Фагоциторная концепция И.И. Мечникова

Для решения вопроса, могут ли подвижные клетки защищать сложные многоклеточные организмы от различных вредных воздействий, он поставил следующий опыт: ввел в прозрачное тело личинки морской звезды шип розы и проследил, будет ли шип окружен подвижными клетками и сколь скоро они способны противодействовать вредным влияниям внешней среды. Шип розы, погруженный в тело морской звезды, вскоре оказался облепленным подвижными клетками, стремящимися преодолеть его вредное воздействие на тело морской звезды. Продолжая наблюдения, И.И. Мечников сделал вывод, что в многоклеточных организмах подвижные клетки сложных организмов поглощают и переваривают вредные для организма частицы и вещества, которые получили название фагоцитов, или «клеток-пожирателей».

Обращаясь впоследствии к вопросам патологии человека, И.И. Мечников убедился в том, что заноза, введенная под кожу, вызывает воспалительную реакцию, а нередко и нагноение, причем к очагу воспаления устремляется огромное количество подвижных клеток, преимущественно лейкоцитов. И поскольку воспаление связано с проникновением в организм патогенных микробов, а сама воспалительная реакция протекает при непременном участии лейкоцитов и других подвижных клеток, из этого следует вывод, что воспаление это своего рода защитная фагоцитарная реакция организма.

Фагоцитарные клетки выполняют роль защитников организма от патогенных микробов, благодаря чему воспаление носит характер защитной реакции. Эти данные, полученные И.И. Мечниковым, имели огромное значение для общей патологии. Течение инфекционной болезни, ее исход зависят от того, насколько энергично и успешно фагоциты преодолевают деятельность патогенных микробов, проникших в организм. С помощью многочисленных, тщательно продуманных экспериментов И. И. Мечников обосновал положение, что степенью фагоцитарной активности лейкоцитов и неподвижных клеток организма, находящихся в костном мозгу, печени, селезенке и в соединительной ткани, определяется состояние невосприимчивости (иммунитет) организма к инфекциям.

Первые основы фагоцитарной теории иммунитета были представлены И.И. Мечниковым в его докладе «О целебных силах организма», с которым он выступил на съезде русских врачей и естествоиспытателей, состоявшемся в 1883 году в Одессе. Мечников провел огромное количество экспериментов, чтобы выяснить роль фагоцитов в борьбе организма с инфекцией. Он установил, что фагоцитарной активностью у высших позвоночных животных обладают не только микрофаги, то есть подвижные белые кровяные клетки (лейкоциты), но и макрофаги — большие неподвижные клетки, фиксированные в костном мозгу, печени, селезенке и в соединительной ткани (рис. 4.2.16).

Факты, характеризующие защитную природу воспаления и роль фагоцитоза в процессах невосприимчивости организма к инфекциям, были описаны И.И. Мечниковым во множестве научных работ, важнейшие из которых «Лекции о сравнительной патологии воспаления» (1892) и «Невосприимчивость к инфекционным болезням» (1901).

На протяжении многих лет И.И. Мечников и его многочисленные ученики вели (А.М. Безредка, Я.Ю. Бардах, В.К. Высокович, Л.А. Тарасевич, Г.Н. Габричевский, Н.Я. Чистович, Д.К. Заболотный и др.) вели борьбу в защиту теории фагоцитоза. Ими было показано, что каждый из известных в то время видов иммунитета – бактерицидный, антитоксинный, бактериолитический – носят лишь частный характер, а защитное действие фагоцитов имеет универсальное значение для борьбы организма с большинством инфекционных заболеваний.

Вклад И. И. Мечникова в науку был оценен его современниками. В 1909 г. за исследования по фагоцитозу И. И. Мечникову была присуждена Нобелевская премия.
4.2.7. Развитие гуморальной теории иммунитета
Одновременно с фагоцитарной теорией иммунитета значительной поддержкой пользовалась гуморальная теория иммунитета, сущность которой сводилась к признанию защитного действия бактерицидных веществ плазмы крови и лимфы. Разновидностями гуморальной теории иммунитета являются теории бактерицидного, антитоксинного и бактериолитического иммунитета. Гуморальная теория иммунитета долгое время находилась в противоречии с целлюлярной теорией Мечникова.

Бактерицидные свойства сыворотки крови особенно подробно изучал немецкий микробиолог и гигиенист Г. Бухнер (Hans Buchner, 1850–1902), который утверждал, что нет различия в бактерицидной активности сыворотки и свежей крови. Вещество, за счет которого создается бактерицидность сыворотки, он назвал алексином.

В последующем это направление активно развивалось в трудах сотрудников Р.Коха – А. Френкеля, Э. Беринга, Ш. Китазато, показавших, что сыворотка крови иммунизированных животных обладает свойствами предохранять их от токсического действия некоторых патогенных микробов, т.е. обладает антитоксическими свойствами. Активное использование крови против микроорганизмов началось после опубликования работ двух ассистентов Коха — немецких бактериологов Эмиля Адольфа фон Беринга (Emil Adolf von Behring, 1854 — 1917) и Пауля Эрлиха (Paul Ehrlich, 1854-1915). Фон Беринг обнаружил, что можно делать инъекции животным определенной бактерией, заставив организм вырабатывать против нее антитела, которые будут концентрироваться в жидкой составляющей крови (кровяной сыворотке). Если сыворотку затем взять от подопытного животного, то можно сделать «прививку» другому животному, у которого появится иммунитет к данной болезни. В 1890 г. Э. Беринг продемонстрировал разрушение патогенных бактерий в изолированных кровеносных сосудах, лишенных крови, но заполненных плазмой.

Фон Берингу также пришла идея попытаться делать прививку сывороткой детям, больным дифтерией — смертельной болезнью, свирепствовавшей в те годы. Давно было установлено на практике, что если ребенок выживал в борьбе с заболеванием, то он получал на всю жизнь иммунитет. Но зачем было подвергать детей риску и выжидать, когда организм сам выработает антитела? Почему не взять антитела, выработанные организмом животного, и не сделать инъекцию этой сывороткой ребенку? Такие прививки хорошо себя зарекомендовали во время эпидемии дифтерии 1892 г.

Эрлих, работая вместе с фон Берингом, выработал точные дозы и методику прививки. После успешного дуэта между ними произошла размолвка, и впоследствии Эрлих работал один, продолжая активно развивать теорию антитоксинной природы иммунитета. Именно его можно назвать основателем серологии — науки о методике применения сыворотки крови.

В 1895 г. немецкий бактериолог Р. Пфейффер (Richard Pfeiffer, 1858-1945) совместно с русским врачом В.И. Исаевым (1854-1911) показали, что свежая культура холерного вибриона, введенная в брюшную полость иммунизированного животного, растворяется в ней. Это явление, получившее название «феномен Исаева–Пфейффера», оказалось сугубо специфичным по отношению к различным видам возбудителей и составило сущность бактериолитического иммунитета.

Теперь эта победа могла быть утверждена не только через атаку против болезни, но против микроорганизмов, которые вызывали заболевания. Пастер доказал наличие иммунитета на примере вакцинации скота против сибирской язвы — смертельной болезни, уносившей ежегодно большое поголовье. Пастер выявил возбудителя сибирской язвы (рис. 4.2.20). Он достаточно долго нагревал штамм этой бактерии, чтобы убить ее способность заражать. Такие неопасные, уже «мертвые» вакцины просто самим фактом присутствия в организме побудят его вырабатывать антитела, которые могут быть использованы против активных и смертельно опасных бактерий.

В дальнейшем оказалось, что борьба с бактериальными заболеваниями во многом проще, чем с вирусными. Во-первых, бактерии проще размножаются в культуре, они более уязвимы. Живя вне клетки, они производят ущерб организму, отнимая у него питание либо высвобождая токсины. Однако их метаболизм (химический механизм) отличается от метаболизма клеток хозяина в нескольких аспектах. Поэтому всегда есть шанс, что они будут уязвимы к фармацевтическим средствам, разрушающим их метаболизм без серьезного повреждения клеток хозяина.

Начало использования химических средств против заболевания относится к далеким временам в истории человечества. С давних времен были известны лекари-травники. Их искусство передавалось из поколения в поколение. Использование хинина против малярии — самый известный пример «народного средства», которое со временем было принято на вооружение официальной медициной. С приходом синтетических химических средств возможность их использования расширилась: теперь против каждой болезни можно было использовать свое лекарство.

Например, немецкий бактериолог Пауль Эрлих (рис. 4.2.21) работал в свое время над красками, окрашивающими бактерии, и, поскольку эти краски смешивались с некоторыми компонентами бактериальной клетки, они повреждали рабочий механизм клетки. Эрлих, понимая это, надеялся выявить краситель, достаточно сильно повреждающий клетки бактерий. И он его открыл: это был трипановый красный, уничтожающий трипаносом (простейших, вызывавших многие болезни, в том числе сонную болезнь).

Рис. 4.2.21. Пауль Эрлих (Paul Ehrlich,1854-1915).

Эрлих продолжал свой исследования, предположив, что способность повреждать клетки возбудителя связана с атомом азота в составе молекулы химиката. По химическим свойствам атомы мышьяка схожи с атомами азота, однако дают более сильный токсический эффект. Он экспериментировал с мышьяксодержащими органическими веществами, опробуя их один за другим. В 1909 г. один из его помощников обнаружил, что вещество с номером 606 очень эффективно против сифилиса. Это вещество было названо сальварсаном (в наши дни чаще именуется арсфенамином) (рис. 4.2.22 - 4.2.23).

Рис. 4.2.22. Химическая структура сальварсана (по П. Эрлиху)

Рис. 4.2.23. Реальная структура сальварсана. В 1949 г. советский химик М. Крафт показал, что арсеносоединения не содержат и не могут содержать связи As=As. Он установил, что сальварсан представляет собой смесь полимергомологичных соединений.

Трипановый красный и сальварсан положили начало химиотерапии (излечению при помощи химических средств). Были надежды, что вскоре после этого будут обнаружены аналогичные средства практически против всех болезней. К сожалению, по прошествии нескольких десятилетий список применяемых в химиотерапии средств не пополнился.

Лишь в 1932 г. немецкий врач и биохимик Герхард Домагк (Gerkhard Domagk, 1895—1964), работая над красителями, обнаружил, что инъекции красителя с коммерческим названием пронтозил убивают стрептококки. Он попытался поставить опыт с использованием пронтозила для людей. Его собственная дочь вскоре заразилась стрептококком после неудачной инъекции. Не помогало ничего, пока Домагк в отчаянии не опробовал свое средство на ребенке. Дочь быстро выздоровела. К 1935 г. мир узнал о новом лекарстве.

Вскоре группа французских бактериологов обнаружила, что действующее вещество в пронтозиле — сульфаниламид. Лекарство было названо чудом. Оно побеждало ряд смертельно опасных заболеваний, в частности пневмонию.

4.2.9. Открытие антибиотиков
Наибольший успех ждал химиотерапию не в отношении синтетических веществ вроде арсфенамина и сульфаниламида, но в отношении натуральных продуктов. Американский микробиолог Рене-Жюль Дюбо (Dubos, René Jules, 1901-1982) работал над почвенными микроорганизмами. Почва принимала на себя сотни и тысячи трупов естественно умерших животных со всеми заболеваниями — и все же не была резервуаром инфекции. Очевидно, она обладает некими антибактериальными агентами. (Такие агенты позже были названы антибиотиками).

В 1939 г. Дюбо выделил первый антибиотик — тиротрицин — из почвенной бактерии. Антибиотик не был очень эффективен, однако вызвал живой интерес ученых. Десятилетие до того шотландский бактериолог Александер Флеминг (рис. 4.2.24) написал интересный обзор, который теперь был вновь актуален. В 1928 г. Флеминг на некоторое время оставил непокрытой крышкой культуру стафилококка. Вернувшись к работе, он уже готов был выбросить чашку с культурой, когда заметил, что на колонии бактерий, попала плесень и что в этих местах пятна колоний, растворились. Флеминг выделил плесень и идентифицировал ее: это был грибок Penicillium notatum, обычная плесень, часто встречающаяся на хлебе (рис. 4.2.25). Флеминг решил, что плесневый грибок выделяет какой-либо компонент, останавливающий рост бактерий. Он назвал это вещество пенициллином. Он доказал, что вещество не вредит белым кровяным тельцам и другим клеткам человеческого организма.

В 1939 г., благодаря работам Дюбо, интерес к пенициллину вновь возродился. Разразившаяся Вторая мировая война подстегнула разработку лекарства против бактериологического инфицирования ран. Австралийский патолог Хувард Уолтер Флори (Howard Walter Florey, 1898—1968) вместе с биохимиком Эрнстом Борисом Чейном (Ernst Boris Chain, 1906—1979) выделили пенициллин, определили его структуру и поставили его производство на промышленную основу. К концу войны они работали во главе большой англо-американской совместной лаборатории. Успех пришел незамедлительно. Пенициллин был и остается основным оружием против инфекции.

Рис. 4.2.24. Александр Флеминг (Alexander Fleming, 1881-1955)

Рис. 4.2.25. Плесневый грибок Penicillium notatu
После войны были обнаружены и разработаны для производства другие антибиотики. Американский бактериолог Зельман Абрахам Ваксман (Selman Abraham Waksman, 1888-1973) систематизировал почвенные микроорганизмы. В 1943 г. он выделил эффективный антибиотик против бактерий, не повреждаемых пенициллином. В 1945 г. он вышел на мировой рынок под названием стрептомицин.

В 1950-х годах были обнаружены так называемые антибиотики широкого спектра действия. Это — тетрациклины, выступавшие под торговыми марками «ахромицин» и «ареомицин».

Бактериальные инфекции были взяты под контроль, причем в таком масштабе, о котором люди и не мечтали поколение назад. Тем не менее, будущее не представлялось в розовом цвете. Естественный отбор работает таким образом, что выживают штаммы бактерий, устойчивые к антибиотикам. Поэтому со временем антибиотики становятся менее устойчивыми. Конечно, разрабатываются новые эффективные антибиотики. Однако эта битва с бактериями и не проиграна - но не будет выиграна, вероятно, никогда.

Различные химиотерапевтические агенты не поражают вирусы. Вирусы размножаются внутри живых клеток и могут быть уничтожены химической атакой только при уничтожении самой клетки. Однако можно направить атаку против многоклеточного существа — носителя вируса. Например, вирус тифа переносит человеческая вошь, избавиться от которой тяжелее, чем от москита. Поэтому в Первую мировую войну тиф унес больше жизней, чем артиллерия с обеих сторон.

Первые практические указания о способах культивирования микробов и защиты от внесения посторонней микрофлоры появились в ходе изучения проблемы самозарождения. Это – стерилизация питательных сред путем кипячения, применение асбестовых и ватных пробок для закупоривания сосудов, способы химической и термической очистки вводимого в сосуды воздуха и т.д. Наиболее значительными в этом отношении были работы английского физика Д. Тиндаля (рис. 4.2.26), предложившего метод определения степени насыщенности воздуха микроорганизмами. Разрабатывая этот метод, Тиндаль опирался на работы Пастера.

Рис. 4.2.26. Джон Тиндаль (John Tyndall, 1820-1893)

В 1876 г. К. Виттандини, а вслед за ним Э.Клебс и О.Брефельд разработали метод использования желатины в качестве плотной питательной среды. Этот метод наряду с методом выращивания микробов на агар-агаре, который в 1883 г. ввела в практику А. Хессе, положил начало широкому применению плотных прозрачных естественных питательных сред для культивирования микробов. Изготовление жидких питательных сред, сначала синтетических, было начато в 1858 г. Пастером в его исследованиях молочнокислого брожения. Изобретение методов стерилизации открыло возможность использования жидких естественных питательных сред. Изготовление Пастером мясного бульона с добавлением в него пептона (МПБ) положило начало широкому применению жидких культуральных сред. Оно послужило основой для создания (Л. Пастер) и дальнейшего совершенствования (Э. Клебс, Г. Галлир, Дж. Листер) метода разведения, широко вошедшего в практику выделения чистых культур.

Наиболее ценный вклад в развитие техники микробиологических исследований внесли Р. Кох и его школа. В 1882 г. Кох соединил преимущества непрозрачных плотных сред (пространственное расположение колоний) и прозрачных жидких сред в едином методе плотных прозрачных сред. Введением этого метода был создан простейший способ получения чистых культур микробов. Изготовление других плотных сред по принципу Коха — МПЖ (мясопептонная желатина) и МПА (мясопентонный агар) в совокупности с изобретением Г. Гаффки и Ф. Лефлера — культивирование микробов на предметном стекле (или в чашках Петри) — имело огромное значение для всего развития микробиологии.

Столь же перспективным оказался и созданный в 1887- 4890 гг. С. Н. Виноградским метод элективных культур и метод обогатительных культур Бейеринка (1890). Для выделения в лабораторных условиях группы бактерий с определенными свойствами русский микробиолог С.Н. Виноградский (1856—1953) предложил создавать специфические (элективные) условия, дающие возможность преимущественного развития данной группы организмов. С.Н. Виноградский предположил, что среди микроорганизмов есть виды, способные усваивать молекулярный азот атмосферы, являющийся инертной формой азота по отношению ко всем животным и растениям. Для выделения таких микроорганизмов в питательную среду были внесены источники углерода, фосфора и другие минеральные соли, но не добавлено никаких соединений, содержащих азот. В результате в этих условиях не могли расти микроорганизмы, которым необходим азот в форме органических или неорганических соединений, но могли расти виды, обладавшие способностью фиксировать азот атмосферы. Именно так С. Н. Виноградским в 1893 г. был выделен из почвы анаэробный азотфиксатор, названный им в честь Л. Пастера Clostridium pasteurianum.

Большое значение для прогресса микробиологии имела также разработка методов окрашивания и фиксации микробов. Они совершенствовались параллельно с развитием этих методов в гистологии, цитохимии т.д. Так, способ избирательного обесцвечивания окрашенных тканей спиртом, введенный в 1869 г. гистологом А. Беттчером, нашел широкое применение и в микробиологии. Дифференцированное окрашивание различных форм микробов стало применяться после исследований К. Вейгерта, которому в 1871 г. удалось окрасить кокковидные зооглеи аммиачным кармином, а также с работ Эберта, который в 1872 г. окрашивал кокки гематоксилином. В 1875 г. Вейгерт впервые разработал метод окрашивания бактерий анилиновыми красками. С тех пор этот метод широко применяется в микробиологии.

На основе учета избирательной восприимчивости микробов к основным анилиновым краскам и невосприимчивости к кислым анилиновым краскам П. Эрлих предложил в 1886 г. использовать феномен окрашивания не только для их дифференцированного окрашивания, но и в качестве реактива на самое присутствие микробов.

Принципиальное значение получил метод окрашивания микробов, разработанный в 1884 г. Г. Грамом (рис. 4.2.28). Сущность его состояла в выделении промежуточного состояния окрашивания между максимальным окрашиванием (генцианвиолетом) и обесцвечиванием препарата под действием сначала йода (раствор люголя), а затем спирта с последующей дополнительной окраской (везувином). Микробы, воспринимающие дополнительное окрашивание, стали считаться грамотрицательными, неокрашивающиеся везувином и сохраняющие первое окрашивание (генцианвиолетом) — грамположительными (рис. 4.2.29). Отношение микробов к окрашиванию по Граму является постоянным признаком и широко применяется как систематический признак.

Рис. 4.2.28. Ганс Христиан Иоахим Грам (Hans Christian Joachim Gram, 1853 - 1938)


Рис. 4.2.29. Грамположительные бактерии сибирской язвы (пурпурные палочки) в спинномозговой жидкости
Основными методами современных микробиологических исследований являются: микроскопия (световая, люминесцентная, электронная, лазерная); выделение чистых культур и контролируемое культивирование; аналитические методы (физиолого-биохимические, генетические и т.д.); молекулярно-биологические методы (в том числе обнаружение микроорганизмов без выделения в чистые культуры).