Тема 5. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях

Волосы удаляют сульфгидратом кальция, сульфитом стронция или специаль­ным средством по прописи Barium sulforatum – 25,0, Zincum oxydaturn – 12,5, Amylum – 12,5 Депиляторное средство перемешивают с водой до образования кашицы, которую наносят деревянной лопаточкой на нужное место, оставляют на несколько минут и затем тщательно смывают. После этого кожу смазывают вазелином.

Для наркоза мышей, хомяков, хорьков, кроликов и морских свинок исполь­зуют эфир и хлороформ, для крыс и собак – эфир, для кур предпочитают при­менять хлороформ

Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Под тропизмом вируса понимают способность его репродуцироваться в определенных типах клеток организма. Вирусы, репродуцирующиеся в нервных клетках, называются нейротропными (например, вирус бешенства), репродуцирующиеся в клетках кожи – дермотропными (например, вирус оспы), в клетках легких – пневмотропными (вирус гриппа). Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются политропными (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток – пантропными (вирус чумы собак).

Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус оспы – внутрикожно, вирус бешенства – интрацеребрально. Пантропные вирусы лучше разносятся по организму при введении их внутривенно или внутрибрюшинно. Если же исследователь не имеет данных о тропизме находящегося в материале вируса, то заражают животных нескольких групп разными методами.

5.2 Способы фиксации и техника заражения лабораторных животных. Способы фиксации и техника заражения тем или другим методом также различны для животных разных видов. Кроликов удерживают за кожу спины ближе к лопаткам, а другой рукой придерживают за заднюю часть тела. Такая фиксация предотвращает получение царапин. Морских свинок держат одной рукой за грудь, а другой – за задние лапы. Крыс и мышей берут за хвост, дают им возможность уцепиться передними конечностями за металлическую сетку (например, клетки), захватывают двумя пальцами левой руки кожу на затылке и слегка растягивают животное. При этом крыс прочнее и безопаснее фиксировать корнцангами, а для большей надежности голову животного можно удерживать двумя корнцангами за щечные кожные складки. Оба этих корнцанга помощник держит в левой руке, а корнцанг, фиксирующий хвост, – в правой.

Белых мышей без помощника фиксируют, захватывая складку кожи между ушами пинцетом Пеано, который, в свою очередь, укрепляют, набрасывая его кольца на держатели штатива Бунзена или, что еще проще, на стоящую в обычном штативе пробирку. Возможна фиксация мышей и одной рукой.

Перед заражением место введения материала тщательно обрабатывают 3%-ным спиртовым раствором йода.

Смонтировав шприц и укрепив на нем инъекционную иглу, набирают вируссодержащий материал так, чтобы во флакон или пробирку была введена только игла, но не цилиндр шприца.

От попавшего с набираемым в шприц материалом воздуха освобождаются, повернув шприц вертикально вверх иглой, которая предварительно воткнута в толщу стерильного комочка ваты, упакованного в сложенный по типу конверта небольшой лист пергаментной бумаги. Иглу вкалывают в толщу ватика через складки бумаги, где ее не касались руками. Ватики предотвращают потерю капель вируссодержащего материала из шприца, т. е. распространение вируса в окружающей среде. Кроме того, игла, находясь в ватике, до момента инъекции остается стерильной.

Заражение через пищеварительный тракт представляет значительный интерес для выяснения патогенеза болезней, передающихся алиментарным путем (ки­шечные вирусные инфекции).

В зависимости от поставленной задачи животных заражают per os, в желудок и ректально.

Мелким лабораторным животным внутрикожно вводят материал в плантарную поверхность задней конечности, которую фиксируют, отводя ее назад и помещая на указательный палец левой руки. Правой рукой иглу со шприцем вводят в кожу в направлении от пальцев к голеностопному суставу.

Для размножения в организме дермотропных вирусов (например, возбудителей оспы) содержащий их материал втирают в скарифицированную кожу. На коже, подготовленной как и для внутрикожного заражения, делают несколько поверхностных царапин иглой или обломленной пастеровской пипеткой до появления капелек лимфы. Затем наносят материал и втирают его шпателем, стеклянной палочкой или остриженной зубной щеткой. Заражение в скарифицированную кожу у крупных животных проводят на боку или животе, у морской свинки – на плантарной поверхности ступни, у мелких животных – в области спины, у петухов – в гребень и сережки, а также в перьевые фолликулы голени сразу же после удаления перьев.

Внутримышечное заражение. Для этого способа заражения чаще всего выбирают мышцы бедра, а у кур – большую мышцу груди. Иглу после дезинфекции места инъекции вводят через кожу и подкожную клетчатку в мышцы, направляя перпендикулярно к поверхности тела. После инъекции материала иглу извлекают, место введения повторно дезинфицируют.

Внутрибрюшинное заражение. Животное при данном способе заражения фиксируют вертикально вниз головой для того, чтобы органы брюшной полости сместились к диафрагме и при введении материала игла не травмировала кишечник (рис. 9). В области паха, а у кур на середине расстояния между верхушкой грудной кости и клоаки короткую иглу вводят сквозь кожу и брюшинную стенку, направляя под углом 45° к продольной оси тела. При этом левой рукой слегка оттягивают лапу животного, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по исчезнувшему сопротивлению брюшной стенки.

Внутривенное заражение. Важно контролировать, чтобы в вену из шприца не попали пузырьки воздуха или частицы материала, которые могут вызвать эмболию и гибель животного.



Рисунок 9 Внутрибрюшинное заражение мыши



Рисунок 10. Внутривенное заражение мыши

Белых мышей и крыс заражают в боковые вены хвоста, предварительно расширив их, растирая тампоном, смоченным ксилолом или горячей водой. Помощник левой рукой сдавливает хвост у корня, а правой фиксирует животное за кожу затылка (рис.10). Иглу скосом наружу вводят под острым углом в вену нижней трети хвоста, где кожа тоньше, и направляют к корню хвоста. Если игла попала в сосуд, то жидкость легко поступает из шприца, а сосуд на всем протяжении бледнеет.

Освободив вену у корня хвоста, медленно вводят материал. Затем вену передавливают ниже места вкола, иглу извлекают и место инъекции прижимают сухой ватой.

Кроликам же вируссодержащую суспензию можно закапывать в ноздри по каплям при запрокинутой на спину голове без наркоза.

Объем заражающей дозы материала значительно варьирует в зависимости от метода внесения и вида животных (табл. 4).

Таблица 4

Максимальные объемы вводимого материала для лабораторных

За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием корма и т. п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала.

1. Отработка приемов фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.

2. Заражение внутрикожно белых мышей вирусом эктромелии и кроликов вирусом осповакцины.

Самостоятельная работа студентов

Студенты отрабатывают приемы фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.

1. С какой целью используют лабораторных животных в вирусологических исследованиях.

2. Требования, предъявляемые к лабораторным животным, уход, содержание.

3. Животные - гнотобиоты. СПФ - животные .

4. Методы заражения лабораторных животных.
Тема 6. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Вскрытие лабораторных животных
Цель занятия: Установление у зараженных животных симптомов болезни. Вскрытие зараженных животных с целью обнаружения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала. Получение отпечатков мозга.

Оборудование и материалы: суспензии вирусов эктромелии и осповакцины; кролики; белые мыши; клетки для животных; кюветы с восковым дном; стерилизаторы со стерильными инструментами (шприцами, инъекционными иглами, пинцетами анатомическими 14 и 10 см, ножницами глазными); вата; спирт; эфир для наркоза; банка вместимостью 0,5 л с крышкой; стерилизованные ватные тампоны в бумажной упаковке (ватики); стерильный физиологический раствор; фильтровальная бумага; стекла предметные; раствор пикриновой кислоты, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя:

6.1 Признаки размножения вируса в организме лабораторного животного. В последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. В случае размножения вируса в чувствительных к нему клетках организма последние повреждаются или гибнут. При значительном количестве поврежденных вирусом клеток нарушается функционирование части или всего органа. Это проявляется соответствующими изменениями в состоянии и поведении животного. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга – судороги, парезы, параличи и т. д.

Видимые изменения в состоянии и функционировании организма называют клиническими признаками болезни, а появление их после экспериментального заражения считают косвенным доказательством размножения вируса. При этом учитывают не только сам факт и характер появившихся изменений, но и продолжительность инкубационного периода, которая характерна для определенной болезни. Инкубационный период зависит не только от свойств возбудителя, но и от дозы вируса, пути его проникновения в организм и состояния самого организма.

Клинические признаки, появившиеся у лабораторных животных, зараженных с целью биопробы (обнаружения вируса), указывают на то, что в исследуемом патматериале содержался вирус. Эти признаки большей частью носят неспецифический характер (например, угнетение, снижение аппетита, одышка и т. п.), и на этом этапе исследований еще нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо идентифицировать обнаруженный вирус с помощью серологических реакций. При этом неизвестным антигеном является выделенный вирус, содержащийся в материале, полученном при вскрытии использованного для биопробы животного. Нередко заболевание заканчивается гибелью, что также бывает через определенное время после заражения и служит одним из признаков размножения вируса в организме. На размножение вируса в организме указывают не только клинические признаки и гибель животного, но и видимые изменения самих органов и тканей, которые, как говорилось выше, возникают в связи с гибелью зараженных вирусом клеток. Патологоанатомические признаки выражаются изменением цвета, размера, формы и консистенции органов, а также в появлении образований, в норме не встречающихся.

Итак, три признака указывают на наличие вируса в материале, которым заражали лабораторных животных: симптомы болезни, патологоанатомические изменения и гибель. Однако не всегда названные признаки сопровождают размножение вируса в организме. Например, вирус, содержащийся в патологическом материале, полученном от лошади, не может легко и с клиническими проявлениями размножаться в организме белых мышей. В первом пассаже лишь единичные вирусные частицы найдут для себя чувствительные клетки, но их будет так мало относительно целого органа, что видимых изменений организма не возникнет. Такой пассаж получил название «слепого».

Зараженное, но не проявившее признаков болезни животное убивают через интервал времени, равный двум инкубационным периодам, и берут при вскрытии патологический материал, предположительно содержащий размножившийся и накопившийся вирус.

Суспензией из материала от первого пассажа заражают других животных того же вида. При этом в организм попадает большее, чем в первом пассаже, количество вирусных частиц, способных размножаться в таких условиях. Однако при втором пассаже вирус может также не накопиться до уровня инфекционной дозы и не вызвать видимых изменений. Тогда и второй пассаж окажется «слепым».

По тому же принципу делают третий пассаж и в случае появления признаков заболевания приходят к заключению о присутствии вируса в исследуемом материале. Полученный от реагировавшего животного вируссодержащий материал считают выделенным вирусом.

При биопробе с целью обнаружения вируса на других лабораторных живых системах поступают по тому же принципу.

Вирусы же, для обнаружения и выделения которых используют естественно восприимчивых животных, не нуждаются в предварительной адаптации и проявляют себя в биопробе определенными признаками уже на первом пассаже.

6.2 Взятие материала от лабораторных животных. Способ взятия крови опреде­ляется требуемым количеством ее. Большое количество получают путем пунк­ции сердца или из наружной яремной, бедренной, подкрыльцовой вен. Неболь­шое количество крови берут из ушной и хвостовой вен, из гребня и ретробульбарного венозного сплетения.

Пункцию сердца делают у мышей, крыс, хомяков, кроликов, морских сви­нок, собак и кур. При этом методе бывают смертельные случаи, особенно у мышей, крыс, хомяков и морских свинок.

Из наружной яремной вены кровь берут у хомяков, морских свинок, хорьков, кроликов, собак и кур в тех случаях, когда не удается взять кровь путем пункции сердца. Вена должна быть обнажена, животные (кроме кур) находятся под нар­козом. Из бедренной вены кровь берут у мышей, крыс, хомяков. Для этого животное фиксируют в положении на спине под наркозом. После подготовки операцион­ного поля разрезают кожу на внутренней стороне бедра и обнажают сосуд. У мелких лабораторных животных пункция этого сосуда невозможна, поэтому вену надрезают и кровь собирают в кожном кармане. После тампонады рану закрыва­ют. У собак кровь берут из v. saphena parva после фиксации животного в положе­нии на боку. Сдавливают бедро. Пункцию по возможности следует делать дистально в нижней трети голени на латеральной стороне.

У кур кровь берут из подкрыльцовой вены (v. cutanea ulnaris). С этой целью фиксируют птицу на спине, распрямляют крыло и сдавливают вену. Обрабатывают кожу спиртом. Так как ввести иглу в вену трудно, прокалы­вают ее скальпелем и собирают появившуюся кровь. Из гребня кровь берут, прокалывая его или отрезав зубец. Чтобы предупредить кровотечение, рану пос­ле взятия крови следует прижечь или обработать хлоридом железа.

У кроликов кровь получают из ушной вены после сдавливания у основания уха. У мышей, крыс и хомяков кровь обычно берут из хвостовой вены. Опера­цию выполняют под наркозом. Обрабатывают хвост спиртом, ксилолом или по­гружают его в теплую воду (45 °С) на 1 мин и удаляют кончик хвоста ножница­ми. У мышей, крыс и хомяков можно взять кровь (под наркозом) ретробульбарного сплетения. Животных фиксируют между большим и указательным пальца­ми. Надавливая на шею, задерживают кровообращение в сосудах головы, о чем свидетельствует выпячивание глаз. В медиальный угол глаза вводят капилляр­ную пипетку и направляют ее в сторону гортани. При повреждении венозного сплетения кровь попадает в пипетку. После взятия крови животным подкожно вводят стерильный физиологический раствор: кроликам – 20 мл, морским свин­кам – 10, мышам – 1–2 мл.

Для получения сыворотки кровь около 1 ч выдерживают в теплом месте (30 – 37 °С), сгусток обводят металлической или стеклянной палочкой и ставят на ночь в холодильник. Сыворотку отсасывают пипеткой в стерильный сосуд, филь­труют или добавляют антибиотики (по 100–200 ЕД пенициллина и стрептоми­цина на 1 мл) и консервируют (мертиолат натрия, тимол, азид натрия и др.). Хранят сыворотку на холоде, лучше при замораживании (минус 10 – 20 °С).

По методу Ванцетти и Каудиана к 6 мл крови в градуированной пробирке добавляют 1,5 мл 3%-ной суспензии гуммиарабика и 1,5 мл 3%-ного цитрата натрия нейтральной реакции. Смесь взбалтывают и оставляют на 30 – 40 мин для осаждения эритроцитов. Снимают поверхностный слой и центрифугируют при 1000 об/мин 3 мин. Осадок суспендируют в физиологическом растворе.

Операцию по обескровливанию животных выполняют под наркозом. Мы­шей, хомяков и крыс обескровливают путем вскрытия шейных сосудов и соби­рают вытекающую из раны кровь. Морских свинок, собак, кроликов фиксируют на спине и после соответствующей подготовки обнажают сонную артерию, на­кладывают две лигатуры и между ними рассекают. Конец сосуда, идущий к сер­дцу, обнажают и, направив его в стерильную посуду, снимают лигатуру. Можно использовать также иглу для пункции.

6.3 Вскрытие лабораторных животных. После окончания опыта оставшихся в живых лабораторных животных умерщ­вляют. Мышей, крыс, хомяков и кроликов помещают под стеклянный колпак, в который кладут ватный тампон, смоченный эфиром или хлороформом, – жи­вотное умирает. Собаке внутривенно вводят хлоралгидрат в дозе не менее 0,5 г на 1 кг массы. Можно также инъецировать 20–40 мл насыщенного раствора сульфата магния. Курам отрезают голову или оглушают ударом по голове и пере­резают шейные сосуды. Убить животное можно избыточной дозой наркоза, а также (мелких животных) путем разрыва спинного мозга. Для этого тело животного, удерживая правой рукой за затылок, а левой за хвост, быстрым коротким движением растягивают до ощущения обрыва нити. Менее гуманный метод умерщвления – декапитация (отрезание головы).

Для изучения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала экспериментально зараженных животных вскрывают. Делают это сразу же после гибели их, что предотвращает обсеменение органов и тканей микрофлорой, находящейся при жизни животного на поверхности слизистых оболочек, особенно в кишечнике. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального проявления симптомов болезни или при их отсутствии на 8–10-й день после заражения.

Для удобства вскрытия труп животного фиксируют. Более крупных животных укрепляют на специальных вскрывочных столиках или на доске с приспособлением для фиксации конечностей и головы. Мелких животных целесообразно фиксировать в кювете с залитым воском (парафином) и покрытым бумажной салфеткой дном. Для фиксации используют инъекционные иглы или одностержневые булавки (портновские). Вскрытие выполняют стерильными инструментами.

Брюшную и грудную полости вскрывают при фиксации животного в спинном положении с направленными в стороны и укрепленными передними и задними конечностями (рис. 12).

Шерсть животного по линии разреза обрабатывают дезинфицирующим раствором. Мелких животных перед вскрытием можно опускать полностью в дезинфицирующий раствор, держа за хвост.

Разрез кожи делают по белой линии от лонной кости (симфиза) до шеи. Чтобы при этом не прорезать брюшную стенку, пинцетом, находящимся в левой руке, приподнимают кожу и делают сначала поперечный надрез складки кожи, удерживаемой пинцетом у симфиза, а затем, вставив одну браншу ножниц в образовавшееся отверстие, разрезают кожу до шеи животного, после чего кожу разрезают по направлению к каждой из четырех конечностей. Тупым путем кожу отпрепаровывают, открывая ее лоскуты вправо и влево наподобие дверок шкафа. Лоскуты кожи фиксируют булавками за верхние и нижние углы.

Заменив инструменты, вскрывают брюшную полость. Для этого разрез брюшной стенки делают под линией диафрагмы и по белой линии до лонной кости. Треугольники брюшной стенки отводят в стороны и фиксируют.

В качестве вируссодержащего материала из брюшной полости берут кусочки (или целый орган у мелких животных) печени, селезенки, почки, брыжеечные лимфатические узлы, участок кишечника при наличии патологоанатомических изменений или симптомов болезни, наблюдавшихся перед смертью.

Грудную полость вскрывают с учетом того, что она имеет твердые стенки. Для получения доступа к находящимся в ней органам с нее надо как бы снять «крышку». Для этого разрезают ребра поперек сзади вперед, удаляя их вместе с грудной костью.

Череп вскрывают, укрепив животное в брюшном положении путем фиксации передних конечностей и головы (рис. 13). Кожу головы и шеи обрабатывают дезинфицирующим раствором.



Рисунок 13. Порядок вскрытия черепной полости

Разрез кожи делают перпендикулярно оси тела за ушами, продолжают слева и справа вперед к глазницам. Кожу вместе с ушами отпрепаровывают и отбрасывают вперед, оголяя черепную коробку. Одну браншу ножниц вставляют в большое черепное отверстие и режут кости черепа влево и вправо по направлению к глазницам. Затем разрезают кости черепа между глазницами и удаляют весь вырезанный участок. Если кости черепа толстые, их распиливают по тем же направлениям. Можно разрезы черепа вести от глазниц назад.

Мозг животных, имеющий мажущуюся мягкую консистенцию, извлекают из основания черепа, подняв его слегка раздвинутыми браншами ножниц и подрезав черепно-мозговые нервы.

Основное требование к вируссодержащему материалу–максимальное содержание в нем вируса, что определяется тропизмом вируса, т.е. способностью его размножаться в определенном типе клеток, а следовательно, и в соответствующих органах животного. Поэтому, вскрывая животное, обращают внимание на то, какие органы имеют патологоанатомические изменения, т.е. предположительно содержат вирус. Измененные органы берут в качестве вируссодержащего материала. Одновременно с той же целью берут регионарные пораженному органу лимфатические узлы.

При заражении животных пневмотропными вирусами в качестве вируссодержащего материала берут легкие, средостенные лимфатические узлы, трахею. Висцеротропные вирусы содержатся в паренхиматозных органах брюшной полости (в печени, селезенке), брыжеечных лимфатических узлах и стенке кишечника. Для исследований нейротропных вирусов берут головной, а если надо, то и спинной мозг.

Каждую пробу материала, разделив на две части, помещают отдельно в две стерильные пробирки, закрытые резиновыми пробками. Ткань одной пробирки предназначается для вирусологических исследований, поэтому ее сразу же заливают соответствующим фиксатором. В тех случаях, когда в комплексе диагностических исследований на определенную инфекцию предполагаются микроскопические методы обнаружения вируса (световая, люминесцентная микроскопия), из вируссодержащих органов делают мазки или отпечатки. Учитывая, что специфические для вируса изменения могут быть локализованы в различных отделах органа (например, в мозге при бешенстве), отпечатки готовят следующим образом: мозг мелкого животного из вскрытой черепной полости, не повреждая структуры, переносят на лист (10x10 см) фильтровальной бумаги, где он достаточно прочно фиксируется. Браншами глазных ножниц отрезают по вертикальной плоскости небольшой кусочек его и кладут на бумагу рядом. Затем отрезают следующий слой мозга и также кладут рядом и т. д. Взяв в левую руку лист бумаги с фиксированными на нем кусочками мозга, правой рукой прикладывают сверху к каждому поочередно предметное обезжиренное стекло, получая отпечатки.

1.Установление у зараженных животных симптомов болезни.

2.Вскрытие зараженных животных с целью обнаружения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала.

3. Получение отпечатков головного мозга.

Студенты отрабатывают приемы вскрытия трупов лабораторных животных и получения отпечатков головного мозга.

1. Признаки размножения вируса в организме лабораторного животного.

2. Методы взятия материала от лабораторных животных.

3. Порядок вскрытия лабораторных животных по Вагнеру.

4. Порядок получения отпечатков головного мозга.