Сычева Ольга Владимировна Трубина Ирина Александровна с 95 учебное пособие «Экспертиза молочного сырья» Ставро- поль: Изд-во Стгау «агрус», 2013. С. 103. Настоящее учебное пособие
Определение микробной обсемененности молока биолюминесцентным
жүктеу/скачать 1.04 Mb. Pdf көрінісі
|
| Определение микробной обсемененности молока биолюминесцентным
методом Метод основан на растворении соматических клеток, белка и жира мо- лока АТФ-реагентом; фильтровании полученного образца через бактериаль- ный мембранный фильтр; растворении отфильтрованных микроорганизмов реагентом на основе диметилсульфоксида; расчете концентрации АТФ мик- роорганизмов в полученном растворе по его биолюминесценции и определе- нии количества микроорганизмов в 1 см 3 молока. Приборы и реактивы: люминометр, обеспечивающий измерение лю- минесценции в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм; люминонометрическая кювета (типа фильтраветы); штатив для фильтравет; шприц медицинский вместимостью 5 см 3 ; наконечник резиновый к медицинскому шприцу; филь- тровальная бумага; пипетки автоматические вместимостью 0,02 см 3 , 0,1 см 3 и 1 см 3 ; наконечники к автоматическим пипеткам стерильные; баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 ± 1) o C. Реагенты: флакон № 1 − АТФ-реагент ЛЮМТЕК, лиофильно высушенный; флакон № 2 − раствор для реконструкции АТФ-реагента; флакон № З − АТФ-контроль, лиофилизован- ный; флакон № 4 − реагент для разрушения бактериальных клеток, раствор; флакон № 5 − реагент для предобработки молока, лиофилизованный; флакон № 6 − промывочный раствор. Внимание! Реагенты следует хранить в холо- дильнике при температуре от 0 до 6°С. Для получения воспроизводимых результатов анализа молока необхо- димо соблюдать меры предосторожности, принятые при работе в микробио- логической лаборатории, в частности: перед проведением анализа поверх- ность лабораторного стола обработать 70% этанолом; использовать автома- тические пипетки и стерильные наконечники к ним; для выполнения каждой операции использовать новый стерильный наконечник; после анализа каждо- го образца молока штативы для фильтравет, фланцевый наконечник шприца, пинцет и автоматические пипетки стерилизовать 70% этанолом. 56 Подготовка реагентов к анализу. Во флакон № 1 внести 2 мл раствора из флакона № 2, выдержать 30 мин перед использованием. Полученный рас- твор АТФ-реагента можно хранить при комнатной температуре в течение ра- бочего дня, а при 4°С − в течение 2-3 дней. Во флакон № 3 внести 1 мл раствора из флакона № 4, перемешать. По- лученный раствор АТФ контроля имеет концентрацию АТФ 10 пикомоль/мл. Полученный раствор следует использовать в течение одного рабочего дня. Проверка АТФ-реагента по АТФ-контролю. Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра. Внести в нее 0,02 мл раствора АТФ-контроля из флакона № З и 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемешать, добавить 0,05 мл раствора АТФ-реагента из флакона № 1, быст- ро перемещать и измерить биолюминесцентный сигнал. Повторить измере- ния еще раз и найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля (I контр. ). Если измеренные значения различаются более, чем на 20%, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения. Техника анализа. Образец анализируемого молока объемом 50 мл дове- сти до комнатной температуры и тщательно перемешать. Внести 1 мл молока во флакон № 5 с реагентом для предобработки молока и тщательно переме- шать. Закрыть флакон, поместить его в водяную баню (45 ± 0,5) о С на 10 мин. Поместить в штатив для фильтравет с помощью пинцета фильтровальную полоску и установить на неё две фильтраветы. Внести в одну фильтравету 0,2 мл предобработанного молока и прода- вить его на фильтровальную бумагу, создавая избыточное давление с помо- щью шприца с резиновым наконечником. Сдвинуть фильтровальную полоску так, чтобы под фильтраветой оказался сухой участок полоски. Внести в ту же фильтравету две капли промывочного раствора из флакона № 6 и продавить его в фильтровальную полоску, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. 57 Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение лю- минометра и внести в нее 0,02 мл раствора из флакона № 4. Добавить через 1-2 мин в ту же фильтравету 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемещать, затем добавить 0,05 мл АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить максимальный биолюминесцентный сигнал (I жүктеу/скачать 1.04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|