Изучение участия микробов в природных процессах

Центральное положение среди объектов изучения на первом этапе развития этого направления занимали почвенные микроорганизмы. Уже в 60—70-х годах XIX в. идея об активной роли специфических почвенных микроорганизмов в генезисе почв и водоемов имела значительное число сторонников среди агрохимиков и агрономов.

Идеи Пастера оказались настолько плодотворными, что на их основе за короткий срок были открыты и изучены основные группы микроорганизмов, осуществляющих круговорот азота, углерода, серы, железа и других элементов. При этом, как правило, экологические исследования сопровождались широким изучением физиологических особенностей открываемых микроорганизмов, что способствовало одновременно развитию физиологического направления в микробиологии.

Сообщения о фактах участия микроорганизмов в природных процессах превращения веществ стали независимо друг от друга появляться в различных странах. Так, в 1877 г. французские химики Т. Шлезинг и А. Мюнц, исходя из гипотезы об «организованных ферментах», экспериментально доказали, что процесс нитрификации, считавшийся чисто химическим, является по своей природе микробиологическим, а английский бактериолог Р. Уорингтон уже в 1884 г. попытался выделить возбудителей нитрификации в чистые культуры. В 1882 г. французские исследователи Дегерен, Гайон и Дюпети установили микробиологический харак тер процесса денитрификации, а в 1884 г. Дегерен показал, что анаэробное разложение растительных остатков в природе осуществляется с помощью микроорганизмов.

В становлении и развитии экологического направления в микробиологии и изучении природных микробиологических процессов большая заслуга принадлежит русским ученым, которые также опирались на открытия Пастера.

Ученик Л. С. Ценковского М.С. Воронин в 1867 г. описал клубеньковые бактерии, которые, как показали в 1884—1886 гг. Гельригель и Вильфарт, осуществляют фиксацию атмосферного азота. В чистую культуру их выделил М. Бейеринк, в 1901 г. П.А. Костычевым была разработана теория микробиологической природы почвообразовательного процесса, и его по праву можно считать одним из основателей русской почвенной микробиологии. Введенный им новый, биологический подход к изучению почв основывался на учете первостепенного значения для образования почв высших, а затем низших растений — водорослей, грибов и бактерий.

Идея о важнейшей роли микроорганизмов в круговороте веществ в природе была впервые высказана В.Л. Омелянским (1909). Он же представил схемы круговорота веществ в природе, указав, что путь к познанию закономерностей круговорота состоит в изучении морфологии, физиологии и экологии микроорганизмов. Омелянский провел детальное изучение жизнедеятельности микроорганизмов, принадлежащих к различным эколого-физиологическим группам: участвующих в круговороте азота — нитрификаторов и азот-фиксаторов; осуществляющих круговорот серы — гнилостных и сульфат-редуцирующих, бесцветных, окрашенных и тионовых бактерий; играющих важную роль в круговороте железа — железобактерий; обеспечивающих круговорот углерода — разложение и синтез органических соединений.

Трудами С. Н. Виноградского, В. Л. Омелянского, М. Бейеринка и других была доказана важнейшая роль микроорганизмов в геохимических процессах и установлено их огромное геологическое значение.

Пользуясь изящными методическими приемами, в основу которых был положен микроэкологический принцип, С.Н. Виноградский выделил из почвы микроорганизмы, представляющие собой совершенно новый тип жизни и получившие название хемолитоавтотрофных. В качестве единственного источника углерода для построения всех веществ клетки хемолитоавтотрофы используют углекислоту, а энергию получают в результате окисления неорганических соединений серы, азота, железа, сурьмы или молекулярного водорода. Так было открыто явление, названное Виноградским «минеральным дыханием», или, по его терминологии 1922 г., аноргоксидацией, а согласно современной терминологии этот процесс называется хемосинтезом.

В работах по физиологии хемоавтотрофных бактерий Виноградский развивал идею экологического подхода к изучению жизнедеятельности микробов в лабораторных условиях. Он неизменно подчеркивал, что только строгий учет экологических особенностей свободноживущих микроорганизмов позволяет раскрыть сущность их физиологии. Результаты исследований физиологии клубеньковых, а также целлюлозоразлагающих бактерий, возбудителей мочки льна и т.д., значительно обогатили общую и почвенную микробиологию. Впоследствии он разработал целостную теорию почвенной микробиологии.

Микроэкологический принцип С.Н. Виноградского был успешно развит М. Бейеринком и применен при выделении различных групп микроорганизмов. В частности, спустя восемь лет после открытия С. Н. Виноградским анаэробного азотфиксатора, М. Бейеринк обнаружил в почве еще один вид бактерий, способных к росту и азотфиксации в аэробных условиях, — Azotobacter chroococcum. Круг научных интересов М. Бейеринка был необычайно широк. Ему принадлежат работы по исследованию физиологии клубеньковых бактерий, изучению процесса денитрификации и сульфатредукции, работы по изучению ферментов разных групп микроорганизмов. Созданный Бейеринком метод обогатительных культур, заключающийся в тщательном изучении условий развития микроорганизмов в природе, оказался ценным дополнением к методу элективных культур и получил широкое распространение в практике выделения специфичных в питании микробов.

С.Н. Виноградский и М. Бейеринк являются основоположниками экологического направления микробиологии, связанного с изучением роли микроорганизмов в природных условиях и участием их в круговороте веществ в природе.

Сообщения об активном участии микроорганизмов в процессах превращения веществ в природе стали быстро накапливаться в 70—80-х гг. XIX в. В 1877 г. французские химики Т. Шлезинг (Т. Schloesing) и А. Мюнц (A. Muntz) доказали микробиологическую природу процесса нитрификации. В 1882 г. П. Дегерен (Р. Deherein) обнаружил аналогичную природу процесса денитрификации, а двумя годами позднее он же установил микробиологическую природу анаэробного разложения растительных остатков. М. С. Воронин в 1867 г. описал клубеньковые бактерии, а спустя почти двадцать лет Г. Гельригель (Н. Неllrigеl) и Г. Вильфарт (Н. Willfarth) показали их способность к азотфиксации.

Успехи, достигнутые в раскрытии экологических особенностей микробов, были в значительной мере связаны с применением специальных методов изучения живой микрофлоры, основывающихся на принципе культивирования в среде, максимально приближающейся к природным условиям обитания микробов.

Идея С. И. Виноградского (1924) о том, что только продолжительное по мере возможности наблюдение над процессом развития единичных форм (особей) в микрокультурах может привести к цели, легла в основу разработки методов прямого микроскопического исследования микроорганизмов. Среди них особенно широкое применение получили метод стекол обрастания Росси — Холодного (1927, 1930); «почвенная камера» Н.Г. Холодного (1933) и его же метод «проращивания» почвенной пыли; приемы изучения глубоководной микрофлоры, разработанные А.Е. Криссом (1959) и его сотрудниками; капиллярные методы изучения микроорганизмов, введенные Б.В. Перфильевым и Д. Р. Габе (1961); пластинки из нитратного агара, предложенные Е.3. Теппер для изучения проактиномицетов; педоскопы, созданные Т.В. Аристовской для изучения почкующихся бактерий и нашедшие широкое применение в почвенной микробиологии, и др.
4.2.13. Физиология и биохимия микроорганизмов
В формировании физиолого-биохимического подхода к изучению жизнедеятельности микробов ярко проявилась одна из характерных черт микробиологии: исследования, носящие прикладной характер, оказались источником данных, имеющих большую теоретическую и научную ценность. Вместе с тем специфические свойства микроорганизмов — быстрый рост и высокая активность обмена, разнообразие форм анаболизма и катаболизма, экологическая специфика — определили исключительную роль микроорганизмов как наиболее удобных объектов для химического изучения обмена веществ.

В теоретическом истолковании результатов физиолого-биохимических исследований выявились две взаимосвязанные тенденции: с одной стороны, поиски единства в формах метаболизма, обнаруживающегося в общих биохимических и генетических механизмах, с другой — проникновение в тонкую специфику физиологии отдельных групп микробов. Известные в настоящее время четыре основных типа обмена веществ микроорганизмов — фотолитотрофный, фотоорганотрофный, хемолитотрофный и хемоорганотрофный — детально изучались с помощью различных физико-химических методов.

Изучение биохимии различных брожений, начатое еще Пастером, дало представление о диссимилятивной деятельности микроорганизмов и выявило большое разнообразие форм метаболизма в мире микробов. Решающее значение для выяснения биохимической сущности процессов диссимиляции имела разработка Э. и Г. Бухнерами (1897) метода бесклеточного спиртового брожения. Продолжая работы Бухнеров, английские биохимики А. Гарден и В. Юнг открыли физиологическую функцию фосфора в процессах диссимиляции углеводов и в 1908 году вывели уравнение спиртового брожения:
.
Изучение природы и механизма действия ферментов аэробной и анаэробной диссимиляции углеводов О. Варбургом (Нобелевская премия,. 1931) и Г. Эйлером привело в конце 30-х годов к построению схемы, отражающей в основных чертах биохимию гликолиза – схемы Эмбдена—Мейергофа—Парнаса.

Применение ферментных препаратов и радиоактивных изотопов позволило установить наличие у микроорганизмов и других механизмов разложения углеводов. Было выяснено, что реакции, характерные для схемы Эмбдена—Мейергофа—Парнаса, встречаются также и при других бродильных и окислительных процессах.

Одно из первых подтверждений достоверности этих положений дало детальное изучение механизма молочнокислого брожения. Для той формы брожения, которое сопровождается образованием только молочной кислоты, А. Клюйвер и Г. Донкер (1924) предложили термин «гомоферментативное брожение», противопоставив его «гетероферментативному брожению», завершающемуся образованием еще летучих кислот, этилового спирта и СО₂. Исследованиями М. Гиббса с сотрудниками (1950) было показано, что гомоферментативное брожение протекает по гликолитической схеме, а гетероферментативное — по гексозомонофосфатному пути.

Изучению различных форм диссимилятивной активности микроорганизмов сопутствовало исследование их энергетического обмена. В результате выявления продуктов неполного окисления субстрата в 30— 40-х годах была установлена связь между энергетическими и конструктивными процессами (Л. Стикленд, Д. Вудс, В. О. Таусон, А. Клюйвер, К. Ван-Ниль). Важным открытием в этом направлении было установление Ф. Липманом (Нобелевская премия, 1953) (рис. 4.2.32) функции аденозинтрифосфата (АТФ), выступающего в качестве аккумулятора и переносчика биологической энергии.

Начало обнаружению разнообразия физиологических особенностей фотосинтезирующих микроорганизмов было положено открытием в середине XIX в. зеленых бактерий, а несколько позднее — пурпурных. Г. Молиш (1907) выявил способность пурпурных бактерий расти на органических веществах в темноте и отсутствие выделения ими кислорода. А. Будер (1919) и В. Бевендамм (1924) высказали предположение, что фотосинтезирующие микроорганизмы способны как к фотосинтезу, так и к хемосинтезу. Исследования К. Ван-Ниля показали, что фотосинтезирующие микроорганизмы осуществляют фотосинтез в присутствии окисляемых субстратов — минеральных и органических — и без выделения кислорода. Он же составил уравнение бактериального фотосинтеза:

В ходе изучения пигментов фотосинтезирующих бактерий, начавшегося с открытия в 1952 г. Г. Шахманом, А. Парди и Р. Стениером хроматофоров, было установлено, что они являются мембранными структурами — ламеллами, которые за уплощенную форму были названы С. Менке (1962) тилакоидами. Среди них были дифференцированы ламеллы стромы и ламеллы гран, в которых сконцентрированы бактериохлорофиллы (рис. 4.2.34). Таким образом, в 50—60-е годы стало известно, что фотосинтезирующий аппарат микроорганизмов представляет собой фосфолипопротеиновую структуру и содержит пигменты и переносчики электронов, т.е. дыхательную цепь. Иными словами, система энергетического обмена дополнена у них системой фотосинтезирующих пигментов.

Основную роль в открытии столь широкого распространения способности к азотфиксации и в установлении ее биохимии сыграло применение изотопа азота — ¹⁵N. В 1941 году Р. Бёррис и Ч. Миллер экспериментально показали, что первым устойчивым продуктом азотфиксации является аммиак. Этот же факт был установлен и на бесклеточных ферментных системах (Л. Мортенсон и др., 1962; Д. Карнахан и др., 1963; А. А. Имшенецкий и др., 1963; и др.).

Данные о тинкториальных свойствах клеточной оболочки бактерий начали появляться с 1924 г. (М. Гутштейн, Г. Найзи, Р. Маррей, М. А. Пешков и др.). Было установлено, что известное ранее характерное окрашивание бактерий по Граму обусловлено содержанием, глубиной залегания и степенью защищенности липидами мукопептидного комплекса, ответственного за ригидность клеточной стенки (рис. 4.2.37).

Интенсивно изучалось бактериальное ядро. Применение реакции Фёльгена—Россенбека, контрастной фотографии, фазово-контрастного устройства, электронно-микроскопических, генетических и биохимических методов исследования привело к установлению того, что ядро, или нуклеоид, бактерий представлен в виде одной нити ДНК, свернутой в кольцо и прикрепленной к мембране, и что нуклеоид, или бактериальная хромосома, не имеет ядерной мембраны. В этом его главное отличие от структуры ядерного аппарата эукариотов (рис. 4.2.38).

Богатый материал был получен по изучению функциональной морфологии органелл низших эукариотов. Оказалось, что митохондрии дрожжей обладают большой изменчивостью структуры, высокой сорбционной активностью и легкой повреждаемостью при химических и физических воздействиях. Это подтвердило их участие в метаболических процессах. В 1938 г. М. И. Мейсель описал характерную перестройку митохондрий у факультативных аэробных дрожжевых организмов при их переходе от аэробных к анаэробным условиям. Та же перестройка была обнаружена в 50-х годах при изменении концентрации сахаров, витаминов и антибиотиков. Изучение ультраструктуры дрожжевых митохондрий выявило наличие у них крист с грибовидными субъединицами. Было показано, что эти же ультраструктуры характерны для всех самостоятельно существующих организмов, начиная от бактерий и кончая клетками высших организмов.

Рис. 4.2.38. Ультратонкий срез клеток Clostridium penicillum. Видны клеточная стенка (КС), нуклеоид со спирально закрученными фибриллами ДНК(Ф), связанные с нуклеоидом мезосомы (М), и цитоплазматическая мембрана (ЦПМ)
В 40—50-х годах было установлено, что внутренняя мембранная система, образующаяся из цитоплазматической мембраны, имеется главным образом у грамположительных бактерий; у грамотрицательных бактерий она развита слабее. Возникла гипотеза о гомологичности органелл эукариотных клеток с целой клеткой прокариот.

Значительный прогресс в изучении морфогенеза бактерий и раскрытии его химической основы стал возможен благодаря исследованиям генетического аппарата и биосинтеза структурных компонентов клетки.

Во второй половине XIX в. немецкий биолог Э. Геккель (рис. 4.2.39) приходит к заключению, что микроорганизмы настолько существенно отличаются как от царства животных, так и от царства растений, что не укладываются ни в одно из этих подразделений. Э. Геккель предложил выделить все микроорганизмы, у которых отсутствует дифференцировка на органы и ткани (простейшие, водоросли, грибы, бактерии), в отдельное царство Protista (протисты, первосущества, от греч. protos — самый простой), включив в него организмы, во многих отношениях занимающие промежуточное положение между растениями и животными. Термин «protista» и сейчас применим для обозначения объектов, исследуемых микробиологами.

Обоснование того, что прокариотный и эукариотный типы клеточной организации являются наиболее существенной границей, разделяющей все клеточные формы жизни, связано с работами Р. Стейниера (R. Stanier, 1916—1982) и К. ван Ниля, относящимися к 60-м гг.

В связи с тем что прокариотная и эукариотная организация клеток принципиально различна, было предложено только на основании этого признака выделить все прокариоты в особое царство. Р. Меррей (R. Murray) в 1968 г. предложил все клеточные организмы разделить на две группы по типу их клеточной организации: царство Prokaryotae, куда вошли все организмы с прокариотным строением клетки, и царство Eukaryotae, куда включены все высшие протисты, растения и животные.

Р. Виттэкер (R. Whittaker) предложил схему, по которой все живые организмы, имеющие клеточное строение, представлены разделенными на пять царств (рис. 4.2.40). Такая система классификации живого мира отражает три основных уровня его клеточной организации: Monera включает прокариотные организмы, находящиеся на самом примитивном уровне клеточной организации; Protista — микроскопические, в большинстве своем одноклеточные, недифференцированные формы жизни, сформировавшиеся в результате качественного скачка в процессе эволюции, приведшего к возникновению эукариотных клеток; многоклеточные эукариоты представлены в свою очередь тремя царствами Plantae, Fungi и Animalia.

Рис. 4.40. Схема пяти царств живого мира: прокариоты (царство Monera), одноклеточные эукариоты (царство Protista), многоклеточные эукариоты (царства Plantae, Fungi, Animalia) (no Whittaker, 1969).
Три последние таксономические группы различаются по способу питания: фототрофный тип питания за счет процесса фотосинтеза характерен для растений (Plantae); грибы (Fungi) в основном характеризуются осмотрофным типом питания, т.е. питанием растворенными органическими веществами; животные (Animalia) осуществляют голозойное питание, заключающееся в захватывании и переваривании твердой пищи. Способы питания, специфические для растений и грибов, возникли в процессе эволюции на уровне Monera. На уровне Protista они получили свое дальнейшее развитие; здесь же сформировался третий тип питания — голозойный. Такая система четырех эукариотных царств и одного царства прокариотов была наиболее популярной до середины 1970-ых годов. Причем все системы классификации основывались на типических признаках – морфология, физиология, биохимия организма.

Однако американский исследователь Карл Везё (Carl Woese) (4.2.41) в 1977 г. открыл археи (Archaea) - организмы, которые имеют прокариотическое строение клетки, но при этом, как оказалось, очень далеко отстоят от настоящих бактерий. При обычном микроскопировании невозможно выделить какие-либо отличительные признаки архей по отношению к эубактериям, они близки к их грамположительным формам, размножаются как и эубактерии бинарным делением, почкованием и фрагментацией. Различия архебактерий и остальных бактерий были открыты только при сравнительном анализе 16s рРНК. Причем в начале Вёзе провел опыты с 5S субъединицей. Он обнаружил достаточно много гомологий, которые могли бы помочь составить древо, но 5S состоит из всего 121 нуклеотида, что крайне неинформативно.

Тогда он обратил внимание на 16S рРНК, содержащую 1500 нуклеотидов. У нее обнаружился консервативный участок из 900 нукетидов, который не меняется. Если в нем что-то изменить, то синтез белка уже не происходит. Остальная часть последовательности — это изменяющиеся участки. Эта субъединица оказалась очень удобной для сравнения отрезков и определения родства, поскольку обладает достаточно большой, но не чрезмерной информацией и считается своеобразным «биологическим хронометром». Везе была выделена и предложена система не пяти царств, а трех доменов: бактерии, археи и эукариотные организмы. Внутри этих доменов идет деление на империи, империи делятся на царства, царства на отделы ну и так далее. Оказалось, что все организмы хорошо ложатся на филогенетическое древо, которое Карл Вёзе и издал в 1985 году (рис. 4.2.42). Одновременно было доказано, что митохондрии и хлоропласты имеют бактериальное симбиотическое происхождение. Филогенетическое дерево, построенное на основании анализа 16S рРНК, показывает разделение эубактерий, архей и эукариот.

Рис. 4.2.41. Кард Везё (Carl Woese, род. в 1928)

Рис. 4.2.42. Филогенетическое древо жизни, изданное Карлом Вёзе в 1977 г.
В настоящее время преобладает именно этот филогенетический подход к систематике микроорганизмов, который учитывает родственные связи и пути эволюции организмов. При такой классификации иерархия таксонов отражает генеалогическое древо. Однако из-за отсутствия в большинстве случаев ископаемых остатков микроорганизмов невозможно напрямую установить исторический путь эволюции.

Анализ 16S рРНК позволяет определить место микроорганизма на филогенетическом древе. А дальше определение видового названия ведется традиционными микробиологическими методами. При этом 90% совпадений свидетельствуют о принадлежности к определенному роду, 97 % - к определенному виду. Более точный метод – ДНК-ДНК-гиридизация, который дает более 30 % совпадений в пределах рода и более 70 % - в пределах вида.

Для более четкой дифференцировки микроорганизмов на уровне рода и вида американским микробиологом Ритой Колвелл (1970) была предложена полифилетическая (полифазная) таксономия, предполагающая использование многоуровневой информации – от молекулярной до экологической.