом Т5 может происходить при недостаточной аэрации, т.е., со сменой свежего воздуха менее, чем 8-10 объемов/г субстрата в час, тогда как известно, что превышение концентрации СО2 в окружающей среде приводит к аномальному развитию плодовых тел (рис. 5). 
Рис. 5. Морфология плодовых тел штаммов P. ostreatus, выращенных в условиях ограниченной аэрации Проведен сравнительный анализ урожайности P. ostreatus на субстратах, состоящих из пшеничной соломы и опилок смешанных пород деревьев, обработанных в процессе запаривания перекисью водорода. Результаты показали, что наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома, а обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и несколько повышает общую урожайность (табл. 5, 6). Полученные данные можно объяснить тем, что перекись водорода, как активный окислитель, в процессе запаривания вызывает частичный гидролиз лигно-целлюлозного комплекса субстрата с высвобождением определенного количества полисахаридов, служащих дополнительным источником питания для развивающегося мицелия. Проведена оценка промышленных, экологически безопасных биофунгицидов на процесс культивирования и образования плодовых тел полученным гибридом вешенки путем изучения биотического воздействия штамма B. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М" на характер взаимоотношений Р. ostreatus и Trichoderma spp. Таблица 5 - Урожайность штаммов вешенки на соломенном субстрате, обработанном перекисью водорода
Таблица 6 – Урожайность штаммов вешенки на опилочном субстрате, обработанном перекисью водорода
Характер взаимоотношений штамма B. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М" с мицелиальной культурой Р. ostreatus Т5 и спорами культуры Trichoderma spp. изучали при совместном культивировании на среде МС. Таблица 7 – Влияние B.subtilis на развитие Trichodеrma spp.
2 — согласно оценке ширины зоны ингибирования, 3 — согласно оценке развития вешенки, 4 — биотический индивидуальный эффект. Инокулюм Р. ostreatus, помещенный в центре чашки Петри, инкубировали в течение 4 сут, затем подсевали суточную культуру бактерий B. subtilis 26Д в чистом виде и виде смеси со спорами Trichoderma spp. штрихом. Биотический эффект рассчитывали согласно (Brodziak, 1980) по ширине зоны развития макроколонии Р. ostreatus Т5, применяя критерии метода биотических рядов. При этом коэффициенты корреляции рассчитывали методом линейной регрессии по формуле (с использованием программного пакета MS Office Exel):
Изучение урожайности исследуемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом "Фитоспорин-М", показало, что на этом субстрате происходит как уменьшение времени появления примордий, так и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения (табл. 8). Таблица 8 – Показатели урожайности штаммов P. ostreatus на соломенном субстрате, обработанном препаратом "Фитоспорин-М"
На основании анализа литературных и полученных нами данных можно заключить, что В. subtilis и Р. ostreatus в частично замкнутой искусственной экосистеме связаны по типу прямых и косвенных топических и трофических связей; в создании элективного для Р. ostreatus субстрата при культивировании в частично искусственной экосистеме важна роль популяции штамма B. subtilis 26Д. жүктеу/скачать 0.56 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
