Учебно методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу вирусологии

ЗАНЯТИЕ 4. Люминесцентная микроскопия. Метод флуорохромирования -17ст

ЗАНЯТИЕ 6. Электронная микроскопия вирусов -23ст

ЗАНЯТИЕ 7. Культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) -25ст

ЗАНЯТИЕ 8. Вскрытие куриных эмбрионов. -29ст

ЗАНЯТИЕ 9. Принципы культивирования вирусов в культуре клеток -31ст

ЗАНЯТИЕ 10. Получение первично-трипсинизированных культур клеток из развивающихся куриных эмбрионов -36ст

ЗАНЯТИЕ 11. Перевиваемые культуры клеток -38ст

ЗАНЯТИЕ 12. Заражение, культивирование вирусов в организме лабораторных животных и выделение. –42ст

ЗАНЯТИЕ 13. Принципы титрования вирусов и антисывороток -48ст

Литература -53ст

Структура вирусологической лаборатории зависит от задач и особенносте её деятельности. Как правило, вирусологические лаборатории, независимо от специализации, должны размещаться в чистых светлых помеще­ниях с необходимым оборудованием и мебелью. Их следует изо­лировать от других лабораторий (бактериологических, токсикологическтх и др). Независимо от характера выполняемой работы в них необходимо поддерживать рабочую чистоту. Кроме еже­дневной обычной уборки, помещения периодически обрабатывают растворами дезинфицирующих веществ (карболовой кислоты, ли­зола, хлорной извести, хлорамина и т.п.) и подвергают ультра­фиолетовому облучению. Комнаты, предназначенные для работы с вирусами, должны быть хорошо освещены и состоять из двух от­делений, разобщенных стеклянной перегородкой: предбоксника и бокса. В боксах, организованных по типу операционных, над ра­бочим столом, покрытым пластиком или нержавеющей сталью, на расстоянии 50-70 см от поверхности устанавли­вают бактерицидные лампы БУВ-30 или БУВ-60 для уничтожения инфекционных агентов. Дополнительно в боксе желательно иметь пере­движную кварцевую лампу типа ПРК-4. У входа в бокс должен лежать коврик, пропитанный дезраствором. В предбокснике в биксах должны быть сменные тапочки или сменная обувь, стерильные халаты, шапочки, маски, которые одевают перед работой.

Боксы и предбоксники, кроме ежедневной влажной дезин­фекционной обработки, необходимо облучать бактерицидными лампами в течение 30-40 мин перед началом и после работы.. В предбокснике должны быть стерильные халаты, тапоч­ки, маски, которые надевают перед работой, а так же можно размещать дополнительное оборудование.: термостаты, холодильники, центрифуги лабораторные, микроскопы, водяную баню и пр.

В боксе, кроме рабочих столов и стульев, должно быть все необходимое для работы: стерилизаторы для инструментов, банки с дезрастворами для отработанных пипеток, бак с дезраствором для сбора отработанных материалов, баночки со спиртом, йодом, штативы для пробирок, пробирки с бульоном для проверки бактериального загрязнения, стерильные пипетки, ступки и т.д.

Потолок и стены лабораторных комнат покрывают масля­ной краской (стены на 1,5 м от пола можно выложить кафельны­ми плитками), пол — линолеумом или кафельными плитками. Лаборатория должна иметь 5-6 комнат, отдельный вход для сотрудников и для посетителей с тамбуром, обязателен гардероб и душевая.

Регистрация поступающего на исследование патологи­ческого материала проводят в приемной. Пол в ней должен быть бетонный, стены покрыты масляной краской или керамиче­ской плиткой, окна заделаны железными решетками. При входе необходимо положить коврик с дезинфи­цирующим раствором. В приемной размещают несколько столов, обитых оцинкованной жестью, бак с дезинфицирующим раство­ром (чаще всего с 3% раствором хлорамина или 5%-ным раствором фенола).

В комнате для предварительной обработки материала прово­дят вскрытие трупов и отбор материала для дальнейшего иссле­дования. В ней должны быть бокс с предбоксником, соединенный окном с виварием для инфицированных животных. В боксе раз­бирают поступившие пробы, готовят и фиксируют мазки — отпе­чатки и т.д. В комнате также должны быть столы для вскрытия трупов и обработки материала. На столе для вскрытия трупов по­мещают инструментарий (ножницы, пинцеты, скальпели, корн­цанги), эмалированный тазик, сосуды с дезинфицирующими рас­творами, стерильную посуду для сбора материала.

Комнату для вирусологических исследований оборудуют: термостатами, холодильниками, центрифугами, весами различных типов, электроплитками, фильтрами, насосами, водяными банями, электромагнитными мешалками и т д.. Лабораторию снабжают в достаточном количестве биксами, фильтрами Зейтца, ящиками для хранения сред, эмали­рованной и стеклянной посудой — матрацами, флаконами, кол­бами разных объемов, градуированными пипетками, микропипет­ками; цилиндрами и стаканами, пробирками серологическими, бактериологическими и центрифужными, ампулами и резиновы­ми пробками разных размеров, металлическими штативами для пробирок, карандашами по стеклу, фильтровальной бумагой, лей­копластырем и т.п.

На столах для определенных операций за каждым работаю­щим закрепляют рабочее место. Здесь размещают нужную аппа­ратуру, соответствующие дезинфицирующие средства, краски, реактивы. На операционном столе необходимы микроскоп, набор инструментов (пинцеты, ножницы, скальпели и др.), вата, пасте­ровские пипетки, стерильные и обезжиренные покровные и пред­метные стекла, физраствор. При работе с куриными эмбрионами должны быть подставки для яиц, овоскопы, инструменты для вскрытия (ножницы, глазные пинцеты).

В автоклавной необхо­димо иметь два автоклава, для чистых материалов – где стерилизуют посуду, питательные среды, инструменты, обезвреживают заразный материал - и для инфици­рованных, бак для сбора инфицированного материала. Допускается наличие сушильных шкафов, дистилляторов, столов и шкафов для стерильной посуды.

Моечная предназначена для мытья посуды и приборов. В ней должна быть машина для посуды и белья, су­шильные шкафы и т.д. Посуду, пипетки и инструменты, загряз­ненные инфицированным материалом, моют только после стери­лизации.

Виварием называется помещение, используемое для выращивания и содержания лабораторных животных. В виварии имеется карантинное отделение, комнаты для экспериментальных и здоровых животных, мытья и дезин­фекции клеток, инвентаря и спецодежды, кухня для приготовле­ния пищи, кладовая, фуражная, трупосжигательная печь и др. Все помещения вивария должны быть изолированы друг от друга и иметь самостоятельные входы с дезковриками. Кроме того, они должны быть непроницаемыми для грызунов и различных насе­комых. Виварий должен быть теплым, светлым (с источником дневного света) и сухим. В холодное время года здесь поддержи­вают температуру 12-20 °С.

Лабораторных животных содержат в клетках. В одной клетке может быть 1-2 кролика, 5-6 морских свинок, 8-10 крыс, 15-20 мышей. На каждой клетке с животными вывешивают пас­порт, где отмечают дату их поступления в виварий, массу, в пас­порте на клетках с подопытными животными дополнительно от­мечают дату заражения и вид вируссодержащего материала.

Чистку клеток и вивария делают ежедневно, используя мыльно-карболовый раствор. После уборки тщательно моют руки и обрабатывают их 2%-ным раствором хлорамина.

Сотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблю­дать следующие правила, предупреждающие попадание бактерий и плесневых грибов в исследуемый материал и возможность внутрилабораторных заражений персонале и распространения инфек­ции.

1. Работать разрешается в специальной одежде — халате и шапочке. При работе с особо опасным материалом дополнительно одевают резиновые перчатки, марлевую маску и защитные очки. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, при необ­ходимости надевают резиновые перчатки и очки. Обязательно ме­няют обувь. В виварии во время мытья посуды и уборки на халат надевают передники, а на ноги — резиновые сапоги.

2. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнюю одежду на халат.

3. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

4. Не допускаются хождение, разговоры во время работы.

5. Весь материал, поступающий в лабораторию на анализ, должен рассматриваться как инфицированный.

6. При распаковке материала необходимо соблюдать осто­рожность. Банки следует обтирать снаружи дезинфицирующим раствором и старить их на подносы или кюветы.

7. Переливание жидкостей, содержащих вирусы, производят над сосудом, наполненным дезраствором.

8. В случае попадания заразного материала на халат, руки, стол, обувь и т.д. надо сообщить об этом заведующему лаборато­рией (в учебных заведениях — преподавателю) и немедленно про­извести под его контролем дезинфекцию. При подозрении на за­ражение необходимо обратиться к врачу.

9. Зараженный материал подлежит обязательному уничто­жению (автоклавирование, сжигание), по возможности в тот же день. Инструменты, а также поверхность рабочего стола после работы сразу же дезинфицируют.

10. При работе с пипетками для разлива жидкого инфици­рованного материала пользуются резиновыми баллончиками (грушами) небольшого объема.

11. В журнале регистрации ежедневно делают записи отно­сительно использованного заразного материала и его уничтоже­ния.

12. Запрещается выносить из лаборатории оборудование, инвентарь, материалы и т.д. без предварительной дезинфекции их на месте.

13. Пипетки, предметные и покровные стекла и другую по­суду, бывшую в употреблении, обеззараживают, погружая в 5%-ный раствор лизола, фенола или серной кислоты, которые всегда должны быть на столах.

14. Запрещается оставлять на рабочих столах бактериологи­ческие чашки, пробирки и другую посуду с заразным материалом.

15. По окончании работы рабочее место приводят в порядок и тщательно дезинфицируют. Вируссодержащий материал, необ­ходимый для дальнейшей работы, ставят на хранение в сейф-холодильник и опечатывают. Руки тщательно дезинфицируют мыльным спиртом, 70°-ным спиртом и др. Лабораторию закры­вают и опечатывают.

Для всех вирусологических лабораторий установлен единый порядок обращения с вирусами, предусматривающий правила их хранения, регистрации, передачи от одного сотрудника другому внутри лаборатории и за ее пределы.

Культуру вирусов хранят в холодильнике минус (20... 70 °С) под замком с пломбой или печатью. Все пробирки и пенициллиновые флаконы, закрытые резиновыми пробками, должны иметь эти­кетки из лейкопластыря с указанием вида вирусов, индивидуаль­ного номера штамма и стабилизирующей среды, в которой он на­ходится. Лучшим способом сохранения вирусов является лиофилизация.

В вирусологической лаборатории должна быть следующая документация.

1. Инвентарная книга музейных штаммов вирусов.

2. Журнал учета движения вируссодержащего материала в лаборатории.

3. Журнал учета стерилизации и уничтожения инфициро­ванного материала.

4. Журнал учета зараженных подопытных животных.

5. Журнал вирусологических исследований (экспертиз).

6. Журнал учета выделяемых вирусов.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с вирусологической лабораторией кафедры и ее основным оборудованием.

2. Изучить правила работы с вируссодержащим материалом.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Объяснение преподавателя.

2. Запись в тетради требований при работе с вирусным ма­териалом и основных правил выполнения этих требований.

3. Роспись в журнале по технике безопасности.

4. Демонстрация: а) лаборатории и ее основного оборудова­ния;

б) организации рабочего места в боксе при работе с вируса­ми..

5. Самостоятельная работа студентов.

6. Подведение итогов.

7. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Занятие можно организовать следующим образом. После объяснения преподавателя и демонстрации (см. п. 4 занятий) сту­денты должны подготовить рабочее место для работы с вирусным материалом. Для этого они проводят его дезинфекцию раствором хлорамина, ставят на стол сосуд с 2%-ным дезраствором, контей­нер для отходов, спиртовку, баночку со стерильной ватой, готовят инструменты (шприц, иглы, пинцет) для стерилизации. Отраба­тывают приемы работы с пипеткой и грушей.

Для ознакомления с документацией лаборатории можно ис­пользовать ветеринарное законодательство, инструкции о прави­лах работы в лабораториях.

Вопросы домашнего задания

2. Предмет и задачи вирусологии.

3. Взятие, пересылка и сохранение вируссодержащего мате­риала.

4. Подготовка вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культуры клеток.

Вирусологическое исследование сводится к выделению виру­са из патматериала, его серологической идентификации и подроб­ному изучению различных свойств (патогенность, антигенность, культивируемость в лабораторных условиях, морфологические признаки).

В каждом случае заболевания с подозрением на вирусную этиологию в первую очередь надо выделить возбудителя из патма­териала. В этой связи правильный отбор, упаковка, транспортировка и обработка материала имеют очень большое значение для успешной постановки диагноза на вирусное заболевание.

Материал для исследования. От заболевших, павших или вынужденно убитых животных его отбирают как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2...3 ч после их клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или в первые 1-2 дня болезни значитель­но ослабевает барьерная роль кишечника, что наряду с повышен­ной проницаемостью кровеносных сосудов, способствует распространению кишечной микрофлоры

При взятии материала для выделения вируса следует исхо­дить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения в организме, места репродукции и пути выделе­ния). Так, при респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носовой полости и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; при энтеровирусных — кал; при нейротропных — кусочки головного или спинного мозга; при дерматропных инфекциях — свежие поражения кожи и т.п., т.е. отбирают тот материал, в котором предполагается наиболь­шая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса мо­гут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа и пр.

При вскрытии трупов животных материал отбирают при строгом соблюдении всех правил асептики и антисептики, чтобы не заразиться самому, не внести посторонних возбудителей в ис­следуемый материал и не допустить распространения инфекцион­ного начала.

Кровь берут из яремной вены, кончика хво­ста или уха, венозного сплетения глаз и т.д.

Для выделения вируса используют цельную дефибринированную, "лаковую" кровь (смесь крови с дистиллированной водой в отношении 1:1), либо отдельные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, плазма, сыворотка).

Для обнаружения противовирус­ных антител кровь берут у одного и того же животного дважды с интервалом в 2...3 недели (для получения парных сывороток в объеме не менее 5,0 мл каждой).

Смывы со слизистой оболочки носовой полости, глаз, с зад­ней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут сте­рильными ватными тампонами и погружают их в пенициллино­вые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости. Наиболее часто для этого используют раствор Хенкса или среды для культур клеток (ГЛА, 199, Игла) с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин по 500 ЕД и нистатин по 20 ЕД на 1 мл среды) с белковым стабилизатором, например, 0,5%-ным раствором желатина или 0,5...1%-ным раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов необходимо для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов, на­пример, вируса парагриппа.

При взятии материала из носоглотки можно использовать при­бор, сконструированный Томасом и Стоком. Он состоит из трубки диаметром 9 мм и длиной 30 см, внутри которой помещается вторая тонкая трубка с нержавеющим стержнем, оканчивающимся нейлоновой щеткой. Прибор вводят глубоко в носовые ходы (хоаны) или в горло через носовой ход, выдвигая щеточку, а затем вновь задвигая ее в трубку перед тем, как вынуть прибор из ор­гана. Щеточку тщательно отмывают от слизи и клеток в 2 мл жидкости (раствор Хенкса).

Слюну отбирают при наличии признаков поражения рото­вой полости или слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Если ее выделяется мало или она не вытекает, необходимо пропитать слюной стерильный там­пон на палочке, а затем поместить в пробирку с небольшим коли­чеством раствора Хенкса и закрыть резиновою пробкой. Для уси­ления слюноотделения животному можно ввести пилокарпин из расчета 0,02...0,05 г на 1 кг массы.

Мочу отбирают при помощи катетера в стерильную посуду.

Фекалии берут из прямой кишки при помощи шпателя или палочкой и помещают в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон.

Везикулярную жидкость собирают шприцем или пастеров­ской пипеткой в стерильную пробирку.

Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинце­том.

Спинномозговую жидкость берут асептически путем обычной пункции.

В качестве патматериала используют кусочки органов объе­мом несколько см³ и массой 10-20 г, которые:

а) имеют видимые отклонения от нормы по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необычных образований;

б) могут быть поражены и содержать вирус;

в) наиболее часто содержат вирус — печень, селезенка, лег­кие, головной мозг, лимфатические узлы, почки.

- пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволок­нистым лейкопластырем;

В качестве охлаж­дающей смеси используют смесь равных частей сухого льда (твер­дая углекислота) и этилового спирта, тогда температура минус 71 °С держится несколько дней. Можно использовать смесь, состоящую из трех весовых частей льда или снега и одной весовой части по­варенной соли. В последнем случае удается получить температуру минус 15... 20 °С. Вместо замораживания можно использовать хими­ческие консерванты, но это менее эффективно. Лучшим из них считается смесь равных объемов стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). Обычно эту смесь рекомендуют использовать для консервирования кусоч­ков паренхиматозных органов и тканей.

Глицерин — это простейший трехатомный спирт. Он сме­шивается с большинством компонентов живой клетки. В него бы­стро диффундирует вода и электролиты, а сам он легко проникает в другие растворы и гели и не переходит в твердое состояние при низких температурах - минус 110 °С.

Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведён­ном виде. Употребление его делает невозможным исследование патологического материала методом иммунофлуоресценции, по­этому одновременно с пробой патматериала необходимо направить мазки-отпечатки, приготов­ленные и фиксированные на предметном стекле, для ис­следования на люминесцент­ном микроскопе.

П
Рис.1. Предупреждающая этикетка, предложенная ВОЗ, для обозначения инфекционных субстанций
, включая вирусные
атматериал снабжают надежной и четкой этикеткой (рис.1.) недопустимо делать надписи карандашом по стек­лу. На пробирке или флакон­чике достаточно надежной является этикетка из лейко­пластыря, которую подписы­вают простым карандашом. На термос с пробами патма­териала навешивают бирку из картона или фанеры, на ко­торою указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос опечатывают. Взятый материал с сопроводитель­ным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, об эпизоотологических данных хозяйст­ва, предположительном диагнозе мерах, принятых для ликви­дации болезни (лечение, вакцинации и т.д.), а также дату и фа­милию ветеринарного врача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, матери­ал хранят при температуре минус (40... 70) °С. Большинство вирусов в крови, спинномозговой жидкости, моче, соскобах и смывах носо­глотки быстро разрушается, а вирус парагриппа кр. рог. скота и респираторно-синцитиальный вирус быстро погибают при замо­раживании, поэтому успех их выделения зависит от быстроты ис­следования. Если нет уверенности в том, что исследуемое инфек­ционное заболевание было вызвано только вирусом, часть материала следует отдать для бактериологического и микологиче­ского исследований.

Подготовка вируссодержащего материала. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть берут для вирусологического анализа, оставшуюся — хранят в холо­дильнике на случай необходимости дополнительных исследова­ний. Затем составляют план исследований присланного материа­ла.

Подготовку вируссодержещего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помо­щью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования.

Экспозиция суспензии с антибиотиками должна быть не ме­нее 30...60 мин при комнатной температуре, затем материал под­вергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического кон­троля вируссодержащий материал используют для заражения ла­бораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус (20... 70) °С.

Для освобождения вируссодержащего материала от микро­организмов применяют стерилизующее фильтрование. Чаще все­го используют асбестовые пластинки, керамические свечи, коллодийные мембраны и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром 35, 140 и 350 мм. Выпускают фильтры марки "Ф" (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие частично бактерии, и "СФ" (стерилизующие), задерживающие все виды бактерий, не пропускающие вирусы.

Коллодийные мембраны (ультрафильтры) готовят из нитро­клетчатки (коллодия) с точно калиброванными порами. Иногда их называют градоколовыми фильтрами (англ. graduate — калиб­ровать; кол — от слова коллодий). Широкое распространение по­лучили мембранные фильтры. Для фильтрования вирусов исполь­зуют фильтры с диаметром пор 100-400 нм. В настоящее время мембранные фильтры являются наиболее совершенными.

Керамические свечи представляют собой удлиненной формы полые цилиндры, закрытые в нижней части (свечи Шамберлена, Беркефельда, каолиновые фильтры Санкт-Петербургского кера­мического НИИ). Их изготовляют из каолина с различной степе­нью порозности.

Стеклянные фильтры готовят из пористого стекла. В по­следние годы довольно широкое распространение получили фильтры Шота с пластинкой №5 из сплавленных мельчайших гранул отекла.

Суспензии, содержащие вирус, перед фильтрованием необ­ходимо освободить от грубой взвеси. Для этого их вначале цен­трифугируют в течение 10...15 мин при 1500...2000 об/мин и фильтруют через бумажный фильтр большой порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (заключительному) фильтрованию, должна быть прозрачной и лишь слегка опалесцирующей. Жидкость, хранившуюся на холоде, перед фильтровани­ем рекомендуется в течение часа выдержать при комнатной тем­пературе, а затем нужный ее объем вылить в стакан фильтровального прибора. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи водоструйного или масляного насоса. Фильтрат проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов) путем посева на МПА, МПБ, среду Сабуро.

Следует отметить, что фильтрование сопровождается ад­сорбцией вируса на фильтре и приводит к его значительным поте­рям.

Отбор крови для серологических исследований. Для сероло­гической диагностики необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше — в инкубационный пе­риод или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую — во время выздоровления или через 2...3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо сте­рильно, нельзя применять энтикоагулянты или консерванты, ко­торые могут придать сыворотке антикомплементарность, а в ре­акции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус, оказаться токсичными для культур клеток или просто не­стерильными. Кровь в объеме 10... 15 мл берут в стерильные про­бирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной тем­пературе до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой или другим инструментом и переносят в холодильник при 4 °С на 18... 20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку от­сасывают, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаива­ния в холодильнике можно после обведения кровь центрифугиро­вать.

Серологические методы вирусологической диагностики тре­буют исследования парных проб сывороток, поэтому необходимо правильно сохранять первые пробы, пока не будут получены вто­рые. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4 °С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Подготовить исследуемый материал для заражения лабо­раторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток путем обработки антибиотиками.

2. Проверить полученный материал на стерильность путем высева на МПА, МПБ.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольные вопросы.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация: а) набора посуды и инструментов;

б) приемов взятия смывов со слизистой оболочки носовой полос­ти, конъюнктивы, прямой кишки у телят и других животных;

в) этикетирования и транспортировки взятого материала.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Занятие можно провести следующим образом. Первый час посвятить объяснению и демонстрации приемов взятия материала от животных, находящихся в клинике института. Второй час студенты проводят работу по подготовке материала к исследова­нию.

На данном занятии ограничиваются только демонстрацией взятия материала от животных, так как весь процесс студенты будут отрабатывать при прохождении учебно-производственной практики.

Вопросы домашнего задания

1. Морфология и химический состав вирусов.

2. Структура вирусов.

3. Функции нуклеиновой кислоты и вирусного белка в онто­генезе вирусов.

4. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

5. Микроскопический метод исследования.

ЗАНЯТИЕ 3. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Микроскопический метод исследования

Цель занятия: ознакомиться с методами лабораторной ди­агностики, световой микроскопии, а также техникой приготовле­ния и способами окрашивания мазков, препаратов-отпечатков и гистосрезов для выявления вирионов и внутриклеточных включе­ний.

Оборудование и материалы: микроскопы (соответственно количеству студентов), демонстрационные препараты с вирусами оспы, включениями Бабеша-Негри; предметные стекла, вируссодержащий материал (например, вирус осповакцины), пастеров­ские пипетки, реактивы для окрашивания по методу Морозова, таблицы по теме, диапозитивы.

Краткие теоретические сведения

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций сле­дующие.

1. Микроскопический метод исследования: а) в световом микроскопе; б) в люминесцентном микроскопе; в) в электронном микроскопе.

2.Выделение и культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов, лабораторных животных и культур клеток.

3.Серологический метод исследования (идентификация ви­русов) — постановка серологических реакций (РЗГА, РН и др.).

4. Биологический метод.

5. Генетические методы (ПЦР, рестрикционный анализ).

Микроскопию в световом микроскопе проводят с целью вы­явления крупных вирусов-вирионов, внутриклеточных включений и изучения патологических изменений клеток, пораженных виру­сами (ЦПД). Вирион — это зрелый внеклеточный вирус. Включе­ния представляют собой вирусный материал, находящийся внутри клетки, в образовании которого участвуют и клеточные продук­ты. Вирионы могут быть обнаружены в мазках и препаратах-отпечатках из инфицированной ткани; включения — только в препаратах-отпечатках и гистосрезах, приготовленных из пора­женных органов и тканей.

Оспа овец, свиней и коров, эктима овец, оспа-дифтерит птиц — это такие инфекции, при которых обнаружение вирионов-возбудителей приобрело диагностическое значение. Для выявле­ния вирионов используют методы окрашивания, которые позво­ляют увеличить вирусную частицу в размерах и сделать ее более контрастной. В целях получения хороших результатов использу­ют чистые обезжиренные предметные стекла. Препараты готовят из тщательно размельченного материала или путем отпечатков стараясь сделать их как можно тоньше. При каждом вирусном заболевании учитывают, какие органы и ткани наиболее пораже­ны и какие участки их следует исследовать, выбирают также соответствующий метод фиксации. Существует ряд методов окра­ски вирионов.

Окраска по Морозову применяется в процессе диагностики оспы овец. Возбудителей болезни выявляют в препаратах-отпечатках, мазках из чистых суспензий. При иссле­довании последних на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят небольшую каплю материала и распределяют ее тонким слоем, для окрашивания готовят три реактива.

Реактив №1 (фиксатор — жидкость Руге): 2 мл 40%-ного формальдегида (продажный формалин), 1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды.

Реактив №2 (протравитель): 5 г танина, 2 мл жидкого фено­ла, 100 мл дистиллированной воды (если появляется осадок, рас­твор фильтруют).

Реактив №3 (краситель): 5 г азотнокислого серебра раство­ряют в 100 мл дистиллированной воды, затем осторожно по кап­лям добавляют раствор 25%-ного аммиака до появления легкой опалесценции. Перед употреблением разводят дистиллированной водой 1:10.

Готовые препараты высушивают на воздухе, 2...3 мин от­мывают дистиллированной водой в вертикальном положении. За­тем на них наносят реактив №1, через 1 мин его сливают, мазок промывают и наносят на 1...2 мин реактив №2, проводя препарат над пламенем спиртовки до появления паров. Далее мазок тща­тельно промывают дистиллированной водой и на 1...2 мин нано­сят реактив №3, прогревая препарат на огне, пока он не станет темно-коричневым. После этого препарат снова тщательно про­мывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

На светло-коричневом фоне препарата вирионы имеют вид темно-коричневых или черных точек, расположенных одиночно, попарно или в виде скоплений. Результат будет положи­тельным только в случае массового обнаружения характерных образований.

Окраска по Маккиавелло сводится к следующему. Высу­шенные нефиксированные пре­параты окрашивают 5 мин про­фильтрованным 0,25%-ным раствором основного фуксина, краситель сливают, а мазок бы­стро (1с) проводят через 0,5%-ный раствор лимонной ки­слоты, тщательно промывают водопроводной водой и окраши­вают 5-10 с 1%-ным раствором метиленовой сини. Затем препа­рат вновь промывают, высуши­вают и микроскопируют.

Вирионы окрашиваются в яркий рубиново-красный цвет, ци­топлазма клеток — в светло-синий, ядра — в темно-синий.

Окраска по Романовскому-Гимзе заключается в том, что препараты фиксируют в метиловом спирте 5 мин, нанося на них раствор краски Романовского-Гимзы (1 мл маточного раствора на 10... 15 м. дистиллированной воды), окрашивают 30... 60 мин, краску сливают и тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10... 15 мин. Высушенные препараты лучше провести через абсолютный спирт, толуол и заключить в бальзам. Вирионы при этом способе окрашивания приобретают темно-фиолетовый цвет, фон препарата — голубой.

При некоторых вирусных инфекциях диагностическим при­знаком является образование в клетках особых включений. Они обнаруживаются при бешенстве, оспе, гриппе свиней, чуме собак, болезни Ауески и др. Специальными методами окраски выявля­ются как внутрицитоплазматические, тик и внутриядерные включения. Наиболее часто они используются при диагностике бешенства.

Окраска по Муромцеву. Препарат фиксируют метиловым спир­том, отмывают от фиксатора и окрашивают 10 мин синькой Мансона (в 100 мл кипящей дистиллированной веды растворяют 5-6 г химически чистой буры, добавляют 2 г метиленовой сини, охлаж­дают и фильтруют) в разведении 1:40. Непромытый мазок вы­держивают в 10%-ном растворе танина до тех пор, пока он не приобретет вместо сине-фиолетового цвета голубой. Затем его промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и в тече­ние нескольких секунд проводят через абсолютный спирт. После этого высушивают и микроскопируют. Включения Бабеша-Негри представляют собой фиолетовые образования различных размеров (0,2...20 мкм) и формы на голубом фоне цитоплазмы, ядра клеток ок­рашиваются в синий цвет.

Окраска по Манну. Препарат фиксируют в жидкости Буэна 2 ч и окрашивают 4 ч при 37 °С или 18 ч при комнатной температуре в растворе следующего состава:

17мл 1%-ного раствора метиленовой сини, 23 мл 1%-ного рас­твора эозина, 40 мл дистиллированной воды. Раствор готовят пе­ред употреблением. После окрашивания препарат тщательно про­мывают и обезвоживают в трех растворах щелочного спирта: 1) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 30 капель 1%-ного раствора каустической соды в этом спирте, 2) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 20 капель раствора соды, 3) к 30 мл абсолютного спир­та добавляют 10 капель раствора соды. Обезвоживание прекра­щают, если препарат принимает светло-розовый оттенок. Такой препарат проводят через абсо­лютный спирт и обезвоживают в кислом спирте (30 мл абсо­лютного спирта и 1 капля ле­дяной уксусной кислоты). На фоне голубых клеток видны ярко-красные включения, синие ядра и ядрышки клеток .

Окраска по Туревичу. Препарат фиксируют в метиловом спирте. Для проведения окраски необходимо иметь следующие реактивы: железный гематоксилин Вейгерта, 1%-ный водный раствор кислого фуксина, насыщенный раствор пикриновой ки­слоты, разведенный пополам 96° спиртом.

Для получения желез­ного гематоксилина Вейгерта готовят два состава: 1) 1%-ный рас­твор гематоксилина в 96° спирте. Раствор должен созревать в течение 2...3 недель;

2) 1,16 г хлористого железа, 98 мл дистил­лированной воды и 1 мл концентрированной соляной кислоты. Перед употреблением смешивают равные количества обоих раство­ров. Как только смесь приобретает фиолетовый оттенок, ее наносят на препарат и окрашивают 1...2 мин, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1%-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дис­тиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После про­мывки дифференцируют раствором пикриновой кислоты в течение 10 - 20 с до появления желтого от­тенка. Препарат быстро прополаски­вают в дистиллированной воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой, проводят через абсолютный спирт или ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные на серо-желтом фоне цитоплазмы.

Кроме указанных методов, для выявления включений мож­но использовать окрашивание по Романовскому-Гимзе. Включе­ния при этом приобретают темно-фиолетовый цвет, цитоплазма — голубой.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Приготовить препараты-отпечатки из вируссодержащего материала и окрасить их по Морозову.

2. Микроскопировать демонстрационные и само­стоятельно приготовленные препараты.

3. Зарисовать вирионы и внутриклеточ­ные включения Бабеша-Негри.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснение преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: а) приготовление пре­паратов-отпечатков и окраска их по Морозову; б) нахождение в приготовленных препаратах вирионов оспы и их схематическая зарисовка.

4. Подведение итогов занятия.

5. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Вначале дается характеристика методов лабораторной диаг­ностики вирусных инфекций, а затем более подробно рассматри­вают вирусоскопический метод исследования с использованием светового микроскопа. Препаратами с тельцами-включениями мо­гут служить гистологические срезы головного мозга животных, содержащие тельца Бабеша-Негри (окраска по любому методу).

Такие препараты можно получить в вирусологических отделах ветеринарных лабораторий.

Мазки для выявления вирусов оспы готовят непосредствен­но на занятиях из вирус-вакцин и окрашивают по Морозову.

Вопросы домашнего задания

1. Классификация вирусов.

2. Люминесцентная микроскопия и ее сущность.

3. Устройство люминесцентного микроскопа МЛ-2 и прави­ла работы с ним.

4. Использование метода флуорохромирования в вирусоло­гической практике.

жүктеу/скачать 0.73 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: