Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
Работа 9. Определение активности амилазы
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Работа 10. Определение активности аланинтрансаминазы методом Райтмана–Френкеля
| Работа 9. Определение активности амилазы
по Вольгемуту Метод определения активности амилазы по Вольгемуту основан на нахождении максимального разведения слюны, при котором происходит полное расщепление крахмала. За единицу активности амилазы принима- ют количество фермента, необходимое для расщепления 1 мл крахмала за 30 мин при 37ºС. Амилазная активность слюны выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведен- ной слюны при температуре 37 ºС в течение 30 мин. В норме амилазная ак- тивность слюны (А 37 30 ) равна 160–320 единиц Вольгемута. Ход исследования В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую пробирку добавляют 1 мл слюны, предварительно разведенной в 10 раз (1 мл слюны + 9 мл воды). Содержимое первой пробирки хорошо переме- шивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку, вновь хорошо пере- мешивают и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т.д. Из 10-й про- бирки 1 мл смеси выбрасывают. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл крахмала (из бюретки, начиная с последней пробирки!). Содержимое перемешивают и пробирки помещают в термостат при темпе- ратуре 37º С на 30 мин. Потом пробирки вынимают, охлаждают и добав- ляют по 1 капле реактива Люголя, перемешивают. Жидкость в пробирках окрашивается в желтый, красный, синий цвета. Отмечают последнюю про- бирку, в которой прошел полный гидролиз крахмала (желтый цвет). Рас- считывают разведение слюны в данной пробирке, например, 1/160, а затем ведут расчет амилазной активности слюны: 1/160 мл слюны катализирует превращение 2 мл крахмала 1 мл слюны х мл крахмала Отсюда: х = 2 160 = 320 единиц Вольгемута. Работа 10. Определение активности аланинтрансаминазы методом Райтмана–Френкеля Аланинтрансаминаза (АлТ) катализирует реакцию переноса амино- группы с аланина на α-кетоглутаровую кислоту, в результате образуются пировиноградная кислота (ПВК) и глутаминовая кислота. Образовавшаяся ПВК при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгид- разином (2,4-ДНФГ) в щелочной среде образует окрашенный гидразон. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента. аланин + -кетоглутарат ПВК + глутамат 26 Ход исследования В две пронумерованные пробирки (1 – опытная проба; 2 – холостая проба) вносят по 0,5 мл субстратного раствора, содержащего аланин и -кетоглутарат. Затем в пробирку 1 добавляют 0,1 мл сыворотки крови и обе пробирки инкубируют при 37 о С в течение 30 мин. После этого в пробирку 1 вносят 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, а в про- бирку 2 – 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ и 0,1 мл сыворотки крови, перемеши- вают. Пробирки оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Затем в обе пробирки наливают по 5 мл 0,4 Н раствора NaOH, тщательно переме- шивают и оставляют на 10 мин. Опытную пробу фотометрируют при 500 – 560 нм в кювете с толщи- ной светопоглощающего слоя 10 мм против холостой пробы. Расчет ак- тивности АлТ в сыворотке крови производят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика: из стандартного раствора ПВК (88 мкг/мл или 1 мкмоль/мл) готовят в соответствии с таблицей ряд разве- дений: №№ про- бирок Объем стандарт- ного раствора ПВК, мл Вода, мл Содержание ПВК Экстинкция, отн. ед Активность фермента АлТ, нM/с л мкг мкмоль 1 0,05 0,55 4,4 0,05 278 2 0,1 0,5 8,8 0,1 556 3 0,15 0,45 13,2 0,15 834 4 0,2 0,4 17,6 0,2 1112 5 0,25 0,35 22,0 0,25 1390 Затем берут 5 пронумерованных чистых пробирок, вносят в них по 0,5 мл субстратного раствора и по 0,1 мл растворов ПВК различных кон- центраций (см. таблицу). Далее с этими пробирками поступают так же, как с опытной пробой (см. ход исследования) – нагревают, добавляют раство- ры ДНФГ и NaOH, фотометрируют. По результатам измерения строят график зависимости экстинкции (ось Y) от содержания ПВК в микромолях (ось Х). Расчет активности фермента: активность АлТ выражают в нано- молях ПВК, образовавшейся в ходе реакции за 1 с в расчете на 1 л сыво- ротки крови (нмоль/с л) 3 3 *10 , * *10 m A t V где А – активность фермента в нмоль/с л; m – количество ПВК, образовавшейся в ходе реакции, опреде- ляемое по калибровочному графику, мкмоль; 10 3 – коэффициент для пересчета мкмоль в нмоль; 27 t – время протекания реакции (30 мин); 60 – коэффициент для пересчета минут в секунды; V – объем исследуемой сыворотки крови (0,1 мл); 10 –3 – коэффициент для пересчета миллилитров в литры. жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|