Учебное пособие «История и методология биологии и биофизики»
Изучение трансформации, трансдукции, конъюгации и лизогенной конверсии
жүктеу/скачать 12.91 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 4.3. Возникновение и развитие вирусологии 4.3. 1.Открытие вирусов
- 4.3.2. Биоразнообразие вирусов
- Феликс Губерт Д’Эрелль
- Вальтером Ридом
- 4.3.3. Этапы развития вирусологии История достижений вирусологии напрямую связана с успехами развития методической базы исследований. Конец XIX — начало XX-го века.
- 60-е и последующие годы
4.2.23. Изучение трансформации, трансдукции, конъюгации и лизогенной конверсии В настоящее время трансформацией называют процесс переноса информации с помощью ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту и замещения в последней в результате рекомбинации специфической последовательности нуклеотидов генома. Термин «трансформация» появился в 1928—1934 гг., когда было обнаружено, что некоторые штаммы бактерий, выращенные в присутствии убитых клеток или в культуральных фильтратах и экстрактах из других родственных штаммов, могли приобретать некоторые свойства этих штаммов (рис. 4.2.46). Сущность этого явления была выяснена в 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леодом и М. Мак-Карти, установившими, что трансформирующим агентом является высокомолекулярная ДНК. Дальнейшее изучение трансформации проводилось при учете в качестве маркеров различных признаков: капсулообразования (для пневмококков), устойчивости к антибиотикам, потребности в факторах роста (X. Раппапорт, 1959; Л. Толмач, Р. Херриотт, 1962; и др.). Исследования с использованием последних двух маркеров дали возможность детально разработать проблемы множественной трансформации и «сцепления» различных генов. Важное место среди этих исследований заняли работы японских ученых X. Иошикавы и Н. Сеока, которые в 1963 г. разработали метод картирования сцепленных генов у Bacillus subtilis. Способность ДНК проникать в клетку-реципиент зависит как от природы самой ДНК, так и от физиологического состояния клетки-реципиента. Трансформирующей ДНК могут быть только высокомолекулярные двухцепочечные фрагменты, при этом проникать в бактериальную клетку может ДНК, выделенная из разных биологических источников, но включаться в геном — только ДНК с определенной степенью гомологичности. После того как экзогенный фрагмент ДНК, проникший в клетку, нашел гомологичный фрагмент ДНК клетки-реципиента, между ними происходит генетический обмен.
Рис. 4.2.46. Схема эксперимента Гриффита (по Стенту): а — мышь, которой введена культура патогенного капсулированного штамма S пневмококов, погибает; б — мышь, которой введена культура непатогенного бескапсульного R—мутанта нормального S—штамма, не погибает; в — мышь, которой введена культура S—штамма, убитого предварительно нагреванием, не погибает; г — мышь, которой введена смесь живой культуры R—мутанта и убитой нагреванием культуры нормального S—штамма, погибает; в этом случае присутствие убитых нагреванием S—бактерий вызвало трансформацию живых R—бактерий, в результате чего у них восстановилась способность к образованию капсулы и патогенность. Открытие лизогении связано с именами Ж. Борде и М. Чуке (1921), которые положили начало изучению роли бактериофага в осуществлении бактериальных рекомбинаций (рис. 4.2.47). Данное ими определение лизогении как наследственной способности бактерий спонтанно продуцировать бактериофаг при отсутствии экзогенного заражения сохранилось и по сегодняшний день. 
Рис. 4.2.47. Встраивание ДНК фага X в хромосому Е. coliв неэкспрессируемом состоянии, которое может поддерживаться посредством репликации в течение многих поколений. В результате некоего события, играющего роль пускового механизма, вирусный геном может начать экспрессироваться с образованием фаговых частиц и последующим лизисом клеток. 
Рис. 4.2.48. Трансдукция. Если бактериальная клетка заражена некоторыми ДНК-содержащими фагами, то небольшая часть ее хромосомы может ковалентно присоединиться к фаговой ДНК, реплицироваться вместе с ней и таким образом встраиваться в ДНК дочерних фаговых частиц. Когда такие частицы заражают другую клетку, фаговая ДНК приносит в эту клетку участок хромосомы первой клетки. На основе исследований Ф. Бернета, М. Дельбрюка и особенно А. Львова, проливших свет на истинную природу явления лизогении, стало возможным открытие Дж. Ледербергом и Н. Циндером (1952) нового способа переноса генетической информации с помощью бактериофага, названного ими трансдукцией (рис. 4.2.48). Трансдукция оказывается возможной, если в процессе размножения фага одна из частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, как правило, содержащий очень небольшое число генов. Когда такая фаговая частица заражает бактерию-реципиент, бактериальная ДНК проникает в клетку таким же путем, как фаговая. Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен, и как следствие его возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генетического материала клетки-донора. Передача признаков с помощью фагов показана для бактерий, принадлежащих к разным родам. Использование разных форм трансдукции способствовало решению многих сложных генетических проблем. В 50-х годах Б. Хейс установил, что при бактериальном скрещивании наблюдается полярность, причем один из партнеров каждой конъюгирующей пары является донором, или «самцом», а другой — реципиентом, или «самкой», т.е. партнеры, участвующие в конъюгации, гетероталличны. Им были выделены два половых типа — F+ (донорные, или мужские штаммы) и F- (реципиентные, или женские штаммы). В 1956 г. Дж. Ледерберг представил прямые микроскопические доказательства образования конъюгационных пар в смешанных культурах рекомбинирующих штаммов. При конъюгации, для которой необходим непосредственный контакт между бактериальными клетками, осуществляется направленный перенос генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент (рис. 4.2.49). Как правило, в клетку-реципиент переносится только часть генетического материала клетки-донора, в результате чего образуется неполная зигота, или мерозигота, содержащая часть генома донора и полный геном клетки-реципиента. Участки перенесенной от донора ДНК находят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен. В результате часть донорной ДНК встраивается (интегрируется) в геном реципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК из него исключается. Наконец, еще один путь переноса генетического материала у прокариот осуществляется с помощью плазмид определенного типа, обладающих генами, обеспечивающими эту возможность. Такие плазмиды помимо переноса собственного генетического материала могут обеспечивать перенос хромосомных генов, плазмид, не обладающих способностью к самостоятельному переносу, а также осуществлять передачу транспозонов из плазмиды в хромосому или другую плазмиду. Все известные способы передачи генетической информации с помощью плазмид создают огромные возможности для интенсивных генетических обменов между клетками различных бактерий. Плазмидам и другим нехромосомным генетическим элементам принадлежит основная роль в передаче генетической информации «по горизонтали». Можно предположить, что в природе любая генетическая информация может быть перенесена в любую клетку прокариот, если не прямо, то через посредников. Подтверждением этого могут служить данные по введению с помощью сконструированной плазмиды в бактериальную клетку эукариотной ДНК и ее репродукции там.
Рис. 4.2.49. Конъюгация бактерий. Обычно бактерии размножаются вегетативным путем, с помощью простого роста и деления. Однако у некоторых бактерий иногда происходит половая конъюгация, в ходе которой часть одной из цепей (или вся цепь) хромосомы донорной клетки переносится через пиль – длинный соединительный канал – в реципиентную клетку того же вида. Как редкое событие, происходящее с частотой 10–4—10–7, плазмиды или отдельные гены, входящие в их состав, могут включаться в бактериальную хромосому. Поскольку ДНК плазмиды и бактериальной клетки не имеют одинаковых нуклеотидных последовательностей, т.е. не являются гомологичными, рекомбинация между ними происходит не по механизму обмена, а по механизму встраивания. Рекомбинации такого типа происходят также с участием транспозонов и IS-элементов при их перемещении (транспозиции) в пределах хромосомы. Встраивание плазмид и мигрирующих элементов помимо того, что приводит к введению в хромосому дополнительного генетического материала, может вызывать перестройку бактериального генома: нарушать целостность генов или регуляцию их функционирования, т.е. вызывать мутации. 4.3. Возникновение и развитие вирусологии 4.3. 1.Открытие вирусов Открытие вирусов началось с почти детективной истории. В 1887 г. в Крыму плантации табака поразила неизвестная болезнь: листья растений покрывались сложным абстрактным рисунком, растекавшимся по листу, словно краска, переливающаяся с одного листа на другой, от одного растения к другому (рис. 4.3.1). Сельское хозяйство несло большие убытки. На место происшествия был направлен выпускник Санкт-Петербургского университета Д.И. Ивановский (рис. 4.3.2). Молодой ученый решил выяснить, какая бактерия вызывает болезнь табака. Однако задача оказалась весьма не простой. 
Рис. 4.3.1. Лист, пораженный вирусом табачной мозаики Просмотр огромного количества препаратов, приготовленных из экстрактов больных листьев, не принес удачи. Не удалось получить ответ на вопрос: есть ли микробы в экстрактах из пораженных листьев? В то же время при заражении здоровых листьев соком из больных (инъекции в толщу здоровых листьев) результат был всегда одинаковым: здоровые листья заболевали через 10–15 дней. Это напоминало инкубационный период, свойственный любой инфекции, в течение которого микробы, размножаясь, проникают внутрь организма и вызывают заболевание. Но прямого доказательства не было. Тогда Ивановский использует метод фильтрации. Во Франции Шамберлан, ученик и друг знаменитого Пастера, изготовил бактериальный фильтр – «свечу Шамберлана» из фарфора с крайне мелкими порами, не пропускающими самые мелкие микробы, видимые в микроскоп. Ивановский фильтрует сок из больных листьев через этот фильтр. Идея проста, профильтрованный сок не должен содержать микробов. И, следовательно, не сможет заразить здоровые листья табака. Но к изумлению исследователя, при нанесении капли абсолютно прозрачной жидкости на здоровые листья на них появляется характерный абстрактный рисунок, т.е. развивается болезнь. Вывод один – в отфильтрованном соке растения есть неизвестные микробы – возбудители мозаичной болезни табака (ВТМ). Д.И. Ивановский предположил, что ВТМ в тысячу раз меньше уже известных микробов, поэтому и прошли через бактериальный фильтр. Так были открыты новые микробы-«невидимки» – фильтрующиеся вирусы (1892 г.). 
Рис. 4.3.2. Дмитрий Иосифович Ивановский (1864-1920) Термин «вирус» (от лат. virus – яд) предложил голландец для обозначения инфекционной природы отфильтрованных растительных жидкостей. Название «фильтрующиеся вирусы» употребляли до конца 30-х - начала 40-х гг. ХХ столетия. Впоследствии оказалось, что через мелкие поры (0,5 мкм) бактериальных фильтров могут проходить не только вирусы, но и так называемые L-формы бактерий. Следовательно, фильтруемость, определяемую малыми размерами, нельзя считать свойством, отличающим вирусы от других микроорганизмов, поэтому и оснований для сохранения определения «фильтрующиеся» не стало. Фильтрующиеся вирусы стали просто вирусами (рис. 4.3.3). 
Рис. 4.3.3. Микрофотографии разных вирусов Впоследствии оказалось, что ВТМ может кристаллизоваться. В 1935 г. знаменитый вирусолог У.Стэнли подтвердил способность образовывать кристаллы и доказал возможность существования в кристаллическом виде не только ВТМ, но и ряда других вирусов. Так, получил признание термин «кристаллы Ивановского» (рис. 4.3.4.). 
Рис. 4.3.4. Рисунок Ивановского, изображающий вирусные кристаллы и аморфные вирусные включения в клетках мозаичного табака В 1936 г. английский ученый Ф.С. Боуден совместно с Н.У. Пири показали, что ВТМ состоит не из чистого белка, как считал Стенли, а является нуклеопротеидом. Впоследствии вирусологами разных стран были получены в кристаллическом виде вирусы человека, животных, насекомых и растений. Кристаллическое состояние оказалось особенно характерным для вирусов растений. 4.3.2. Биоразнообразие вирусов В настоящее время ясно, что вирусы характеризуются убиквитарностью, то есть повсеместностью распространения. Вирусы поражают представителей всех царств живого: человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растения, грибы, бактерии. В настоящее время вирусов известно великое множество, но они настолько малы, что, по словам академика В.М. Жданова, коллекция, собранная из всех известных вирусов, «поместилась бы в коробочке размером с маковое зернышко». Вирусы сопровождают все живое со дня рождения до самой смерти. Эти коварные невидимки приносят огромный вред. Больше половины всех заболеваний человека (более 500 различных вирусных инфекций) на «совести» вирусов. Первое сообщение, имеющее отношение к вирусам бактерий было сделано Эрнест Ханкин (Ernest Hankin) в 1896 г. В Летописи Института Пастера он заявил, что «... вода некоторых рек Индии обладает бактерицидным действием...», что без сомнения связано с вирусами бактерий. В 1915 г. Туорт в Лондоне, изучая причины лизиса бактериальных колоний, описал принцип передачи «лизиса» новым культурам в ряду поколений. Его работы, как это часто бывает, фактически оказались не замеченными, и два года спустя, в 1917 г., канадец Феликс Губерт Д’Эрелль (рис.4.3.5) повторно обнаружил явление лизиса бактерий, связанного с фильтрующимся агентом. Он назвал этот агент бактериофагом. Д’Эрелль предполагал, что бактериофаг один. Однако исследования Барнета, работавшего в Мельбурне в 1924-34 гг., показали широкое разнообразие бактериальных вирусов по физическим и биологическим свойствам. Открытие многообразия бактериофагов вызвало большой научный интерес. В конце 30-х годов трое исследователей — физик Дельбрюк (Max Ludwig Henning Delbrück, 1906-1981), бактериологи Лурия (Salvador Edward Luria, 1912-1991) и Херши (Alfred Day Hershey, 1908-1997), работавшие в США, создали так называемую «Фаговую группу», исследования которой в области генетики бактериофагов в конечном итоге привели к рождению новой науки — молекулярной биологии. 
Рис. 4.3.5. Феликс Губерт Д’Эрелль (Felix d’Herelle,1873-1949) В наименьшей степени изучены вирусы насекомых. В настоящее время ясно, что вирусы, поражающие насекомых, условно можно разделить на 3 группы: собственно вирусы насекомых, вирусы животных и человека, для которых насекомые являются промежуточными хозяевами, и вирусы растений, которые также поражают насекомых. Первый вирус насекомых, который был идентифицирован — вирус желтухи шелковичного червя (вирус полиэдроза тутового шелкопряда, названный Bollea stilpotiae). Еще в 1907 г. Провачек показал, что фильтрованный гомогенат больных личинок является инфекционным для здоровых личинок тутового шелкопряда, но только в 1947 г. немецкий ученый Бергольд обнаружил палочковидные вирусные частицы. Одним из наиболее плодотворных исследований в области вирусологии является изучение Вальтером Ридом (рис.4.3.6) природы желтой лихорадки на волонтерах армии США в 1900-1901 гг. Убедительно было продемонстрировано, что желтая лихорадка вызывается фильтрующимся вирусом, который передавался комарами и москитами. Было также установлено, что москиты после впитывания инфекционной крови в течение двух недель остаются неинфекционными. Таким образом, был определен внешний инкубационный период заболевания (время, необходимое для репродукции вируса в насекомом) и установлены основные принципы эпидемиологии арбовирусных инфекций (вирусных инфекций, передаваемых кровососущими членистоногими). 
Рис. 4.3.6. Вальтер Рид (Walter Reed, 1851-1902) Способность размножения вирусов растений в своем переносчике — насекомом была показана в 1952 г. Мараморошу. Исследователь, используя технику инъекций насекомым, убедительно показал способность вируса желтухи астр размножаться в своем переносчике — шеститочечной цикаде. 4.3.3. Этапы развития вирусологии История достижений вирусологии напрямую связана с успехами развития методической базы исследований. Конец XIX — начало XX-го века. Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры (свечи Шамберлана), которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. С использованием фильтруемости через бактериологические фильтры были открыты следующие вирусы: 1892 г. — вирус табачной мозаики; 1898 г. — вирус ящура; 1899 г. — вирус чумы рогатого скота; 1900 г. — вирус желтой лихорадки; 1902 г. — вирус оспы птиц и овец; 1903 г. — вирус бешенства и вирус чумы свиней; 1904 г. — вирус оспы человека; 1905 г. — вирус чумы собак и вирус вакцины; 1907 г. — вирус денге; 1908 г. — вирус оспы и трахомы; 1909 г. — вирус полиомиелита; 1911 г. — вирус саркомы Рауса; 1915 г. — бактериофаги; 1916 г. — вирус кори; 1917 г. — вирус герпеса; 1926 г. — вирус везикулярного стоматита. 30-е годы — основным вирусологическим методом, используемым для выделения вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные (белые мыши — для вирусов гриппа, новорожденные мыши — для вирусов Коксаки, шимпанзе — для вируса гепатита B, куры, голуби — для онкогенных вирусов, поросята-гнотобионты — для кишечных вирусов и т. д.). Первым, кто начал систематически использовать лабораторных животных при изучении вирусов, был Пастер, который еще в 1881 г. проводил исследования по инокуляции материала от больных бешенством в мозг кролика. Другая веха — работы по изучению желтой лихорадки, следствием которых явилось использование в вирусологической практике новорожденных мышей. Кульминацией этого цикла работ стало выделение Сайклзом в 1948 г. на мышах-сосунках группы вирусов эпидемической миалгии. 1931 г. — в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза, саркомы кур и некоторым другим вирусам. И в настоящее время куриные эмбрионы широко используются для выделения вирусов гриппа. 1932 г. — английский химик Элфорд создает искусственные мелкопористые коллоидные мембраны — основу для метода ультрафильтрации, с помощью которого стало возможным проводить определение размера вирусных частиц и дифференцировать вирусы по этому признаку. 1935 г. — применение метода центрифугирования дало возможность кристаллизации вируса табачной мозаики. В настоящее время методы центрифугирования и ультрацентрифугирования (ускорение на дне пробирки превышает 200000 g) широко используются для выделения и очистки вирусов. В 1939 г. для изучения вирусов впервые был применен электронный микроскоп, обладающий разрешающей способностью 0,2-0,3 нм. Использование ультратонких срезов тканей и метода негативного контрастирования водных суспензий позволило проводить изучение взаимодействия вирусов с клеткой и исследовать структуру (архитектуру) вирионов. Сведения, полученные с помощью электронного микроскопа, были значительно расширены с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов и псевдокристаллов вирусов. Совершенствование электронных микроскопов завершилось созданием сканирующих микроскопов, позволяющих получать объемные изображения. С использованием метода электронной микроскопии изучена архитектура вирионов, особенности их проникновения в клетку хозяина. В этот период была открыта основная масса вирусов. В качестве примера могут быть приведены следующие: 1931 г. — вирус гриппа свиней и вирус западного энцефаломиелита лошадей; 1933 г. — вирус гриппа человека и вирус восточного энцефаломиелита лошадей; 1934 г. — вирус паротита; 1936 г. — вирус рака молочной железы мышей; 1937 г. — вирус клещевого энцефалита. 40-е годы. В 1940 г. Хогланд с коллегами установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. 1941 г. — американский ученый Херст на модели вируса гриппа открыл феномен гемагглютинации (склеивания эритроцитов). Это открытие легло в основу разработки методов выявления и идентификации вирусов и способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой. Принцип гемагглютинации положен в основу ряда методов: РГА — реакция гемагглютинации — применяется для обнаружения и титрования вирусов; РТГА — реакция торможения гемагглютинации — применяется для идентификации и титрования вирусов. 1942 г. — Херст устанавливает наличие у вируса гриппа фермента, который позднее идентифицирован как нейраминидаза. 1949 г. — открытие возможности культивирования клеток животных тканей в искусственных условиях. В 1952 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием, давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита, паротита, кори и краснухи. Открыты вирусы: 1945 г. — вирус Крымской геморрагической лихорадки; 1948 г. — вирусы Коксаки. 50-е годы. В 1952 г. Дульбекко разрабатывает метод титрования бляшек в монослое клеток эмбриона цыпленка, что позволило ввести в вирусологию количественный аспект. 1956-62 гг. Уотсон, Каспар (США) и Клуг (Великобритания) разрабатывают общую теорию симметрии вирусных частиц. Структура вирусной частицы стала одним из критериев в системе классификации вирусов. Этот период характеризовался значительными достижениями в области бактериофагов: а) установлена индукция профага лизогенизирующих фагов (Львов и др., 1950 г.); б) доказано, что инфекционность присуща фаговой ДНК, а не белковой оболочке (Херши, Чейз, 1952 г.); в) открыто явление общей трансдукции (Циндер, Ледерберг, 1952 г.). Кроме того, реконструирован инфекционный вирус табачной мозаики (Френкель-Конрад, Вильяме, Сингер, 1955-57 гг.), в 1955 г. получен в кристаллическом виде вирус полиомиелита (Шаффер, Шверд, 1955 г.); открыты вирусы: 1951 г. — вирусы лейкоза мышей и ECHO; 1953 г. — аденовирусы; 1954 г. — вирус краснухи; 1956 г. — вирусы парагриппа, цитомегаловирус, респираторно-синцитиальный вирус; 1957 г. — вирус полиомы; 1959 г. — вирус аргентинской геморрагической лихорадки. 60-е и последующие годы характеризуются расцветом молекулярно-биологических методов исследования. Достижения в области химии, физики, молекулярной биологии и генетики легли в основу методической базы научных исследований, которые стали применяться не только на уровне методик, но и целых технологий, где вирусы выступают не только как объект исследований, но и как инструмент. Ни одно открытие молекулярной биологии не обходится без вирусной модели. 1967 г. — Катес и МакАуслан демонстрируют присутствие в вирионе осповакцины ДНК-зависимой РНК-полимеразы. В следующем году обнаруживается РНК-зависимая РНК-полимераза у реовирусов, а затем у парамиксо- и рабдовирусов. В 1968 г. Якобсон и Балтимор устанавливают наличие у полиовирусов геномного белка, соединенного с РНК, Балтимор и Бостон устанавливают, что геномная РНК полиовируса транслируется в полипротеин. Открыты вирусы: 1960 г. — риновирусы; 1963 г. — австралийский антиген (HBsAg).
жүктеу/скачать 12.91 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|
