Современные подходы к диагностике особо опасных вирусных инфекций

Вирусы передаются воздушно-капельным, воздушно-пылевым или контактно-бытовым путями. В организм вирусы проникают через слизистые оболочки рта, носа, глотки, а также через кожу при наличии микроскопических нарушений ее целостности. Затем, по лимфатическим путям он проникает в регионарные лимфоузлы, где происходит его репликация, после чего вирус появляется в свободных макрофагах лимфоидной системы. Дальнейшее распространение вируса по организму происходит преимущественно по лимфатической системе, а также в результате кратковременной первичной веримии (при воздушно-капельном пути передачи, первичная веримия происходит в клетках слизистой оболочки верхних и нижних отделов дыхательных путей). Накопившийся и освободившийся вирус попадает в кровоток (вторичная веримия) и с ним в кожу, почки, ЦНС и другие органы. Вирусы обладают значительной устойчивостью во внешней среде. Иммунологически патогенные для человека ортопоксвирусы близки друг к другу, в тоже время по контагиозности, патогенности, и другим показателям ВНО, ВОО, ВОК, ВОВ разительно отличаются друг от друга.

Широкомасштабные мероприятия, предпринятые мировым сообществом под эгидой Всемирной организации здравоохранения по вакцинопрофилактике населения Земного шара против натуральной оспы, привели к ликвидации этого заболевания на планете (Маренникова и Щелкунов, 1998). В настоящее время коллекции вирусов натуральной оспы поддерживаются только в двух сотрудничающих центрах ВОЗ: в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово, Новосибирская область, Россия) и Центре по контролю и предотвращению заболеваний (Атланта, Джорджия, США). В результате повсеместного прекращения после 1980 года иммунизации против ВНО доля населения, чувствительного к ВНО и другим ортопоксвирусам, постоянно увеличивается. По-видимому, именно поэтому в последние годы появляется все больше сообщений о вспышках заболеваний людей, вызванных зоонозными вирусами ВОО (Levine et al., 2007; Parker et al., 2007; Rimoin et al., 2010), ВОК (Pelkonen et al., 2003; Honlinger et al., 2005; Carletti et al., 2009, Campe et al., 2009; Ninove et al., 2009) и ВОВ (Damaso et al., 2000; Trindade et al., 2007; Zafar et al., 2007; Singh et al., 2007; Abrahao et al., 2009; Silva-Fernandes et al., 2009; Bhanuprakash et al., 2009) в разных странах. Обсуждаются возможности появления ВНО подобного вируса в результате естественной эволюции существующих зоонозных ортопоксвирусов (Michaeli, 2002; Shchelkunov et al., 2005b; Shchelkunov, 2009) или применение ВНО в качестве агента биотерроризма (Henderson, 1999; Bray and Buller, 2004). Проблема биомониторинга при угрозе террористических актов определяет необходимость разработки высокочувствительных и специфичных (селективных) методов индикации патогенов и создания на основе этих методов совершенных средств, пригодных для организации необходимых защитных мероприятий. Ранняя диагностика первых случаев инфекций позволит своевременно провести противоэпидемические мероприятия – карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр.

В 2011 году введены в действие Методические указания (МУ 1.3.2970-11) определяющие современные стандарты по организации и выполнению исследований при лабораторной диагностике натуральной оспы и ее дифференциации от клинически сходных заболеваний, а также осложнений после прививки оспенной вакцины. К традиционным методам экспресс диагностики ортопоксвирусов относятся электронная микроскопия (ЭМ) содержимого кожных поражений и мазков глотки; обнаружение ортопоксвирусного антигена в обработанных пробах с помощью соответствующей тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА); выявления антител к ортопоксвирусам в сыворотке крови в соответствующей тест-системе ИФА. При необходимости установления диагноза в упрощенных (полевых) условиях, отсутствии соответствующих тест-систем ИФА и невозможности исследовать пробу с помощью электронной микроскопии, используют вспомогательные методы – метод флуоресцирующих антител (МФА), реакцию микропреципитации в агаре (РМПА), реакцию торможения гемагглютинации (Мацеевич и др., 1996; Shchelkunov et al., 2005b). Выделение возбудителя на куриных эмбрионах или в культуре клеток проводят для подтверждения диагноза, а также всесторонней характеристики клинического образца. Необходимым этапом исследования является изоляция вируса. Время исследования с использованием как той, так и другой системы изоляции, составляет от 3 до 6 суток, а предусмотренное при отрицательном результате проведение 2-го пассажа вдвое удлиняет этот срок. Для целей возможно ранней диагностики ВНО используют ПЦР. В МУ 1.3.2970-11 приведена методика, которая позволяет идентифицировать ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать ее от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины с помощью набора реагентов “ВЕКТОР-МПЦР-ОСПА” для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Данный набор производится ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”, согласно РУ № ФСР 2010/09002.

Клинические проявления большой оспы многообразны. Инфекция может протекать в виде оспенной пурпуры – это острая форма заболевания, приводящая к смерти в течение нескольких дней. Встречаются доброкачественные варианты течения болезни в форме вариолоида или оспы без сыпи. Всего различают пять клинических форм натуральной оспы: дискретная, сливная, геморрагическая, вариолоид и натуральная оспа без сыпи (Методические рекомендации, 2006). Такое разнообразие форм течения натуральной оспы, полагают, связано с состоянием иммунитета человека в момент заражения. Инкубационный период у большинства больных равен 7-9 дням. Далее наступает продромальный период (до появления температуры), который, как правило, сохраняется 1-3 дня и сопровождается головной болью, слабостью, бессонницей, тошнотой, болями в мышцах и суставах. Далее следует лихорадочный период. На 3-4 сутки от начала лихорадки появляются папулезные высыпания (истинная сыпь – основное клиническое проявление оспы), которые проходят стадию папулы, везикулы, пустулы и стадию образования корок. Оспа относится к высококонтагиозным болезням. Для variola major инфекционность в среднем составляла для восприимчивых лиц при тесном контакте 58.4 % (Маренникова и Щелкунов, 1998). По материалам программы ликвидации оспы установлено, что в среднем один больной заражал пять человек, хотя нередко эта цифра могла быть значительно больше. Вакцинация против оспы резко снижает восприимчивость к инфекции. В этом случае заразительность уменьшается до 3.8 %.

Клиническая диагностика оспы при типичных формах: дискретной, сливной, геморрагической с наличием сыпи ставится при динамическом наблюдении за больным и процессе развития сыпи. Крайне затруднен диагноз при вариолоиде и оспе без сыпи (Методические рекомендации, 2006). Также, вариолоид часто принимался за ветряную оспу, acne vulgaris, импетиго, и другие инфекционные заболевания.

Своевременная и надежная оценка вида возбудителей является важным звеном в сложной цепи противоэпидемических и терапевтических мероприятий по борьбе с особо опасными инфекциями, поэтому на протяжении многих десятилетий объектом пристального внимания научных и практических учреждений остается проблема индикации и дифференциации вирусов группы оспы.

Опубликованные данные о новых разработанных методах идентификации ВНО на основе ПЦР в реальном времени, обобщены в таблице 1.

Таблица 1. Генодиагностика ВНО при использовании ПЦР в реальном времени

Метод	Ген-мишень *	Чувствительность/ Специфичность	Примечание	Ссылки
TaqMan	A56R	96.1-99.5 %/ 95.7-98.3 %	Позволяет детектировать ДНК ВНО. Специфичность и чувствительность были проанализированы на ДНК 73 изолятов различных вирусов, в том числе 48 различных изолятов ВНО.	[Ibragim et al., 2003]
TaqMan MGB	A56R	96 %/98 %	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО за счет одновременного использования двух специфичных флуоресцентных пробы. Метод адаптирован с использованием лиофилизованных реагентов смеси.	[Aitichou et al., 2008]
TaqMan MGB	A56R	75.0-93.8 %/ 100 %	Позволяет детектировать ДНК ВНО. Специфичность и чувствительность были проанализированы на ДНК панелей: USAMRIID и CDC blind panel.	[Kulesh et al., 2004]
LightCycler	A56R	N/A / N/A	Позволяет детектировать и дифференцировать ДНК ортопоксвирусов. Недостаток – разработанные флуоресцентные пробы к ВНО имеют идентичную нуклеотидную последовательность с ДНК некоторых штаммов ВОК, что может привести к ошибочному выявлению вирусного агента.	[Panning et al., 2004]
LightCycler	A56R	N/A/ N/A	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО по уникальной температуре плавления (Tm, 62.45 ºC) относительно других ортопоксвирусов (Tm, 56.24-56.72 ºC). Недостаток – разработанные флуоресцентные пробы к ВНО имеют идентичную нуклеотидную последовательность с ДНК некоторых штаммов ВОК и ВОВр, что может привести к ошибочному выявлению вирусного агента. Также отсутствие апробации методики на полноразмерной ДНК вируса натуральной оспы.	[Espy et al., 2002]
LightCycler	A56R	N/A / N/A	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО по уникальной температуре плавления (Tm, 56 °С) относительно других ортопоксвирусов (Tm, 58-59 ºC). Недостаток - отсутствие апробации методики на полноразмерной ДНК вируса натуральной оспы	[Putkuri et al., 2009]
TaqMan	A27L	N/A /100 %	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО за счет одновременного использования двух специфичных флуоресцентных пробы. Специфичность была проанализирована на ДНК 85 штаммов различных ортопоксвирусов. Метод адаптирован к 4-м различным диагностическим приборам.	[Scaramozzino et al., 2007]
LightCycler	A27L	N/A /100 %	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО по уникальной температуре плавления (Tm, 55.9-57.8 ºC) относительно других ортопоксвирусов (Tm, 61.3-65.0 ºC). Были проанализированы 120 штаммов различных ортопоксвирусов, включая 46 штаммов вируса натуральной оспы. Специфичность определена на 31500 образцов крови здоровых доноров. На основе метода разработан коммерческий набор RealArt Orthopox LC PCR kit (Artus GmbH) для лабораторных исследований.	[Olson et al., 2004, Schmidt et al., 2005]
TaqMan	С22L/B28R	N/A / N/A	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО.	[Fedele et al., 2006]
LightCycler	1. D7R 2. A8L 3. A13L	N/A / N/A	Позволяет детектировать ДНК всех ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО по уникальной температуре плавления (Tm, 62-64 ºC) относительно других ортопоксвирусов (Tm, 44-59 ºC). В основе метода лежит одновременное использование набора флуоресцентных проб, рассчитанных к трем районам ДНК ВНО, что позволяет избежать ложноположительных результатов на ДНК ВНО.	[Nitsche et al., 2004]

Так например, группа исследователей (Olson et al., 2004) на основе LightCycler ПЦР в реальном времени предложили способ, позволяющий детектировать ДНК таких ортопоксвирусов как ВНО, ВОО, ВОК, ВОВ, оспы верблюдов, оспы мышей и одновременно дифференцировать ДНК ВНО от других видов ортопоксвирусов. В качестве гена–мишени был выбран ген A27L. Расчет олигонуклеотидного зонда строился на одиночной нуклеотидной замене, специфичной для ВНО. Наличие во флуоресцентном зонде малобороздочного лиганда ДНК увеличивало разницу температур плавления и позволяло надежно дифференцировать ВНО от других ортопоксвирусов при анализе кривой температуры плавления. Было проанализировано 120 штаммов различных ортопоксвирусов, включая 46 штаммов ВНО. Температура плавления, определенная для ВНО (Tm, 55.9-57.8 ºC), значительно отличалась от ВОВ (Tm, 61.7-62.7 ºC), ВОО (Tm, 61.9-62.2 ºC), ВОК (Tm, 61.3-63.7 ºC), вируса эктромелии (Tm, 61.9 ºC) и вируса оспы верблюдов (Tm, 64.0-65.0 ºC). Рассчитанные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд легли в основу набора RealArt Orthopox LC PCR kit (Artus GmbH), позволяющего надежно детектировать ДНК ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК ВНО.

Вирус оспы обезьян так назван потому, что впервые был выделен от обезьян во время нескольких вспышек оспоподобного заболевания между 1958-1968 г. в зоопарках и в лабораториях нескольких стран. В 1970 г. была впервые подтверждена возможность инфекции этим вирусом человека (Ladnyi et al., 1972; Marennikova et al., 1972). С момента открытия оспы обезьян у человека случаи этого заболевания у людей регулярно регистрировали в Африке (Breman, 2000; Learned et al., 2005; Damon et al., 2006). В 2003 году вспышка оспы обезьян у людей была впервые зафиксирована вне африканского континента – в США (CDC, 2003). Клинические признаки оспы обезьян сходны с таковыми натуральной оспы, преобладавшей на Африканском континенте: головная боль, слабость, боли в мышцах, характерная сыпь (рисунок 1). Инкубационный период длится 10-14 дней. Отличительной особенностью от натуральной оспы являются лимфадениты, которые наблюдаются у более 85 % заболевших (Маренникова и Щелкунов, 1998). Летальность при оспе обезьян, установленная по результатам изучения 300 случаев в ходе специального проекта ВОЗ (1981-1986) составила 9.8 %, что сравнимо с ВНО-major (Shchelkunov et al., 2005).

Рисунок 1. Типичная клиническая картина оспы обезьян, представленная у мальчика 7 лет, Демократическая республика Конго (Rimoin et al., 2010).

Вирус оспы обезьян циркулирует среди различных видов дикоживущих грызунов и приматов, обитающих преимущественно в зоне влажных тропических лесов Центральной и Западной Африки. К настоящему времени имеются свидетельства, подтверждающие, что некоторые виды белок и обезьян играют роль в циркуляции вируса оспы обезьян и являются источником первичного заражения вследствие прямого контакта с ними человека (Shchelkunov et al., 2005). В 2003 году во время вспышки оспы обезьян в США, также были открыты ранее неизвестные источники вируса оспы обезьян - животные рода Cynomys sp. и Cricetomys emini (CDC, 2003a). Источником заражения оспой обезьян может явиться и больной этой инфекцией человек (Shchelkunov et al., 2005).

Ранее считалось, что оспа обезьян с гораздо меньшей эффективностью передается от человека к человеку, чем натуральная оспа. Однако, постепенное накопление данных, приводит к необходимости пересмотреть представления о ней, как о малоконтагиозной инфекции. Так, во время вспышки оспы обезьян в провинции Восточный Касаи количество заболевших в результате передачи инфекции от человека к человеку составило 73 % (Weekly Epidemiological Record, 1997). При этом число генераций в цепи передачи инфекций от человека к человеку достигало 8. Основной особенностью вспышки оспы обезьян в Конго в 2003 году также являлась передача инфекции от человека к человеку, с наличием, как предпологают, 7 генераций (Learned et al., 2005). Проведенный в центре ВОЗ анализ нуклеотидных последовательностей видоспецифических участков ДНК (в частности гена, кодирующего TNF рецептор) не выявил существенных отличий штаммов вируса оспы обезьян 1996 г. от ранее выделенных (Mukinda et al., 1997). Видимо основной причиной изменения ситуации является снижение уровня коллективного иммунитета к оспе после полного прекращения вакцинации в 1980 г. Так, все инфицированные во время вспышки в Конго в 2003 г. были младше 18 лет (Learned et al., 2005).

Множество инфекций, приводящих к образованию папуло-везикулезной и макуло-папулезной сыпи могут иметь сходство с оспой обезьян (таблица 2). Наиболее часто ошибочно диагностируют атипичные или тяжелые случаи ветряной оспы (varicella-zoster virus).

Мерой специфической профилактики оспы обезьян у людей является прививка осповакциной (вакцинация или ревакцинация). Применение вакцинации, однако, вызывает серьезные опасения из-за возможности побочных эффектов, особенно среди населения, где могут быть лица с иммунодефицитным состоянием, например, вследствие инфицированности вирусом иммунодефицита человека.

CDC рекомендована вакцинация в течение первых 4 дней после прямого контакта с источником инфекции (CDC, 2003b). Также специфические иммуноглобулины рекомендованы для лечения генерализованных форм инфекции (Bray, 2003; CDC, 2003b). В настоящее время перспективным является использование “Cidofoir” (Gilead Sciences, Inc., 1996) (ингибитор вирусной ДНК-полимеразы) для лечения ортопоксвирусных инфекций. “Cidofoir” – противовирусный препарат широкого спектра действия. Для лечения ортопоксвирусной инфекции у человека не применялся, но широко тестировался на лабораторных животных. Stittelaar et al. в модельном эксперименте при лечении оспы обезьян у Macaca fascicularis, инфицированных летальной дозы MPXV, заключили, что использование ациклических нуклеозидных препаратов “Cidofovir” или “HPMPO–DAPy” является более эффективным, чем противооспенная вакцинация (Stittelaar et al., 2006).

Для диагностики ВОО используют класические методы (Shchelkunov et al., 2005). Для специфической диагностики ВОО Kulesh et al. предложили метод на основе ПЦР в реальном времени (TaqMan с малобороздочным ДНК-лигандом) (Kulesh et al., 2004). Saijo et al. для обнаружения ДНК ВОО и одновременной дифференциации на принадлежность к штаммам центральноафриканского и западноафриканского типа предложили альтернативный метод LightCycler ПЦР на основе последовательности гена A26L (Saijo et al., 2008).

Споры о природном резервуаре ВОВ до сих пор продолжаются. По последним данным вспышек заболевания людей, обусловленных ВОВ-подобным вирусом, в Индии и Бразилии, природным резервуаром этого вируса являются грызуны, которые могут быть вовлечены в его распространение и трансмиссию в природе (Ferreira et al., 2008; Damaso et al., 2000; Trindade et al., 2007; Singh et al., 2006). Передача вируса человеку происходит при прямом контакте с инфицированным животным. В большинстве случаев образуются характерные высыпания, чаще локализованные на руках, иногда на ногах и лице (рисунок 2).

Рисунок 2. Высыпания на руках доильщиц вызванные зоонозными ВОВ подобными вирусами (Bhanuprakash et al., 2009).

Для улучшения диагностики ортопоксвирусных инфекций в Бразилии был предложен метод с применением ДНК-интеркалирующих красителей. Метод позволяет специфично детектировать ВОВ, а также отнести выделенный штамм вируса к одному из двух подтипов вируса (Trindade et al., 2008). Для диагностики ВОВ также используют секвенирование (Zafar et al., 2007; Trindade et al., 2007).

Рис.3 Оспа коров у человека (7 день после начала заболевания). (Pelkonen et al., 2003)

Циркуляция вируса оспы коров в природе в диких и домашних животных, на фоне общего падения иммунитета к ВНО, может привести к увеличению случаев оспы коров. Так за последние годы в странах Европы отмечается увеличение числа зарегистрированных случаев заболевания людей оспой коров (Vorou et al, 2008). В декабре 2008 – январе 2009 гг. во Франции и Германии наблюдалась беспрецедентная вспышка оспы коров у людей (Campe et al., 2009, Ninove et al., 2009), обусловленная передачей ВОК от инфицированных домашних крыс. Это указывает на необходимость специальных усилий по подготовке медицинского персонала, разработке современных средств быстрой диагностики этиологического агента данного заболевания, поиску противовирусных препаратов, специфичных против ортопоксвирусов.

На сегодняшний день для диагностики ВОК используют серологические (Nitsche et al., 2007) и биологические методы (Bonnekoh et al., 2008). Видовую идентификацию ВОК можно осуществить с помощью метода ПЦР в реальном времени (Gavrilova et al., 2010). Метод, основанный на TaqMan ПЦР в реальном времени, впервые позволил специфически детектировать ВОК. Метод адаптирован к 3-м различным диагностическим приборам (Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems, USA), iQ 5 (BioRad, USA), and Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Australia). Для диагностики ВОК также используют секвенирование, и хотя такой подход дает точную информацию, метод требует дорогостоящее оборудование, занимает принципиально больше времени, и не может быть использован в полевых условиях.

Диагностика ортопоксвирусных инфекций человека на основе мультиплексного ПЦР

Факт наличия четырех видов патогенных для человека ортопоксвирусов, имеющих различную патогенность и эпидемическую значимость, указывает на целесообразность применения методов, позволяющих одновременно обнаружить и охарактеризовать видовую принадлежность вируса. Описанные выше методы позволяют детектировать и дифференцировать только один из патогенных для человека ортопоксвирусов. Проблема одновременной видовой идентификации решается посредством таких диагностических подходов, как гибридизация молекул ДНК на олигонуклеотидных микрочипах, применение мультиплексного формата классической ПЦР или ПЦР в реальном времени.

Один из последних разработанных методов на основе олигонуклеотидных микрочипов, позволяет одновременно детектировать и идентифицировать ДНК шести видов ортопоксвирусов (ВНО, ВОО, ВОК, ВОВ, ВОВр и ВЭ). В данной работе (Ryabinin et al., 2006) были рассчитаны олигонуклеотидные зонды к генам C23L/B29R и B19R ортопоксвирусов для видоспецифичной диагностики, а также для увеличения специфичности метода к генам ОРТ31 вируса ветряной оспы, US4 и US5 вирусов простого герпеса 1-го и 2-го типов, соответственно. В других работах также были предложены способы, позволяющие детектировать и дифференцировать ДНК ортопоксвирусов, патогенных для человека с помощью олигонуклеотидных микрочипов с высокой чувствительностью и специфичностью (Fitzgibbon and Sagripanti, 2006). Однако к настоящему моменту нет ни одного коммерчески доступного диагностического набора для обнаружения ДНК ортопоксвирусов на основе методики микрочипов.

Мультиплексная полимеразная цепная реакция – вариант ПЦР, в которой в реакционной смеси одновременно присутствует смесь нескольких пар праймеров, специфичных в отношении разных генетических локусов, что позволяет проводить одновременную амплификацию соответствующих участков ДНК-матриц. Идея амплифицировать в одной пробирке сразу несколько различных генетических локусов привела к разработке в ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” одностадийного экспресс метода идентификации четырех видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе мультиплексной ПЦР (МПЦР) с последующим электрофоретическим анализом продуктов реакции (Гаврилова и др., 2003; Shchelkunov et al., 2005a). Специфичность разработанного метода МПЦР оценили на панели образцов ДНК 59 штаммов ортопоксвирусов, включая архивный клинический материал (корочки кожных поражений), полученный от людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой или оспой обезьян (коллекция ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”). Специфичность составила 100%.

Результаты выполненной работы представляют значительный практический интерес. Данный подход лег в основу набора реагентов “ВЕКТОР-МПЦР-ОСПА”, на которое получено регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09002 и разрешение к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации. На основе ПЦР в реальном времени в ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” также разработан метод мультиплексной TaqMan ПЦР в реальном времени (MuRT-PCR) для специфического выявления и дифференциации в одной реакции ДНК патогенных для человека ВНО, ВОО, ВОК, ВОВ (Shchelkunov et al., 2011). Для проведения MuRT-PCR-анализа ортопоксвирусных ДНК использовали одновременно четыре пары видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и четыре гибридизационные олигонуклеотидные пробы с различными флуоресцентными красителями и соответствующими тушителями флуоресценции. Специфичность и чувствительность разработанного метода оценена при анализе ДНК 29 штаммов ортопоксвирусов, включая архивный клинический материал, полученный от людей, больных оспой, а также при анализе ДНК экспериментального материала, выделенной от мышей, зараженных ВОК и сурков, зараженных ВОО. Специфичность составила 100%. Данная процедура позволяет с большей чувствительностью и в более короткое время по сравнению с ранее разработанным методом МПЦР осуществлять видоспецифичную генодиагностику ортопоксвирусов, патогенных для человека.
Заключение

Существование связанных с грызунами природных очагов таких патогенных для человека ортопоксвирусов, как ВОО и ВОК в пределах экваториального, тропического, субтропического, умеренного климатических поясов (Shchelkunov et al., 2005b); многочисленные сообщения о случаях поражения человека данными вирусами в последнее время; отсутствие у населения поствакцинального иммунитета и в связи с этим возрастающая угроза биотерроризма – все это делает риск обострения эпидемической ситуации по ортопоксвирусным инфекциям c возможными катастрофическими последствиями. В связи с этим, разработка быстрых высокочувствительных методов видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов становится все более актуальной.

1. 
   Abrahao J.S., M.I.M. Guedes, G.S. Trindade, F.G. Fonseca, R.K. Campos, B.F. Mota, Z.I.P. Lobato, A.T. Silva-Fernandes, G.O.L. Rodrigues, L.S. Lima, P.C.P. Ferreira, C.A. Bonjardim, and E.G. Kroon. 2009. One more piece in the VACV ecological puzzle: could peridomestic rodents be the link between wildlife and bovine vaccinia outbreaks in Brazil? PLoS ONE. 4:E7428.
   
2. 
   Aitichou M., Saleh S., Kyusung P., Huggins J., O'Guinn M., Jahrling P. et al. Dual-probe real-time PCR assay for detection of variola or other orthopoxviruses with dried reagents. J Virol Methods. 2008; 153(2):190-5.
   
3. 
   Alcami A., Damon I., Evans D., Huggins J. W., Hughes Ch., Jahrling P. B., McFadden G., Meyer H., Moss B., Shchelkunov S., Stavskiy E., Tikunova N. WHO-2010.
   
4. 
   Baxby D., Ashton D.G., Jones D.M., Thomsett L.R. An outbreak of cowpox in captive cheetahs: virological and epidemiological studies. // J. Hyg. (Lond). – 1982. – V. 89. – P. 365-372.
   
5. 
   Bhanuprakash V., G. Venkatesan, V. Balamurugan, M. Hosamani, R. Yogisharadhya, P. Gandhale, K.V. Reddy, A.S. Damle, H.N. Kher, B.S. Chandel, H.C. Chauhan, and R.K. Singh. 2009. Zoonotic Infections of Buffalopox in India. Zoonoses Public Health.
   
6. 
   Bonnekoh B., Falk K., Reckling K., Kenklies S., Nitsche A., Ghebremedhin B., et al. Cowpox infection transmitted from a domestic cat. J Dtsch Dermatol Ges. 2008; 6:210-3.
   
7. 
   Bray M. Pathogenesis and potential antiviral therapy of complications of smallpox vaccination. // Antiviral Res. – 2003. – V. 58. – P. 101–114.
   
8. 
   Bray, M., and Buller, M., 2004. Looking back at smallpox. Clin. Infect. Dis. 38, 882-889.
   
9. 
   Breman J.G. Monkeypox: an emerging infection for humans? In: Scheld W.M., Craig W.A., Hughes J.M. (eds.). Emerging infections 4. – Washington, DC: American Society for Microbiology Press. – 2000. – P. 45-67.
   
10. 
    Campe H, Zimmermann P, Glos K, Bayer M, Bergemann H, Dreweck C, et al. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, Germany. Emerg Infect Dis 2009; 15:777-80.
    
11. 
    Campe H., Zimmermann P., Glos K., Bayer M., Bergemann H., Dreweck C., et al. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, Germany. Emerg Infect Dis. 2009; 15:777-80.
    
12. 
    Carletti, F., Bordi, L., Castilletti, C., Di Caro, A., Falasca, L., Gioia, C., 2009. Cat-to-human orthopoxvirus transmission northeastern Italy. Emerg Infect Dis. 15, 499-500.
    
13. 
    CDC. Update: multistate outbreak of monkeypox in Illinois, Kansas, Missouri, Ohio, and Wisconsin, 2003. // MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. – 2003. – V. 52. – P. 642-646.
    
14. 
    CDC. Updated interim CDC guidance for use of smallpox vaccine, cidofovir, and vaccinia immune globin (VIG) for prevention and treatment in the setting of an outbreak of monkeypox infections. http://www.cdc.gov/ncidod/monkeypox/treatmentguidelines.htm. – 2003b.
    
15. 
    Damaso, C.R.A., Esposito, J.J., Condit, R.C., Moussatche, N., 2000. An emergent poxvirus from human and cattle in Rio de Janeiro State: Cantagalo virus may derive from Brazilian smallpox vaccine. Virology. 277, 439-449.
    
16. 
    Damon I.K., Roth C.E., Chowdhary V. Discovery of monkeypox in Sudan. // N. Engl. J. Med. – 2006. – V. 355. – № 9. – P. 962-963.
    
17. 
    Espy M.J., Cockerill F.R., Meyer R.F., Bowen M.D., Poland G.A., Hadfield T.L., et al. Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(6):1985-1988.
    
18. 
    Fedele C.G., Negredo A., Molero F., Sanchez-Seco M.P., Tenorio A. Use of Internally Controlled Real-Time Genome Amplification for Detection of Variola Virus and Other Orthopoxviruses Infecting Humans. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(12):4464-4470.
    
19. 
    Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. The Orthopoxviruses. – San Diego, New York, Berkeley, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto: Academic Press, Inc. – 1989. – P. 432.
    
20. 
    Ferreira JM, Abrahão JS, Drumond BP, Oliveira FM, Alves PA, Pascoal-Xavier MA, Lobato ZI, Bonjardim CA, Ferreira PC, Kroon EG. Vaccinia virus: shedding and horizontal transmission in a murine model. J Gen Virol. 2008 Dec;89(Pt 12):2986-91.
    
21. 
    Fitzgibbon J.E. and Sagripanti J.L. Simultaneous identification of orthopoxviruses and alphaviruses by oligonucleotide macroarray with special emphasis on detection of variola and Venezuelan equine encephalitis viruses. J. Virol. Methods. 2006; 131(2):160-167.
    
22. 
    Gavrilova E.V., Shcherbakov D.N., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. Development of Real-Time PCR Assay for Detection of Cowpox Virus. Journal of Clinical Virology. 2010; 49(1):37-40.
    
23. 
    Henderson D.A. 1999. The looming threat of bioterrorism. Science. 283:1279-1282.
    
24. 
    Honlinger, B., Huemer, H.P., Romani, N., Czerny, C.P., Eisendel, K., Hopel, R., 2005. Generalized cowpox infection probably transmitted from a rat. Br. J. Dermatol. 153, 451-453.
    
25. 
    Hutin Y.J., Williams R.J., Malfait P., Pebody R., Loparev V.N., Ropp S.L. Outbreak of human monkeypox, Democratic Republic of Congo, 1996 to 1997. // Emerg. Infect. Dis. – 2001. – V. 7. – P. 434–438.
    
26. 
    Ibrahim M.S., Kulesh D.A., Saleh S.S., Damon I.K., Esposito J.J., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Real-time PCR assay to detect smallpox virus. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(8):3835-3839.
    
27. 
    Kinnunen P.M., Henttonen H., Hoffmann B., Kallio E.R., Korthase C., Laakkonen J., et al. Orthopox virus infections in Eurasian wild rodents. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011; 11(8):1133-40.
    
28. 
    Kulesh D.A., Baker R.O., Loveless B.M., Norwood D., Zwiers S.H., Mucker E., Hartmann C., Herrera R., Miller D., Christensen D., Wasieloski L.P., Huggins J., Jahrling P.B. Smallpox and pan-orthopox virus detection by real-time 3'-minor groove binder TaqMan assays on the Roche LightCycler and the Cepheid Smart Cycler platforms. // J. Clin. Microbiol. – 2004. – V. 42. – № 2. – P. 601-609.
    
29. 
    Ladnyi I.D., Ziegler P., Kima A. A human infection caused by monkeypox virus in Basankusu Territory, Democratic Republic of the Congo. // Bull. W.H.O. – 1972. – V. 46. – P. 593-597.
    
30. 
    Learned L.A., Reynolds M.G., Wassa Wassa D., Li Y., Olson V.A., Karem K., Stempora L.L., Braden Z.H., Kline R., Likos A., Libama F., Moudzeo H., Bolanda J.D., Tarangonia P., Boumandoki P., Formenty P., Harvey J.M., Damon I.K. Extended interhuman transmission of monkeypox in a hospital community in the republic of the Congo, 2003. // Am. J. Trop. Med. Hyg. – 2005. – V. 73. – № 2. – P. 428–434.
    
31. 
    Levine, R.S., Townsend Peterson, A., Yorita, K.L., Carroll, D., Damon, I.K., Reynolds, M.G., 2007. Ecological niche and geographic distribution of human monkeypox in Africa. PLoS One. 2, e176.
    
32. 
    Likos A.M., Sammons S.A., Olson V.A., Frace A.M., Li Y., Olsen-Rasmussen M., Davidson W., Galloway R., Khristova M.L., Reynolds M.G., Zhao H., Carroll D.S., Curns A., Formenty P., Esposito J.J., Regnery R.L., Damon I.K. A tale of two clades: monkeypox viruses. // J. Gen. Virol. – 2005. – V. 86. – P. 2661–2672.
    
33. 
    Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Fimina V.A. Pox infection in white rats. // Lab. Anim. – 1978. – V. 12. – № 1. – P. 33-36.
    
34. 
    Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Maltseva N.N., Cimiskjan K.L., Macevic G.R. Isolation and properties of the casual agent of a new variola-like disease (monkeypox) in man. // Bull. W.H.O. – 1972. – V. 46. – P. 599-611.
    
35. 
    Michaeli, D. 2002. Smallpox: A possible comeback. IMAJ. 4, 487-488.
    
36. 
    Mukinda V.B.K., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Monkeypox Epidemiologic Working Group. // Lancet. – 1997. – V. 349. – P. 1449-1450.
    
37. 
    Ninove L., Domart Y., Vervel C., Voinot C., Salez N., Raoult D. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15:781-4.
    
38. 
    Ninove, L., Domart, Y., Vervel, C., Voinot, C., Salez, N., Raoult, D., Meyer, H., Capek, I., Zandotti, C., Charrel, R.N., 2009. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. Emerg. Infect. Dis. 15, 781-4.
    
39. 
    Nitsche A., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of orthopoxvirus DNA by real-time PCR and identification of variola virus DNA by melting analysis. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(3):1207-1213.
    
40. 
    Nitsche A., Kurth A., Pauli G. Viremia in human Cowpox virus infection. J. Clin. Virol. 2007; 40:160-2.
    
41. 
    Nitsche A., Steger B., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of vaccinia virus DNA on the LightCycler by fluorescence melting curve analysis. // J. Virol. Methods. – 2005. – V. 126. – P. 187-195.
    
42. 
    Olson V.A., Laue T., Laker M.T., Babkin I.V., Drosten C., Shchelkunov S.N., Niedrig M., Damon I.K., Meyer H. Real-time PCR system for detection of orthopoxviruses and simultaneous identification of smallpox virus. // J. Clin. Microbiol. – 2004. – V. 42. – № 5. – P. 1940-1946.
    
43. 
    Panning M., Asper M., Kramme S., Schmitz H., Drosten C. Rapid detection and differentiation of human pathogenic orthopox viruses by a fluorescence resonance energy transfer real-time PCR assay. Clin. Chem. 2004; 50(4):702-708.
    
44. 
    Parker, S., Nuara, A., Buller, R.M.L., Schultz, D.A., 2007. Human monkeypox: an emerging zoonotic disease. Futur. Microbiol. 2, 17-34.
    
45. 
    Pelkonen, P.M., Tarvainen, K., Hynninen, A., Kallio, E.R.K., Henttonen, H., Palva, A., Vaheri, A., Vapalahti, O., 2003. Cowpox with severe generalized eruption, Finland. Emerg. Infect. Dis. 9, 1458-1461.
    
46. 
    Putkuri N., Piiparinen H., Vaheri A., Vapalahti O. Detection of human orthopoxviruses infections and differentiation of smallpox virus with real-time PCR. J. Med. Virol. 2009; 81:146-152.
    
47. 
    Reed, K.D., Melski, J.W., Graham, M.B., Regnery, R.L., Sotir, M.J., Wegner, M.V., Kazmierczak, J.J., Stratman, E.J., Li, Y., Fairley, J.A., Swain, G.R., Olson, V.A., Sargent, E.K., Kehl, S.C., Frace, M.A., Kline, R., Foldy, S.L., Davis, J.P., Damon, I.K., 2004. The detection of monkeypox in humans in the Western Hemisphere. 350, 342-350.
    
48. 
    Rimoin, A.W., Mulembakani, P.M., Johnston, S.C., Lloyd Smith, J.O., Kisalu, N.K., Kinkela, T.L., Blumberg, S., Thomassen, H.A., Pike, B.L., Fair, J.N., Wolfe, N.D., Shongo, R.L., Graham, B.S., Formenty, P., Okitolonda, E., Hensley, L.E., Mayer, H., Wright, L.L., Muyembe, J., 2010. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 16262-16267.
    
49. 
    Ryabinin V.A., Shundrin L.A., Kostina E.B., Laassri M., Chizhikov V., Shchelkunov S.N., Chumakov K., Sinyakov A.N. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. J. Med. Virol. 2006; 78(10):1325-1340.
    
50. 
    Saijo M., Ami Y., Suzaki Yuriko., Nagata N., Iwata N., Hasegawa H., Ogata M., et al. (2008) Diagnosis and assessment of monkeypox virus (MPXV) infection by quantitative PCR assay: differentiation of congo basin and west African MPXV strains. // Jpn. J. Infect. Dis. V.61. P. 140-142.
    
51. 
    Scaramozzino N., Ferrier-Rembert A., Favier A., Rothlisberger C., Richard S., Crance J., et al. Real-time PCR to identify variola virus or other human pathogenic orthopox viruses. Clin. Chem. 2007; 53(4):606-613.
    
52. 
    Schmidt M., Roth K.W., Meyer H., Seifried E., Hourfar M.K. Nucleic acid test screening of blood donors for orthopoxviruses can potentially prevent dispersion of viral agents in case of bioterrorism. Transfusion. 2005; 45:399-403.
    
53. 
    Shchelkunov S.N., Gavrilova E.V., Babkin I.V. Multiplex PCR detection and species differentiation of orthopoxviruses pathogenic to humans. // Molecular and Cellular Probes. 2005a. V. 19. P. 1-8.
    
54. 
    Shchelkunov S.N., S.S. Marennikova, and R.W. Moyer. Orthopoxviruses pathogenic for humans. New York: Springer; 2005b, 425.
    
55. 
    Shchelkunov S.N., Shcherbakov D.N., Maksyutov R.A., Gavrilova E.V. Species-specific identification of variola, monkeypox, cowpox, and vaccinia viruses by multiplex real-time PCR assay. J Virol Methods. 2011; 175(2):163-9.
    
56. 
    Shchelkunov, S.N., 2009. How long ago did smallpox virus emerge? Arch. Virol. 154, 1865-1871.
    
57. 
    Silva-Fernandes A.T., C.E.P.F. Travassos, J.M.S. Ferreira, J.S. Abrahao, E.S. Rocha, F. Viana-Ferreira, J.R. dos Santos, C.A. Bonjardim, P.C. Ferreira, E.G. Kroon. 2009. Natural human infections with Vaccinia virus during bovine Vaccinia outbreaks. J. Clin. Virol. 44:308-313.
    
58. 
    Singh R.K., M. Hosamani, V. Balamurugan, C.C. Satheesh, K.R. Shingal, S.B. Tatwarti, R.G. Bambal, V. Ramteke, and M.P. Yadav. 2006. An outbreak of buffalopox in buffalo (Bubalus bubalis) dairy herds in Aurangabad, India. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 25:981-987.
    
59. 
    Stittelaar K.J., Neyts J., Naesens L., Amerongen G., Lavieren R.F., Holý A., De Clercq E., Niesters H.G., Fries E., Maas C., Mulder P.G., Zeijst B.A., Osterhaus A.D. Antiviral treatment is more effective than smallpox vaccination upon lethal monkeypox virus infection. // Nature. – 2006. – V. 439. – P. 745-748.
    
60. 
    Trindade G., G.L. Emerson, D.S. Carroll, E.G. Kroon, and I.K. Damon. 2007. Brazilian vaccinia viruses and their origins. Emerg. Infect. Dis. 13:965-972.
    
61. 
    Trindade G.H., Li Y., Olson V.A., Emerson G., Regnery R.L., Fonseca F.G., Kroon E.G., Damon I. (2008) Real-time PCR assay to identify variants of Vaccinia virus: implications for the diagnosis of bovine vaccinia in Brazil. // J. Virol. Methods. V.152. P. 63-71.
    
62. 
    Virus Taxonomy: The Classification and Nomenclature of Viruses. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. VII Report of the ICTV. – In: Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R.B. (eds). – San Diego: Academic Press. – 2000.
    
63. 
    Vorou RM, Papavassiliou VG, Pierroutsakos IN. Cowpox virus infection: an emerging health threat. Curr Opin Infect Dis 2008; 21:153-6.
    
64. 
    Weekly Epidemiological Record. Human monkeypox in Kasai Oriental, Zaire (1996-1997). – 1997. – V. 72. – № 15. – P. 101-104.
    
65. 
    Zafar A., R. Swanepoel, R. Hewson, M. Nizam, A. Ahmed, A. Husain, A. Grobbelaar, K. Bewley, V. Mioulet, B. Dowsett, L. Easterbrook, and R. Hasan. 2007. Nosocomial buffalopoxvirus infection, Karachi, Pakistan. Emerg. Infect. Dis. 13:902-904.
    
66. 
    Гаврилова Е.В., Бабкин И.В., Щелкунов С.Н. Мультиплексный ПЦР-анализ для видоспецифичной экспресс идентификации ортопоксвирусов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003; 1:45-52.
    
67. 
    Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. – Москва: KMK Scientific Press Ltd. – 1998. – C. 386.
    
68. 
    Мацевич Г.Р., Радюк С.Н., Рыжов К.А., Анджапаридзе О.Г. Эволюция методов лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций. // Вопр. вирусол. – 1996. – Т. 41. – № 5. – С. 195-197.
    
69. 
    Методические рекомендации. Натуральная оспа (клиника, лечение, иммунопрофилактика). – Москва: ФМБА. – 2006. – С. 60.
    
70. 
    Методические указания МУ 1.3.2970-11 "1.3. Эпидемиология. Лабораторная диагностика натуральной оспы "