Тема 14. Использование в вирусологии реакции непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) находит все более широкое применение в вирусологических исследованиях. Сущность реакции в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител). Этот феномен положен в основу метода обнаружения и титрования антител. Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген – антитело и регистрируется визуально по характеру сформированного осадка (рис. 29).

Процесс приготовления сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарного диагностикума):

1) подготовка эритроцитов. Для этой цели наиболее широко применяют эритроциты барана и человека. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц – кур, индеек, уток; приготовленные на них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности. От соответствующего вида животного берут кровь общепринятым методом. Дефибринированную кровь трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия при центрифугировании;

2) фиксация эритроцитов. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для фиксации эритроцитов чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Методики фиксации эритроцитов различны. Одна из них: 50%-ную взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50%-ного формалина и после двухчасового контакта при 37 °С с периодическим встряхиванием эритроциты 3 раза отмывают 0,15 M/NaCl (pH 7,2);

3) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты малоизучен. Однако при этом достигается главное – танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью белков. Танизацию формалинизированных эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов 3%-ной взвеси эритроцитов и раствора танина (1:20000). После 10–15-минутного контакта при 37°С смесь центрифугируют, осадок трехкратно промывают фосфатным буфером (рН 7,2);

4) сенсибилизация эритроцитов. 10%-ную концентрацию эритроцитов на 0,15 М фосфатном буфере (рН 6,4) смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 мин при 37 °С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2–3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1%-ной концентрации в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содержащем 1% нормальной кроличьей сыворотки (для стабилизации эритроцитов). Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РИГА.

Необходимо отметить, что оптимальную сенсибилизирующую дозу антигена (для разных вирусов) подбирают эмпирически в пробных опытах сенсибилизации эритроцитов.

14.2 Главный опыт РНГА. Реакцию ставят в пробирках или в лунках плексигласовых панелей. В последнее время РНГА ставят микрометодом, используя аппарат Такачи (рис. 30), Титертек или автоматические пипетки (1-, 8-, 12-канальные) с изменяющимися объемами (рис. 31). Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают при 56 °С 30 мин.



Рисунок 30. Аппарат Такачи

Исследуемую сыворотку разводят двукратно в объеме 0,2 мл физиологическим раствором с рН 7,2–7,4, содержащим 1% нормальной сыворотки кролика, затем к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл сенсибилизированных антигеном эритроцитов.

Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет проводят через 2–3 ч по осаждению эритроцитов в контроле. Опыт сопровождают следующими контролями: 1) на спонтанную гемагглютинацию эритроцитарного антигена (сенсибилизированные эритроциты + физиологический раствор с 1 % кроличьей сыворотки); 2) на активность сенсибилизированных эритроцитов (сенсибилизированные эритроциты + положительная сыворотка); 3) на специфичность сенсибилизированных эритроцитов(сенсибилизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомологичная для данного антигена сыворотка); 4) на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов (исследуемые сыворотки + несенсибилизированные эритроциты).

Результаты реакции оценивают по четырехбалльной шкале: (+++) – агглютинированные эритроциты образуют перевернутый «зонтик» с неровными краями; (++) – по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов; (+) – по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов; (–) – эритроциты оседают на дно в виде диска или колечка – отрицательный результат.

При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются по дну пробирки или луночки в виде зонтика, а при отрицательной – оседают в виде компактного осадка или колечка в центре луночки. Достоверные результаты получают при отсутствии гемагглютинации: испытуемой сыворотки с несенсибилизированными эритроцитами, диагностикума с заведомо отрицательной сывороткой, при положительной реакции диагностикума с заведомо положительной сывороткой.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, которое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техники постановки и быстрота ответа (через 2– 3 ч). Однако есть и недостатки. Это трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т. д.).

Самостоятельная работа студентов: а) подготовить микропанели, петли и пипетки для РНГА; б) поставить РНГА с целью определения титра антител в сыворотке крови теленка к вирусу адено- или ИРТ; в) провести учет результатов реакции.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы

1. В чем отличие непрямой гемагглютинации от прямой?

2. В чем принцип РНГА?

3. Каково практическое использование РНГА?

Реакция диффузионной преципитации (РДП) в геле (синонимы: реакция гель-преципитации, реакция двойной диффузии в геле) основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов и отсутствии такой способности у комплекса антиген + антитело.

Диффузией называется проникновение молекул одного вещества между молекулами другого, обусловленное тепловыми движениями молекул. Диффузия возможна в газах, жидкостях, твердых телах и гелях. Гелями называются такие дисперсные системы, в которых жидкая фаза распределена равномерно среди твердой. Обычно гели образуются высокомолекулярными соединениями, которые дают коллоидные растворы (золи), а при охлаждении превращаются в гели, имеющие некоторые свойства твердых тел. К таким соединениям относятся крахмал, желатин, агар-агар и др. В лабораторной практике очень часто используют агаровый гель.

Антитела сыворотки представляют собой молекулы иммуноглобулинов, которые, несмотря на довольно крупные размеры, способны диффундировать в агаровом геле. Антигены вирусов – это вирусные белки. Они могут находиться в составе вирионов, представляя так называемые корпускулярные антигены, крупные размеры которых не позволяют им диффундировать в агаровом геле. Но белки вирусов могут быть и в виде свободных молекул, образующихся в результате деструкции вирионов и (или) разрушения клеток, в которых они образовались. Это так называемые растворимые антигены. Они способны к диффузии в агаровом геле.

Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки так, чтобы антиген и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими антиген и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу (двойная диффузия в геле). Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации, которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля (рис. 32). Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка будут негомологичны, полосы преципитации не образуется.

– обнаружение в сыворотке крови S антител, гомологичных данному антигену AS (например, вирусу), производится при помощи схемы РДП, показанной на рисунке 52. Если в сыворотке S содержатся антитела к антигену AS, между лунками S и AS образуется полоса преципитации, отсутствующая между лунками с контрольными компонентами SN и AS;

– обнаружение в материале антигена AS, гомологичного известным антителам сыворотки SS, производится по аналогичной схеме РДП (рис. 53). При наличии в исследуемом материале антигена, гомологичного антителам сыворотки SS, между А и SS должна образоваться полоса преципитации, отсутствующая между остальными лунками;

– идентификация неизвестного вируса может быть произведена в РДП по схеме, показанной на рисунке 33. Здесь AS – неизвестный антиген; SS .SS₆ – сыворотки, содержащие антитела к известным антигенам. Если полоса преципитации образовалась, например, между лунками с AS и SS₃, значит, исследуемый антиген гомологичен антителам сыворотки SS₃;

– титрование антител сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным антигеном (в нашем примере 1 : 16), служит показателем титра антител в сыворотке SS.

РДП может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах. Наиболее широкое применение в практике нашел метод постановки РДП на предметных стеклах. Для его осуществления необходимо иметь обезжиренные предметные стекла, градуированные пипетки на 2–5 мл и пастеровские пипетки; трубку диаметром около 5 мм с острыми краями или специальный штамп, влажную камеру, ученическое перо или другой инструмент, пригодный для извлечения агарового геля из лунки, 1,0–-1,5%-ный агар на физрастворе или фосфатном буфере с рН 7,2–7,4, антигены, сыворотки.

Специфические антигены и сыворотки должны быть в высоких титрах, обеспечивающих образование комплекса антиген + антитело в количестве, достаточном для образования четко видимой полосы преципитации.

15.3 Постановка РДП. Техника постановки состоит в следующем. Обезжиренные предметные стекла укладывают горизонтально на холодную поверхность (можно на стол). Пипеткой набирают 1,5– 2 мл агара, нагретого до 60 °С, и зигзагообразным движением выливают его сначала по периметру предметного стекла, а потом быстро заполняют его середину, следя за тем, чтобы не образовывались пузыри и волны. Стекла с налитым агаром, слой которого должен быть 1,5–2 мм, оставляют лежать 5–10 мин для'затвердения агара (превращения золя в гель). В слое застывшего агара вырезают лунки. Их количество и взаимное расположение определяются целью, с которой ставят РДП, но диаметр лунок должен быть около 5 мм, а расстояние между соседними лунками – 3–4 мм. Наиболее часто используют два типа расположения лунок.

Для вырезания лунок можно использовать готовый штамп, представляющий собой трубочки с острыми краями, жестко скрепленные в соответствии с типом расположения и количеством лунок. Если готового штампа нет, можно воспользоваться любой трубкой подходящего диаметра, например гильзой от патрона к мелкокалиберной (калибр 5,6) винтовке. В этом случае целесообразно нарисовать карандашом на бумаге количество и взаимное расположение лунок и, подложив этот трафарет под стекло с агаром, по нему вырезать лунки. Остающийся в лунках агар можно извлечь иглой, ученическим пером или пастеровской пипеткой. У образовавшихся лунок дном служит стекло, а стенками – слой агара. Чтобы избежать подтекания жидкостей под агар, рекомендуют лунки заплавить, с тем чтобы они были полностью в слое агара. Для этого можно воспользоваться разными приемами. Один из них состоит в том, что пастеровской пипеткой в лунку вносят горячий (50–60 °С) агар и тотчас отсасывают его обратно. Соприкасаясь на короткое время с холодным дном и стенками лунки, агар успевает частично застыть и покрыть тонким слоем дно и стенки лунки. Схематически это выглядит так, как показано на рисунке 34. Однако если стекла хорошо обезжирены и застывший слой агара прочно сцеплен со стеклом (не «плывет» при наклоне), то и без дополнительной заливки лунок полосы преципитации образуются нормально.

В подготовленные лунки заливают компоненты РДП (антигены и сыворотки). Нужно следить, чтобы компоненты ни в коем случае не переливались через край лунок, а только заполняли объем каждой. Для этого их лучше заливать мелкими каплями с помощью тонко оттянутых пастеровских пипеток.



Рисунок 34. Схема зливки агара

После заливки компонентов РДП предметные стекла помещают во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание агара. В качестве влажной камеры можно использовать любую закрывающуюся емкость (эксикатор, чашку Петри и т. п.), в которую положены намоченные водой вата или фильтровальная бумага. Влажную камеру оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (в термостате диффузия идет быстрее, но незначительно).

Предварительный учет результатов РДП производят через 8–10 ч, основной – через 24 и окончательный – через 48 ч.

Постановка РДП в чашках Петри по технике принципиально не отличается от постановки на предметных стеклах, только тогда слой агара наливают толщиной до 3 мм, лунки делают большего диаметра и на большем расстоянии. Но в этом случае время учета отодвигается до 5–7 дней.

Методика РДП в капиллярах не нашла широкого применения в практике, и на ней мы останавливаться не будем.

Препараты РДП на предметных стеклах можно через. 48–72 ч высушить и окрасить раствором амидного черного. Это позволяет сохранять препарат неопределенно долго и улучшает возможности фотографировать полосы преципитации.

Но все эти достоинства существенно умаляются ее основным недостатком – низкой чувствительностью. Тем не менее РДП достаточно широко пользуются в лабораторной диагностике вирусных болезней животных.

Определить наличие в сыворотке крови кролика антител к вирусу ньюкаслской болезни.

1. В чем принцип РДП?

2. Какие задачи позволяет решать РДП?

3. В чем достоинства и недостатки РДП?

В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.

Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ — одной оспины.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Таблица 6.

Виды единиц количества вирусов при определении по 50%-ному инфекционному действию

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД₅₀ принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

Иначе говоря:

1 ЛД₅₀—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД₅₀—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД₅₀—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД₅₀— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10^3,48 ЦПД₅₀/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10³'⁴⁸ доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10^3,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД₅₀, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅₀, на значительном отрезке приближается к прямой.

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅₀) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД₅₀. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.
Задания

1. Рассчитать титр вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия по предложенным фактическим данным.

2. Определить титр вируса ньюкаслской болезни в аллантоисной жидкости в единицах гемагглютинирующего действия.

Самостоятельная работа студентов: а) подготовка панелей, пипеток и материала; б) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл; в) добавление 1%-ной суспензии эритроцитов; г) учет результатов и их интерпретация. Во время экспозиции переписывание в тетрадь (с доски или таблицы) схемы титрования антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы

1. Что такое титр вируса?

2. Каковы единицы измерения количества вируса?

3. Каков принцип определения титра вируса в БОЕ и ООЕ?

4. В чем принцип определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия?

5. Какова методика расчета титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия?

6. В чем принцип определения титра вируса в ГАЕ?

7. Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?

а) основная литература

1. 
   Ветеринарная вирусология : учебник для вузов / Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская, И. В. Третьякова ; под ред. Р. В. Белоусовой. - М. : КолосС , 2007. - 424 с.
   
2. 
   Ветеринарная вирусология : [учебник для вузов] / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : КолосС, 2006. - 304 с.,
   
3. 
   Ветеринарная вирусология / В. А Сергеев [и др.].– М., 2002. – 217 с.
   
4. 
   В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина Ветеринарная вирусология.-Изд.2-е. – М.: Агропромиздат, 1991
   
5. 
   Практикум по ветеринарной вирусологии : учеб. пособие для вузов / Н. И. Троценко, Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская . - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Колос, 2006. - 273 с.
   

1. 
   Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства : монография / А. П. Пономарев, В. Л. Узюмов, К. Н. Груздев. - Владимир : Фолиант, 2006. - 250 с
   
2. 
   Вирусные болезни собак / А. А. Сулимов, В. И. Уласов. - М. : КолосС, 2006. - 110 с.
   
3. 
   В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В.Фомина Вирусные болезни животных. – М.: ВНИТИБП, 1998.
   
4. 
   Электронная микроскопия вирусов животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов : монография / А. П. Пономарев, В. А. Мищенко. - Владимир : Фолиант, 2005. - 160 с.
   
5. 
   Журнал «Ветеринария». – М.: КолосС, 2004 - 2010.
   
6. 
   Аграрная наука. – М. «Аграрная наука», 2005-2010
   
7. 
   Журнал Аграрная наука Евро-Северо-Востока. – Новосибирск, С-В НМЦ Россельхозакадемии, 2005-2010
   
8. 
   Журнал Вестник ветеринарии (Vestnik veterinarii). – Ставрополь, «Энтропос». 205-2010
   
9. 
   Журнал Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. – Улан-Удэ. Изд-во «Вестника БГСХА им В.Р. Филиппова». 2006-2010
   
10. 
    Журнал Вестник Алтайского государственного аграрного университета. – Барнаул. Изд-во “Вестника Алтайского государственного аграрного университета”. 2007-2010
    
11. 
    Журнал Вестник Воронежского государственного аграрного университета. – Воронеж, Изд-во Воронежского ГАУ. 2009-2010
    
12. 
    Журнал Вестник ИрГСХА. – Иркутск. Изд-во ФГОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия». 2006-2010
    
13. 
    Журнал Вестник КрасГАУ. – Красноярск. Изд-во ФГОУ ВПО «КрасГАУ». 2005-2010
    
14. 
    Журнал Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. – изд-во ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова». 2009-2010
    
15. 
    Журнал Вестник ОрелГАУ. – Изд-во ФГОУ ВПО Орёл ГАУ. 2007-2010
    
16. 
    Журнал Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – Изд-во ФГОУ ВПО СГАУ им. Н.И. Вавилова. 2002-2010
    
17. 
    Журнал Ветеринарная медицина. – М. ООО «Агровет». 2005-2010
    
18. 
    Журнал Ветеринарная практика. – СПб. 2008-2010
    
19. 
    Журнал Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – СПб. Изд-во . – СПбГАВМ. 2008-2010.