Эрик Ричард Кандель в поисках памяти

17. Долговременная память

Размышляя над результатами генетических исследований бактерий, Франсуа Жакоб выделил две разновидности научной работы: дневную и ночную. Дневная наука рациональна, логична и прагматична и движется вперед за счет строго спланированных экспериментов. «Дневная наука использует умозаключения, сцепленные друг с другом как шестерни, и получает результаты, полагаясь на силу определенности», — писал Жакоб. Ночная, напротив, «представляет собой мастерскую возможного, где вырабатываются будущие строительные материалы науки. Где гипотезы принимают форму смутных предчувствий, неясных ощущений».

К середине восьмидесятых я почувствовал, что наши исследования кратковременной памяти у аплизии приближаются к границе, за которой начинается дневная наука. Нам удалось найти нейроны и синапсы, обеспечивающие простые определяемые обучением реакции у аплизии, и установить, что кратковременная память в ходе обучения формируется за счет временных изменений силы существующих синаптических связей между сенсорными нейронами и мотонейронами. Эти кратковременные изменения обеспечиваются белками и другими веществами, уже имеющимися в синапсе. Мы выяснили, что циклический АМФ и протеинкиназа А усиливают выделение глутамата окончаниями сенсорных нейронов и что его усиленное выделение служит ключевым элементом формирования кратковременной памяти. Короче говоря, аплизия давала нам экспериментальный объект, молекулярными компонентами которого мы могли осмысленно манипулировать.

Но оставалась еще одна тайна молекулярной биологии хранения памяти — как кратковременные воспоминания преобразуются в устойчивые долговременные. Эта тайна стала для меня предметом ночной науки: мечтательных размышлений, не связанных друг с другом мыслей и многомесячных раздумий о том, как искать решение проблемы с помощью экспериментов дневной науки.

Мы с Джимми Шварцем установили, что формирование долговременной памяти зависит от синтеза новых белков. Мне интуитивно казалось, что истоки долговременной памяти, в которой задействованы длительные изменения синаптической силы, нужно искать в изменениях генетического аппарата сенсорных нейронов. Последовать этому смутному замыслу значило увести наши исследования формирования памяти еще дальше в молекулярные лабиринты нейрона — в клеточное ядро, где находятся гены и где регулируется их активность.

Во время ночных размышлений я мечтал о том, чтобы сделать следующий шаг, воспользовавшись недавно разработанными методами молекулярной биологии, чтобы прислушаться к диалогу между генами сенсорных нейронов и их синапсами. Время для этого шага было самое благоприятное. К 1980 году молекулярная биология стала главной объединяющей силой в биологии. Вскоре ей предстояло распространить влияние на нейробиологию и принять участие в создании новой науки о психике.

Идеи Шредингера привлекли внимание физиков и привели некоторых из них в биологию. Кроме того, его идеи помогли превратить биохимию, одну из ключевых биологических наук, из дисциплины, занимающейся ферментами и преобразованиями энергии (то есть тем как клетки ее получают и используют), в дисциплину, занимающуюся преобразованиями информации (тем, как она копируется, передается и видоизменяется в клетках) Тогда стала ясна важность хромосом и генов как носителей биологической информации. К 1949 году стало понятно, что у ряда неврологических заболеваний, таких как хорея Хантингтона и болезнь Паркинсона, а также у некоторых психических заболеваний, в том числе у шизофрении и депрессии, есть генетические компоненты. Природа гена стала ключевым вопросом всей биологии, в том числе и для нейробиологии.

Какова природа генов? Из чего они состоят? В 1944 году Освальд Эвери, Маклин Маккарти и Колин Маклауд из Рокфеллеровского института совершили прорыв в этой области, установив, что гены состоят не из белков, как думали многие биологи, а из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Девять лет спустя в номере журнала Nature от 25 апреля 1953 года Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик описали свою ставшую теперь классической модель структуры ДНК. С помощью рентгеновских снимков, сделанных специалистами по структурной биологии Розалиндой Франклин и Морисом Уилкинсом, Уотсон и Крик пришли к выводу, что ДНК состоит из двух длинных цепочек, завитых относительно друг друга в форме спирали. Зная, что каждая из цепочек этой двойной спирали составлена из маленьких повторяющихся звеньев четырех типов — так называемых нуклеотидов (аденина, тимина, гуанина и цитозина), Уотсон и Крик предположили, что с помощью них и записана содержащаяся в генах информация. Это предположение привело их к поразительному открытию, что две цепочки ДНК комплементарны, то есть каждый нуклеотид одной цепочки образует пару со строго определенным нуклеотидом другой: аденин (А) связывается только с тимином (Т), а гуанин (Г) — только с цитозином (Ц). Такие связи нуклеотидов по всей длине обеих цепочек и соединяют эти цепочки друг с другом.

Открытие Уотсона и Крика подвело молекулярную базу под идеи Шредингера и положило начало молекулярной биологии. В основе работы генов, как отмечал Шредингер, лежит репликация (копирование). Классическая статья Уотсона и Крика завершалась предложением, которое стало знаменитым: «От нашего внимания не ускользнуло, что постулированные нами специфические парные связи позволяют сразу предположить механизм копирования генетического материала».

Модель двойной спирали показывает, как реплицируются гены. Когда во время репликации две цепочки ДНК расплетаются, каждая материнская цепочка служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепочки. Содержащая информацию последовательность, в которой расположены нуклеотиды в материнской цепочке, определяет последовательность нуклеотидов в дочерней: А будет связываться с Т, а Г — с Ц. Впоследствии дочерняя цепочка может служить матрицей для синтеза следующей, новой цепочки. Этот механизм позволяет достоверно копировать ДНК перед делением клетки, чтобы дочерним клеткам доставались копии ДНК материнской. Он работает во всех клетках организма, в том числе в сперматозоидах и яйцеклетках, тем самым обеспечивая воспроизводство организма и передачу генетической информации из поколения в поколение.

Отталкиваясь от механизма репликации генов, Уотсон и Крик также предположили возможный механизм синтеза белков. Из того, что каждый ген управляет синтезом какого-то определенного белка, они сделали вывод, что последовательность нуклеотидов в каждом гене кодирует соответствующий белок. Для синтеза белков, как и для репликации генов, эта закодированная информация считывается путем создания комплементарной копии участка цепочки ДНК. Но при синтезе белков, как показали дальнейшие исследования, эту информацию переносит вспомогательная молекула так называемой информационной РНК (рибонуклеиновой кислоты). Как и ДНК, информационная РНК — это нуклеиновая кислота, состоящая из нуклеотидов четырех типов. Три из них (аденин, гуанин и цитозин) соответствуют нуклеотидам ДНК, а четвертый (урацил) входит только в состав РНК, вместо тимина. Для синтеза белка две цепочки ДНК в пределах одного гена отходят друг от друга, и информация с одной из них копируется на информационную РНК. Затем последовательность нуклеотидов информационной РНК считывается, и в соответствии с ней синтезируется белок. Так Уотсон и Крик ²⁷сформулировали центральную догму молекулярной биологии: на матрице ДНК синтезируется РНК, а на матрице РНК синтезируется белок.

Следующим шагом должна была стать расшифровка генетического кода, то есть выяснение тех правил, по которым последовательность нуклеотидов в молекулах информационной РНК преобразуется в последовательность аминокислот в белках — в том числе в белках, задействованных в хранении памяти. Первые серьезные попытки расшифровать этот код были сделаны в 1956 году, когда Фрэнсис Крик и Сидней Бреннер попытались ответить на вопрос, как с помощью четырех нуклеотидов могут быть закодированы двадцать аминокислот, из которых состоят молекулы белков. Если бы соответствие было один к одному, то есть каждый нуклеотид кодировал бы одну аминокислоту, это позволяло бы закодировать только четыре аминокислоты. Если бы каждой аминокислоте соответствовала определенная пара нуклеотидов, это позволяло бы закодировать шестнадцать аминокислот. Но чтобы закодировать двадцать разных аминокислот, как было показано Бреннером, система должна быть основана на триплетах, то есть на разных сочетаниях из трех нуклеотидов. Однако таких сочетаний не двадцать, а шестьдесят четыре. Поэтому Бреннер предположил, что код, основанный на триплетах, вырожден (избыточен), то есть одну и ту же аминокислоту могут кодировать разные триплеты нуклеотидов.

В 1961 году Бреннер и Крик доказали, что генетический код представляет собой последовательность нуклеотидных триплетов, каждый из которых служит инструкцией для включения в белок строго определенной аминокислоты. Но они не еще не знали, какие триплеты соответствуют каждой аминокислоте. В тот же год, но позже это выяснили Маршалл Ниренберг из Национальных институтов здоровья и Хар Гобинд Корана из Висконсинского университета. Они проверили концепцию Бреннера и Крика биохимическими методами и расшифровали генетический код, установив, какие комбинации нуклеотидов кодируют каждую аминокислоту.

В конце семидесятых Уолтер Гилберт из Гарварда и Фредерик Сэнгер из Кембриджа разработали новый биохимический метод, позволяющий сравнительно легко секвенировать ДНК, то есть считывать последовательность нуклеотидов в отрезках цепочек ДНК и тем самым определять, какой белок кодируется тем или иным геном. Это был огромный шаг вперед. Он позволил ученым узнать что в разных генах имеются одни и те же последовательности, кодирующие одинаковые или похожие участки молекул многих разных белков. Эти узнаваемые участки, которые назвали доменами, выполняют одни и те же биологические функции независимо от того, в состав какого белка входят. Таким образом, ученые получили возможность по некоторым последовательностям нуклеотидов, входящих в состав гена, определять отдельные функции белка, кодируемого этим геном, например, будет ли это киназа, ионный канал или рецептор. Кроме того, появилась возможность, сравнивая последовательности аминокислот в молекулах разных белков, выявлять черты сходства белков, работающих в разных системах, например в разных клетках тела и даже в непохожих друг на друга организмах.

Эти последовательности и их сравнение позволили ученым описать принципиальные механизмы работы клеток и передачи сигналов между ними, тем самым заложив концептуальные основы для изучения множества явлений живой природы. В частности, такие исследования в очередной раз показали, что разные клетки и даже разные организмы состоят из одного и того же материала. У всех многоклеточных организмов имеется фермент, синтезирующий циклический АМФ, а также киназы, ионные каналы и так далее. Более того, половина генов, работающих у человека, есть и у намного проще устроенных беспозвоночных животных, таких как червь Caenorhabditis elegans, муха дрозофила и моллюск аплизия. Геном мышей содержит больше 90 %, а геном высших обезьян — около 98 % кодирующих последовательностей, общих с человеческим геномом.

После методов секвенирования ДНК важнейшим достижением молекулярной биологии, которое и привело меня в эту науку, была разработка метода рекомбинантной ДНК и методов клонирования генов, позволяющих идентифицировать и определять функции отдельных генов, в том числе работающих в мозгу. Первый этап этих методов состоит в том, чтобы выделить из клеток человека, мыши или моллюска ген, который мы хотим исследовать, то есть отрезок ДНК, кодирующий определенный фермент. Это можно сделать, выяснив положение гена в хромосоме и вырезав его из хромосомы молекулярными ножницами — ферментами, разрезающими ДНК в соответствующих местах.

Следующий этап состоит в том, чтобы сделать много копий этого гена (процедуру называют клонированием генов). При клонировании концы вырезанного гена присоединяют к отрезкам ДНК другого организма, например бактерии, создавая так называемую рекомбинантную ДНК: рекомбинантную — потому что присоединение гена, вырезанного из ДНК одного организма, к ДНК другого организма — это перекомпоновка (рекомбинация) молекул ДНК. Геном бактерии удваивается каждые двадцать минут, в результате чего мы получаем множество одинаковых копий исходного гена. Заключительный этап состоит в том, чтобы найти белок, кодируемый этим геном, чего можно достичь с помощью прочтения последовательности нуклеотидов, то есть молекулярных элементов, из которых состоит ген.

В 1972 году Полу Бергу из Стэнфордского университета удалось получить первую рекомбинантную молекулу ДНК, а в 1973 году Герберт Бойер из Калифорнийского университета в Сан-Франциско и Стэнли Коэн из Стэнфордского университета усовершенствовали методику Берга и разработали процедуру клонирования генов. К 1980 году Бойер сумел внедрить ген человеческого инсулина в бактерию.

Это достижение позволило получать человеческий инсулин в неограниченных количествах и положило начало биотехнологической промышленности. Джим Уотсон, один из первооткрывателей структуры ДНК, сравнил эти методы с игрой в бога: «Мы хотели научиться делать то, что теперь позволяют делать текстовые редакторы: вырезать, вставлять и копировать ДНК <…> после того, как нам удалось расшифровать генетический код. <…> Однако несколько открытий, сделанных в конце шестидесятых и в семидесятые годы, счастливо совместились в 1973 году в метод так называемой „рекомбинантной ДНК“, позволяющий редактировать молекулы ДНК. Это был не просто шаг вперед в разработке лабораторных методов. Ученые вдруг получили возможность по-своему кроить ДНК, создавая молекулы, которых никогда не бывало в природе. Мы получили возможность „играть в бога“ с молекулярными основами всего живого».

Вскоре эти замечательные открытия и орудия, применявшиеся ранее для изучения генов и функций белков у бактерий, дрожжей и разных клеток животных, с радостью взяли на вооружение нейробиологи, особенно я, чтобы исследовать с их помощью работу нервной системы. У меня не было никакого опыта использования этих методов — для меня все это была ночная наука. Но даже ночью я отчетливо видел огромные возможности молекулярной биологии.