Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов 03. 00. 23 биотехнология

ГРИНЬ

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук
Щелково – 2008 г.
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН.

Научный консультант кандидат технических наук, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Рубан Евгений Александрович
Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Смоленский Владимир Иванович, ВГНКИ

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович, МГАВМиБ

доктор ветеринарных наук Колбасов Денис Владимирович, ВНИИВВиМ

Автореферат разослан « » февраля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

Фундаментом современной биотехнологии являются микробиология, вирусология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. Сочетанное использование основных элементов указанных дисциплин позволяет создавать производственные системы для выпуска биологических препаратов, предназначенных для индикации возбудителей, диагностики, профилактики инфекционных болезней и лечения животных (Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2000).

Основы биотехнологии у нас в стране отражены в работах Иерусалимским Н.Д. (1963), Работновой И.А. (1957, 1974, 1976), Печуркиным Н.С. (1978), Помозговой И.Н. (1979), Дьяконовым Л.П. (1998), Сергеевым В.А. (1983), Бекером М.Е. (1978), Кофаровым В.В. (1979), Басникьян И.А. (1992), Бирюковым В.В. (1985), Рубаном Е.А. (1995, 2000, 2008), Самуйленко А.Я. (2000, 2008), Калунянцем К.А. и др. (1987); за рубежом – Monod I. (1942), Aiba S. (1961, 1975), Novick A. (1959), Herbert D. (1958, 1961), Pert S. (1975), Metzner A. (1960), Hamer G. (1982), Janessens J. (1984).

Современные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и биологических процессов, оптимизация которых возможна на клеточном, популяционном, биоценотическом и аппаратурно-технологическом уровне.

Успехи отечественной ветеринарной науки и практики в проведении специфической профилактики инфекционных болезней связаны с крупными научными открытиями, сделанными в конце ХIХ и начале ХХ столетий (Воронин Е.С., Сюрин В.Н., 2000; Панин А.Н., 2001-2006).

В течение 40 лет сотрудниками ВНИТИБП накоплен большой опыт в создании новой высокоэффективной техники и биотехнологии получения вакцин, диагностикумов, специфических антигенов вирусного и микробного происхождения, гипериммунных сывороток, методов очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов, выделении специфического антигена и методов их оценки.

Разработаны суспензионные методы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов (Рубан Е.А., Раевский А.А., Соловьев Б.В., 1985-2000).

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами – одна из главных задач биотехнологии.

Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии (Hammer et al., 1985; Brem et al., 1985). В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве (Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006).

Таким образом, использование при разработке новых и совершенствование существующих промышленных биотехнологий производства биопрепаратов с использованием современного оборудования (биореакторов, сепараторов, разделительных центрифуг, фильтров и т.д.), иммунобиологических методов будет способствовать повышению их эффективности и улучшению эпизоотической, экологической и социальной обстановки в стране.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать с использованием современного оборудования методы и биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов и репродукции культур клеток (включая сперматогонии с генетическим вектором нужной направленности.

2. Разработать современные методы получения специфических антигенов микробного и вирусного происхождения при производстве биопрепаратов.

3. Разработать метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре при промышленном изготовлении диагностикумов и лечебных сывороток и для получения гипериммунных сывороток.

4. Разработать современные биотехнологические процессы производства препаратов (диагностикумов, вакцин, лечебных сывороток) и иммунологические методы их оценки (ИФА, ПЦР).

5. Оценить экологическую, экономическую и социальную эффективность использования предложенных методов и биотехнологий и иммунологических методов.

1.3. Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны

- биотехнологические процессы и современные иммунобиологические методы анализа при промышленном производстве ветеринарных препаратов, включающие:

- впервые разработан «Набор для ретроспективной ИФА-диагностики инфекционного ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностики ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности;

- разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток при разработке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС;

- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первичнотрипсинизированных культурах клеток при изготовлении гипериммунных диагностических и лечебных сывороток;

- впервые получена гипериммунная сыворотка для создания пассивного иммунитета у свиней против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза с использованием волов как продуцентов, а в качестве антигенов бралась культура Pasterella multocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 и Д штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штамм ГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suis серовара II (штамм Касли);

- впервые изобретен способ размножения стромальных клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма;

- впервые установлено, что кормление перепелок сбалансированным рационом с добавлением циалитов значительно увеличивает выход культур клеток из перепелиных эмбрионов.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами, в т.ч. 2 заявками (Патент № 2184568 от 10.07.20002г., Патент № 2196336 от 10.01.2003г., Патент № 2196609 от 20.01.2003г., Патент № 2196820 от 20.01.2003г. и Заявки на патент № 2007123692 от 20.06.2007г. и №2007142025 от 15.11.2007г.).

Результаты проведенных исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагностикумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза.

Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяются в ветеринарной практике в порядке широкого производственного опыта за период 2001-2007 гг.

За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА – 500, бешенства РДП – 3500, РИФ – 4000 и хламидиоза РСК – 15000 наборов.

1. Результаты усовершенствования и разработки биотехнологических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, культур клеток и вирусов и контроля репродукции вирусов и микроорганизмов при промышленном выпуске ветеринарных биопрепаратов.

2. Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных методов и оборудования для разделения, очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов и выделение специфических антигенов и методы их оценки.

3. По результатам оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФ бешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (гемофилез, стрептококкоз и пастереллез).

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие Л.К. Эрнст, Е.Э. Школьников, Б.В. Соловьев, В.С. Иванов, А.И Гуславский, Э.Я. Сазанова, сотрудники отделов молекулярная биология и иммунология и оказывали практическую и консультативную помощь, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.

2.1.1. Культуры клеток и эмбрионы птиц. В работе использовались перевиваемая линия клеток ПТ-80 (почки теленка) и ТАУЭР, культура клеток ВНК 21/13, первичные культуры клеток СП (селезенки поросенка) и семенников, нормальных и обработанных ретровирусом, перевиваемые линии клеток СПЭВ, первичнотрипсинизированные культуры клеток почки, легкого и трахеи эмбриона коровы. Использовали СПФ-яйцо, производимое на ФГУП «Щелковский биокомбинат». Инкубирование яиц проводили в промышленных или лабораторных инкубаторах.

2.1.2. Животные. Использовали морских свинок, мышей, кроликов разных возрастов, свиней, овец и крупный рогатый скот.

2.1.3. Питательные среды и растворы. Использовали культуральные среды Игла, Эрла, 199, полную среду Игла модифицированную Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco, Панэко), бессывороточная среда Хенкса с 0,5% лактальбумином; сыворотка КРС, фетальная сыворотка телят и коров (НПО «Вектор», Панэко). Фосфатно-буферный раствор (ФБР) в различных модификациях готовили по стандартным технологиям, растворы бикарбоната натрия, трипсина («Дифко»), 2,5% лактальбумин, ферменты, гормоны, полиэтиленгликоль (ПЭГ) разной концентрации, физраствор.

2.1.4. Масла и эмульгаторы. Использовали масла: вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ 15819-70) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52 (фирма «Эссо», США) и эмульгаторы: ланолин, ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монтанид 888 и 103 (фирма «Сеппик», Франция).

2.1.5. Штаммы. Использовали фиксированного вируса бешенства штамм «Щелково-51», вируса ИРТ КРС штамм «ТК А» (ВИЭВ) В2, вируса хламидийного штамм «Улетово», культуры Pasterella multocida серовариантов А «штамм 1231», В «штамм 681» и Д «штамм Т-80», Haemophilus pleuropneumoniae серовара I «штамм ГУ-19» и серовара П «штамм 5870» и Streptococcus suis серовара II («штамм Касли»), респираторно-синцитиального вируса штамм «Randall», вируса ПГ-3 штамм «3КСМ».

2.1.6. Оборудование, технология и технологические средства контроля

Для проведения экспериментов по суспензионному культивированию клеточных культур использовали газовый стерилизатор питательных сред ЕТО фирмы Pharmatec (Германия), спиннеры магнитного типа с блоком управления (t, рН, рО₂, рСО₂) с перемешиванием фирмы Bellco Biotechnology (США), установка для увеличения клеточной культуры фирмы Pharmatec (Германия), счетчик колонии клеток «Bacfronic» фирмы NBS (США), сосуды Дюара фирмы Forma Scientific, Ins (США) и низкотемпературный холодильник фирмы Forma Scientific, Ins (США), биореакторы АНКУМ-2 (Россия) и «Электролюкс» (Швеция), микропроцессорные управляющие комплексы «Биоцикл МП 01.01»; микроносители Cytodex-3 (НПО «Биолар», г. Олайне) и ВИ-3, изготовляемых во ВНИТИБП по разработанной технологии (Патент РФ № 1255026).

В процессе суспензионного культивирования культур микроорганизмов, клеток и вирусов автоматически контролировались и регулировались основные физико-химические параметры – температура культивирования (t_к) и стерилизации биореактора, арматуры и трубопроводов, рН, рО₂, еН, давление и вакуум.

В процессе исследований контролировали стерильность питательных сред и растворов общепринятыми методами на МППБ, МПБ, МПА и среде Сабуро.

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80, ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкостью 25 л, разработки ИркутскНИИхиммаш в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и ин­дивидуальными модулями технологической обвязки и управления, разработки и изготовления ВНИТИБП и НПО «Промавтометика».

Контроль и регулирование процесса культивирования осуществлялся по основным техно­логическим параметрам, приведенным в табл. 1.

Использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 был соответственно 2-4 и 3-6, а накопление клеток в 1 см³ – 0,9-1,310⁶.