Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов 03. 00. 23 биотехнология

Химическая инактивация

Концентрация фенола и температура инактивации не влияли на титры гемаггрлютинирующий активности вируса бешенства. Титры сохранялись в пределах 1:12-1:16.

Титр преципитирующей активности оказывает влияние увеличение концентрации фенола. Если через 24 ч инкубации при концентрации фенола 0,25% титр не изменялся и был равен исходному 1:28, то при добавлении фенола в концентрации 0,5%-0,75%- 1,0% титр снижался до 1:10, 1:8 и 1:4, соответственно, при всех температурах. Титр преципитирующей активности, снижающийся с 1:28 до 1:4 при обработке 1,0% фенолом в течение 24 ч, далее оставался неизменным. При обработке препаратов вируса всеми концентрациями фенола преципитирущая активность снижалась к 72 ч до 1:12-1:4 при всех температурах.

На основании полученных нами данных были установлены оптимальные режимы инактивации вируса бешенства фенолом: 0,75% концентрация при температуре +20°С в течение 48 ч или при +37°С в течение 24 ч.

Результаты опытов показали, что иммуногенность препаратов, инактивированных 0,75% фенолом при температуре +20°С в течение 48 ч, в 2 раза превышает иммуногенность препаратов, обработанных при +37°С фенолом в такой же концентрации и индекс иммуногенности соответственно равнялись 0,68+0,07 и 0,30+0,10 (n=9).

Полученный препарат гемагглютинина обрабатывали -пропиолактоном в тех же условиях, что и цельный вирус, учитывая период полураспада пропиолакто-на в водном растворе (при +37°С 24-32 мин, +25°С 210 мин, +4°С от 16 до 20 часов), -пропиолактон в максимальной концентрации 1:2000 при темпера­туре +37°С в интервале 15-120 минут не влиял на ГА-активность гемагглютинина, которая оставалась на уровне исходной. При инактивации вируса в условиях температуры +4° и +20°С также не наблюдалось потери ГА-активности белкового компонента в течение всего срока наблюдения. Ранее мы установили, что используя -пропиолактон в концентрации 0.05% (1:2000), можно получить неинфекционные и иммуногенные препараты вируса бешенства.

На основании полученных данных мы предположили, что -пропиолактон, используемый для инактивации вируса бешенства в макси- мальной концентрации 0.05%, взаимодействует с основаниями РНК, лишая тем самым вирус инфекционности. Были проведены опыты по выяснение взаимодействия -пропиолактона с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями РНК: аденозином, гуанозином, цитидином и уридином.

Контроль за ходом реакции осуществляли хроматографически и спектрофотометрически (по изменению характера спектра реакционной смеси во времени) при длине волны 200-350 нм. В качестве контрольного спектра использовали спектр немодифицированного аденозина.

Для характеристики продукта реакции -пропиолактона с аденозином полу­ченное вещество выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии в системах А, В и С. Вещество характеризовалось хроматографической подвижностью Rf на SiО₂.

-пропиолактон инактивирует культуральный вирус бешешнства полностью и необратимо. На выделенный структурный компонент вируса бешенства – гемагглютинин, ответственный за иммуногенность, -пропиолактон не оказывает влияния. Он взаимодействует с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями вирусной РНК. Изменения в РНК, вызываемые взаимодействием -проипиолактона с основаниями, приводит к ее инактивации.

В настоящей работе представлены результаты изучения биологических свойств культурального вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51 вируса: гемагглютинирующие (ГА), комплементсвязывающие (КС), преципитируюшие (Пр) и иммуногенные (Им), а также влияния таких физико-химических факторов, как обработка вируса ферментами РНК-аза, трипсин и рН среды.

Для сохранения биологических свойств вируса бешенства оптимальными являются пределы рН 6,0-8,0. Вирус обладает комплементсвязывающей активностью при рН 6,0-8,0, гемагглютиниру- ющей - при рН 3,0-9,0, преципитирующей - при рН 5,0-9,0.

Препараты вируса обрабатывали трипсином в концентрации 0,05, 0,10 и 0,15% и РНК-азой в концентрации 0,05, 0,02 и 0,01%. Инкубацию проводили 30 минут при +37 С. Затем в обработанных ферментами препаратах вируса определяли титр инфекционности, комплементсвязывающей, гемагглютинирующей и преципитирующей активности.

Трипсин и РНК-аза оказывают влияние на инфекционность вируса бешенства. Трипсин в концентрации 0,05% практически не снижает инфекционность вируса. С повышением концентрации фермента до 0,10% титр инфекционности снижается на 1,75 lg, а при обработке вируса 0,15% трипсином происходит снижение его до 0. РНК-аза существенно снижает инфекционность в пределах более 2 lg (с 6,25 до 4,00 lg) при всех изученных концентрациях.

Оба эти фермента не влияют на его гемагглютинирующую и преципитирующую активность. РНК-аза не снижает также и комплементсвязывающую активность, в то время как трипсин разрушает ее.

Иммуноглобулин G из сыворотки крови животных выделяли осаждением 33 % сернокислым аммонием. Полученную глобулиновую фракцию сыворотки обессоливали гельфильтрацией на сефадексе G-25 в колонке К 26х70, уравновешенным 10 мМ трис-HCI буфером, рН 8,0.

Выход фракций контролировали спектрофотометрически по оптической плотности при длине волны =280 нм (ОП₂₈₀) и объединяли фракции с ОП₂₈₀ больше 1,0. Затем объединенные фракции наносили на DEAE-Toyopearl 650 М, уравновешенный 25 мМ трис-HCI, рН 8,3 (колонка К 26х40).

Выход иммуноглобулина G КРС определяли, исходя из величины ОП₂₈₀ объединенного элюата, по формуле:

ОП₂₈₀

Выход IgG в мг = Vх-------- ,

1,31
где V – объем объединенного элюата;

ОП₂₈₀ – оптическая плотность объединенного элюата;

1,31 – экстинкция раствора Ig G с концентрацией 1 мг/мл.

Выход очищенного иммуноглобулина составил 160 мг/мл. Чистоту препарата Ig G проверяли диск-электрофорезом в полиакриламидном геле – 7,5 % в трис-HCI буфере, рН 8,3.

Однородность и специфичность проверяли иммуноэлектрофорезом в слое 1 % агара «Дифко» на веронал-мединаловом буфере, рН 8,6.

Преципитирующую активность определяли по Оухтерлони. Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1:256-1:512 и выше.

Таким образом, методом ионообменной хроматографии, получен высокоочищенный препарат Ig G КРС, необходимый для последующей гипериммунизации кроликов, с целью получения антисыворотки к Ig G КРС.
2.2.10. Разработка метода определения токсичности масляных адъювантов и их компонентов

При исследовании токсичности различных масляных адъювантов и их компонентов с помощью разработанного нами способа в сравнении со способом с использованием белых мышей, как более близкого к количественному способу оценки токсичности. В результате проведенных исследований получили результаты токсичности различных масел, эмульгаторов и эмульсий, используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах и культуре клеток СП, представленных в таблицах 7-9.

Таблица 7

Токсичность эмульгаторов при исследовании на мышах и культуре клеток в монослое

№	Наименование	Результаты оценки на мышах		ТЦД50/мл
пп	эмульгатора	АПМТ, г	ОПМТ,%	на культуре клеток (lg)
1	Ланолин	6,6±0,4	70,2+4,5	2,1+0,2
2	Сорбитанололеат	6,1+0,3	59,4+3,2	3,4+0,1
3	Монтанид 888	7,1 ±0,4	75,5+4,3	1,6+0,1
4	Монтанид 103	7,3+0,4	77,7+4,3	1,5+0,1
5	Физ. раствор (контроль)	9,4+0,5	100,0±2,0

Результаты реактогенности масла на мышатах и его токсичность на культуре клеток в монослое

№ пп	Наименование масла	Процент отека опытных лап (М+m), n = 5	На культуре кле-ток СП ТЦД50 (lg)
1	2	3	4
1	Вакцинное	83,0+2,0	1,8±0,2
2	Основа РМ	155,0+10,0	3,1+0,3
1	2	3	4
3	Основа АМГ-10	165,0+7,0	3,4+0,3
4	Ангарское	80,0+2,0	1,7+0,2
5	Маркол 52	31,0±4,0	1,1±0,1

Таблица 9

Результаты реактогенности масляных компонентов в опыте на мышах и их токсичность на культуре клеток СП

№ пп	Наименование компонента масло+эмуль- гатор	Соотношение компонентов в адъюванте, %	Процент отека опыт­ных лап мышей (М + m, n = 5)	ТЦД50 lg на культуре клеток СП
1	Ангарское Монтанид 103	90 10	68,0+5,0	1,6+0,1
2	Ангарское Ланолин	85 15	68,0±4,0	2,0+0,2
3	Ангарское Сорбитанолеат	90 10	83,0+6,0	3,1+0,3
4	Маркол 52 Монтанид 103	90 10	40,0+4,0	1,4+0,1
5	Маркол 52 Ланолин	85 15	41,0+4,0	1,8+0,2
6	Маркол 52 Сорбитанолеат	90 10	46+3,0	3,0+0,3

При получении специфических гипериммунных сывороток с целью изготовления из них диагностикумов использовали масляные адъюванты. Отбор менее токсичных, но обладающих высокой иммунизирующей активностью, проводили с использованием разработанного нами метода с использованием пробирок с культурой клеток СП в монослое. В таблице 10 приведены данные активности гипериммунных сывороток, полученных с применением отобранных адъювантов, при иммунизации вирусами ИРТ, ПГ-3, бешенства, РС, ящура, а также хламидиозными антигенами.