С катионными поверхностно-активными веществами по данным флуоресценции

С КАТИОННЫМИ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

ПО ДАННЫМ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

А.Н. Кукушкина*¹, С.Р. Деркач^*, Б.М. Ужинов^**, С.М. Левачев^**, М.А. Сакварелидзе^***

Методом флуоресценции исследовано взаимодействие глобулярного белка бычьего сывороточного альбумина (БСА) с катионными ПАВ цетилтриметиламмоний бромидом (ЦТАБ) и октадекенилдигидроксоэтилметиламмоний хлоридом (ОДМАХ) в водном растворе. В области низких концентраций ПАВ наблюдается статическое тушение флуоресценции БСА с константой тушения Штерна-Фольмера равной (4.7 ± 0.2)10³ и (4.3 ± 0.4)10³ М^-1 в случае ЦТАБ и ОДМАХ соответственно. Тушение флуоресценции БСА в присутствии ПАВ обусловлено образованием комплексов белок-ПАВ переменного состава.

ВВЕДЕНИЕ

В многочисленных исследованиях взаимодействия глобулярных белков, особенно бычьего сывороточного альбумина (БСА), с ионными и неионными ПАВ [3] показано, что ПАВ взаимодействуют с БСА с образованием ассоциатов (комплексов) переменного состава. При этом наблюдаются существенные конформационные изменения вторичной структуры белка – доля спиральных -цепей уменьшается [3], а термическая устойчивость вторичной структуры возрастает [4]. При низких концентрациях ПАВ взаимодействие имеет электростатическую природу в результате связывания ионов ПАВ противоположно заряженными группами белка. При высоких концентрациях (в области ККМ и выше) число связанных молекул ПАВ резко возрастает в результате кооперативности процесса, определяющую роль при этом играют гидрофобные взаимодействия [3].

Целью настоящей работы является исследование комплексообразования БСА с катионными ПАВ в водных системах в широком диапазоне концентраций ПАВ и молярного соотношения компонентов ПАВ/БСА, а также определение механизма комплексообразования и констант комплексообразования. В работе использовали флуоресцентный метод, который успешно применяется для исследований белковых систем [5, 6]. БСА, как и многие белки, содержит флуорофоры: два триптофана (Trp¹³⁵, Trp²¹⁴). Триптофан весьма чувствителен к полярности окружения, и спектры флуоресценции могут дать существенную информацию о процессе связывания молекул ПАВ и конформационных изменениях белка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глобулярный белок бычий сывороточный альбумин (БСА) производства Sigma, содержание белка 97 % , молярная масса 6.7∙10⁴ Da, изоэлектрическая точка 4.9. Катионные ПАВ: октадекенилдигидроксоэтилметиламмоний хлорид (ОДМАХ) (С₂₃Н₄₈О₂NCI), KKМ 1.510^-4 М, хроматографически чистый; цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (С₁₉Н₄₂NBr), ККМ 810^-4 М, производства Sigma использовали без дополнительной очистки.

Для приготовления растворов БСА, ПАВ и их смесей использовали бидистиллят с удельной электрической проводимостью (22 ^оС) 6.710^-6 Ом^-1 м^-1. рН растворов смесей БСА и ПАВ устанавливали в интервале 5.7 – 6.0.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по оптической плотности растворов при λ = 280 нм, используя ε₂₈₀ для БСА 44720 М^-1см^-1 [6]. Измерения стационарной флуоресценции проводили с использованием спектрофлуориметра Элюмин-2М. Длина волны возбуждения составляла 280 нм. Время жизни флуоресценции определяли из кинетики флуоресценции, измеренной с помощью наносекундного спектрометра SP-70. Температура эксперимента составляла 22 ºС.

На рисунке представлены зависимости относительной интенсивности флуоресценции БСА I /I₀ от концентрации ПАВ при постоянной концентрации белка в растворе C_БСА=210^-5 М. I₀, I – интенсивность флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя (ПАВ), соответственно. Как видно из рисунка, относительная интенсивность флуоресценции резко уменьшается в определенном диапазоне концентраций ПАВ.

Можно выделить три участка, характерные для обоих катионных ПАВ. Так, в области низких концентраций цетилтриметиламмоний бромида (рисунок, а) интенсивность флуоресценции уменьшается с ростом концентрации ПАВ. При концентрации ЦТАБ равной 610^-4 М, что соответствует соотношению 30 молекул ЦТАБ на одну молекулу белка, интенсивность флуоресценции достигает наименьшего значения и составляет 26% от исходного значения интенсивности. Далее с увеличением концентрации ЦТАБ интенсивность флуоресценции до 40% от исходного значения I₀, соотношение компонентов при этом равно 250 молекул ПАВ на молекулу белка. При дальнейшем увеличении концентрации ЦТАБ относительная интенсивность флуоресценции не меняется.

Аналогичная зависимость получена и при введении катионного ПАВ октадекенилдигидроксоэтилметиламмоний хлорида (рисунок, б). Наименьшее значение интенсивности флуоресценции достигается при молярном соотношении ПАВ:БСА = 25 и составляет 32% от исходной интенсивности флуоресценции БСА. Затем интенсивность флуоресценции несколько увеличивается, достигая 38% от I₀, что соответствует 50 молекулам ОДМАХ на молекулу белка, и далее остается постоянной. Необходимо отметить, что максимальное тушение флуоресценции в обоих случаях при введении ЦТАБ и ОДМАХ наблюдается при концентрациях катионных ПАВ в области ККМ.

(а) I/I0 C (ЦТАБ), М

(б) I/I0 C (ОДМАХ), М

от концентрации добавленного в раствор белка катионного ПАВ: ЦТАБ (а)

и ОДМАХ (б), С_БСА = 210^-5 М
Тушение флуоресценции может протекать по механизму динамического или статического тушения [7]. В обоих случаях зависимость относительной интенсивности от концентрации тушителя описывается уравнением Штерна-Фольмера:

, , (1)

где I₀, I – интенсивность флуоресценции флуорофора в отсутствие и в присутствии тушителя, соответственно; k_q – константа скорости реакции тушения; ₀ – истинное время жизни флуоресценции (в отсутствие тушителя); [Q] – концентрация тушителя; K_SV – константа Штерна-Фольмера (константа тушения).

В работе определено, что истинное время жизни флуоресценции БСА ₀ равно 3.910^-9 с и не зависит от концентрации ПАВ, что свидетельствует о статическом тушении. Тушение происходит в результате образования в основном состоянии нефлуоресцирующего комплекса белок-ионное ПАВ. Если спектр поглощения такого комплекса близок к спектру поглощения белка, то возбуждающий свет будет поглощаться как свободными, так и связанными в комплекс молекулами БСА, а флуоресцировать будут лишь свободные молекулы БСА. При тушении по статическому механизму константа Штерна-Фольмера представляет собой константу равновесия образования комплекса в основном состоянии, т.е. константу комплексообразования [7].

Полученные экспериментальные данные в области низких концентраций катионных ПАВ (рисунок) проанализированы в рамках уравнения Штерна-Фольмера. Линейный характер зависимости интенсивности флуоресценции БСА от концентрации ПАВ свидетельствует об образовании комплекса БСА-катионное ПАВ. Константы комплексообразования, вычисленные по уравнению (1), для обоих ПАВ близки по своим значениям и равны (4.70.2)10³ М^-1 для ЦТАБ и (4.30.4)10³ М^-1 для ОДМАХ.

Флуоресценция бычьего сывороточного альбумина тушится катионными ПАВ ЦТАБ и ОДМАХ в водном растворе. Константа тушения, представляющая собой константу равновесия связывания молекул ПАВ белком и рассчитанная по уравнению Штерна-Фольмера, равна (4.7 ± 0.2) 10³ и (4.3 ± 0.4)10³ М^-1 для ЦТАБ и ОДМАХ соответственно. Тушение происходит преимущественно по статическому механизму. Тушение флуоресценции БСА обусловлено взаимодействием макромолекул белка с молекулами ПАВ, сопровождающимся образованием комплексов БСА-катионное ПАВ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Peters T. Serum Albumin / T. Peters // Advances in Protein Chemistry. - 1985. - V. 37. - P. 161-245.

2. Zhang W., Liu H., Chen J. Forward and backward extraction of BSA using mixed reverse micellar system of CTAB and alkyl halides / W. Zhang, H. Liu, J. Chen // Biochemical Engineering J. - 2002. - V. 2. - № 1. - P. 1-5.

3. Santos S.F., Zanette D., Fischer H., Itri R. A systematic study of bovine serum albumin (BSA) and sodium dodecyl sulfate (SDS) interactions by surface tension and small angle X-ray scattering / S.F. Santos, D. Janette, H. Fischer, R. Itri // J. Colloid Interface Science. - 2003. - V. 262. - P. 400-408.

4. Yamasaki M., Yamashita T., Yano H., Tatsumi K., Aoki K. Differencial scanning calorimetric studies on bovine serum albumin. VI. Effect of anionic surfactants with various lengths of hydrocarbon chains / M. Yamasaki, T. Yamashita, H. Yano, K. Tatsumi, K. Aoki // J. Biological Macromolecules.-1996.-V. 19. - P. 241-246.

5. Gelamo E.L., Silva C.H.T.P., Imasato H., Tabak M. Interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants: spectroscopy and modelling / E.L. Gelamo, C.H.T.P. Silva, H. Imasato, M. Tabak // Biochimica Biophysica Acta. - 2002. - V. 1594. - P.84-99.

6. Carter D., Ho J.X. Structure of Serum Albumin / D. Carter, J.X. Ho // Advances in Protein Chemistry. - 1994. - V. 45. - P. 153-203.

7. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии / Д. Лакович. - М., 1986.

INVESTIGATION OF BOVINE SERUM ALBUMIN INTERACTIONS WITH CATIONIC SURFACTANTS BY FLUORESCENCE PROBE METHOD