Эрик Ричард Кандель в поисках памяти

18. Гены памяти

Три события должны были сойтись, чтобы мой план применить молекулярно-биологические методы для исследования памяти вышел из ночной науки в дневную. Первым был переход в 1974 году в Колледж терапевтов и хирургов Колумбийского университета на место моего учителя Гарри Грундфеста, уходившего на пенсию. Колумбийский университет привлекал меня тем, что это великое учебное заведение с замечательными традициями в области научной медицины, особенно продвинутое в таких областях, как неврология и психиатрия. Основанный как Королевский колледж в 1754 году, он был пятым по счету и первым готовящим врачей университетом на территории Соединенных Штатов. Определяющим фактором для моего решения стало то, что Дениз уже была сотрудницей Колледжа терапевтов и хирургов и мы с ней купили дом в Ривердейле, потому что он находился поблизости от университетского кампуса. Поэтому перейдя из Нью-Йоркского университета в Колумбийский, я стал намного быстрее добираться до работы, а мы с Дениз получили возможность работать в одном университете, но независимо друг от друга.

С моим переходом в Колумбийский университет было связано второе событие — начало сотрудничества с Ричардом Акселем (рис. 18–1). На первом этапе моей карьеры биолога моим наставником был Гарри Грундфест, побудивший меня заняться исследованиями работы нервной системы на клеточном уровне. На втором этапе моим проводником был Джимми Шварц, вместе с которым мы изучали биохимию кратковременной памяти. На третьем же этапе похожую роль предстояло сыграть Ричарду Акселю, совместная работа с которым позволила мне сосредоточиться на том, как диалог между генами нейрона и его синапсами обеспечивает формирование кратковременной памяти.

18–1. Ричард Аксель (р. 1946). с которым я подружился в первые годы совместной работы в Колумбийском университете. Благодаря нашему научному сотрудничеству я научился методам молекулярной биологии, а Ричард занялся нервной системой. В 2004 году Ричард и его коллега Линда Бак (р. 1947), работавшая у него постдоком, получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за свои классические исследования обоняния. (Из архива Эрика Канделя).
Мы с Ричардом познакомились в 1977 году на заседании комиссии по приему сотрудников на постоянную работу. В конце этого заседания он подошел ко мне и сказал: «Мне надоело без конца заниматься клонированием генов. Я хочу заняться чем-нибудь, связанным с нервной системой. Нам надо поговорить и, может быть, сделать что-то по молекулярной биологии ходьбы». Это предложение было далеко не таким наивным и грандиозным, как высказанное мной Грундфесту намерение исследовать биологические основы — «я», «оно» и «сверх-я». Тем не менее я вынужден был сказать Ричарду, что в тот момент ходьба была, вероятно, еще недоступна для молекулярно-биологических исследований. По-видимому, более посильной задачей было бы исследовать какую-то простую поведенческую реакцию у аплизии, например втягивание жабр, выделение чернильной жидкости или откладку яиц.

Когда я лучше познакомился с Ричардом, я быстро оценил, какой он интересный, умный и великодушный человек. Роберт Вайнберг в своей книге об истоках раковых заболеваний превосходно описывает любознательность Ричарда и остроту его ума: «У Акселя, высокого, тощего и сутулого, было яркое угловатое лицо, делавшееся еще ярче благодаря очкам в серебристой оправе, в которых он всегда ходил. Аксель <…> позволил мне открыть так называемый „синдром Акселя“, который я изучил путем тщательных наблюдений и затем при случае описывал сотрудникам своей лаборатории. Я впервые обратил внимание на этот синдром во время нескольких научных заседаний, на которых Аксель присутствовал в качестве слушателя. Он садился в первом ряду и внимательно вслушивался в каждое слово, доносившееся с кафедры. Затем он задавал глубокие, проницательные вопросы, которые формулировал медленно, с расстановкой, произнося каждый слог отчетливо и внятно. Его вопросы неизменно проникали в самую суть доклада, вскрывая слабые места в данных или доводах докладчика. Перспектива получить от Акселя каверзный вопрос очень нервировала тех, у кого не все было в порядке с собственными научными результатами».

На самом деле очки у Акселя были в золотистой оправе, но в остальном это очень меткое описание. Помимо добавления «синдрома Акселя» в анналы науки Ричард внес весомый вклад в методологию работы с рекомбинантной ДНК. Он разработал общий метод внедрения любого гена в любую клетку в тканевой культуре. Этот метод, названный котрансфекцией, широко используется как в научных исследованиях, так и в фармацевтике для производства лекарств.

Ричард, как и я, был опероманом, и вскоре после того, как мы с ним подружились, мы стали вместе ходить в оперу, причем всегда без билетов. Во время первого такого похода мы попали на вагнеровскую «Валькирию». Ричард настоял на том, чтобы мы вошли в театр через нижний вход, связанный с гаражом. Билетер, проверявший билеты у этого входа, сразу узнал Ричарда и пропустил нас. Мы прошли к первым рядам партера и стояли у стенки, пока не начал гаснуть свет. Тогда к нам подошел другой билетер, который тоже узнал Ричарда, когда мы вошли, и указал два свободных места. Ричард незаметно передал ему какие-то деньги, причем наотрез отказался сообщить мне сколько. Это был чудесный спектакль, но время от времени меня прошибал холодный пот при мысли, что на следующий день я увижу в «Нью-Йорк таймс» заголовок: «Два профессора Колумбийского университета пробрались в Метрополитен-опера без билета».

Вскоре после начала нашего сотрудничества Ричард спросил людей, работавших в его лаборатории: «Кто-нибудь хочет учиться нейробиологии?» Такое желание изъявил только Ричард Шеллер, который стал нашим общим постдоком. Шеллер оказался для нас очень ценным приобретением: он был человеком творческим и смелым, о чем говорило его добровольное решение заняться нервной системой. Кроме того, он хорошо разбирался в генной инженерии: внес существенный вклад в методологию этой области, еще будучи аспирантом, и охотно помогал мне учиться молекулярной биологии.

Когда мы с Ирвингом Купферманом исследовали роль различных клеток и их групп в поведении аплизии, мы нашли две симметричные группы нейронов, каждый из которых содержит около двухсот одинаковых клеток, которые мы назвали пазушными клетками (bag cells). Ирвинг обнаружил, что пазушные клетки выделяют гормон, стимулирующий откладку яиц — инстинктивную, устойчивую форму сложного поведения. Яйца аплизии упакованы в длинные желеобразные шнуры, в каждом из которых содержится миллион или больше яиц. В ответ на действие гормона откладки яиц аплизия выделяет яйцевой шнур из отверстия половой системы, расположенного рядом с головой. При этом у нее повышаются частота сердцебиения и интенсивность дыхания. Затем она подхватывает выходящий яйцевой шнур ртом и двигает головой взад и вперед, вытягивая его из полового протока, скатывает в шарик и закрепляет на камне или какой-нибудь водоросли.

Шеллеру удалось выделить ген, управляющий откладкой яиц, и показать, что ген кодирует пептидный гормон, то есть короткую цепочку аминокислот, и экспрессируется в пазушных клетках. Шеллер синтезировал этот гормон, ввел его аплизии и пронаблюдал за тем, как тот запускает ритуал откладки яиц животного. Это было необычайное достижение, потому что оно показывало, что одна короткая цепочка аминокислот может запускать сложную последовательность поведенческих реакций. Наши с Акселем и Шеллером совместные исследования молекулярной биологии такой сложной формы поведения, как откладка яиц, привели их обоих в нейробиологию и укрепили мое стремление проникнуть еще дальше в лабиринты молекулярной биологии.

Наши исследования обучения и памяти, проведенные в начале семидесятых, связали клеточную нейробиологию с обучением простой форме поведения. Моя совместная работа с Шеллером и Акселем, которая началась в конце семидесятых, убедила и меня, и Акселя, что молекулярная биология, нейробиология и психология могут соединиться и образовать новую молекулярную науку о поведении. Мы высказали это во введении к нашей первой статье о молекулярной биологии откладки яиц: «На материале аплизии мы описываем удобную экспериментальную систему для исследования структуры, экспрессии и модуляции генов, кодирующих пептидный гормон, обладающий известной поведенческой функцией».

В ходе выполнения совместного проекта я познакомился с методами работы с рекомбинантной ДНК, которые сыграли ключевую роль в моих последующих исследованиях долговременной памяти. Кроме того, мое сотрудничество с Акселем положило начало крепкой научной и личной дружбе. Поэтому я был обрадован и не удивлен, когда 10 декабря 2004 года, через четыре года после того, как мои исследования были отмечены Нобелевским комитетом, я узнал, что Ричарду и Линде Бак, в прошлом работавшей у него постдоком, присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине за их выдающиеся работы в области молекулярной нейробиологии. Ричард и Линда вместе сделали поразительное открытие, что в носу мышей имеется около тысячи различных обонятельных рецепторов. Таким огромным набором рецепторов (существования которого никто не предполагал) и объясняется наша способность улавливать тысячи специфических запахов. Это открытие доказало, что значительная часть выполняемого нашей нервной системой анализа запахов осуществляется рецепторами носовой полости. Впоследствии Ричард и Линда независимо использовали эти рецепторы, чтобы продемонстрировать точность связей между нейронами обонятельной системы.

Последнее событие из тех трех, которые помогли мне освоить методы молекулярной биологии и использовать их для изучения памяти, случилось в 1983 году, когда Дональд Фредриксон, недавно назначенный президентом Медицинского института Говарда Хьюза, попросил Шварца, Акселя и меня составить основу группы, занимающейся новой наукой о психике — молекулярной биологией когнитивных функций. Каждая группа ученых, работу которых в университетах и других научных учреждениях страны поддерживает этот институт, называется по месту ее расположения. Так мы стали Медицинским институтом Говарда Хьюза при Колумбийском университете.

Говард Хьюз был творческим и эксцентричным человеком — промышленником, продюсером фильмов, конструктором и пилотом самолетов, на которых он участвовал в соревнованиях. От своего отца он унаследовал значительную долю акций компании Hughes Tool Company и построил на ее основе промышленную империю. В рамках этой производившей инструменты компании он организовал авиастроительное отделение, Hughes Aircraft Company, ставшее одним из основных подрядчиков Министерства обороны. В 1953 году он передал эту компанию Медицинскому институту Говарда Хьюза — научно-исследовательскому медицинскому учреждению, которое только что основал. К 1984 году; через восемь лет после его смерти, институт стал крупнейшей частной организацией, поддерживающей биомедицинские исследования в Соединенных Штатах. К 2004 году институтский фонд превысил и млрд долларов, институт поддерживал 350 исследователей во множестве университетов Соединенных Штатов. Около ста из этих ученых были членами Национальной академии наук, а десять — лауреатами Нобелевской премии.

Девиз Медицинского института Говарда Хьюза — «Люди, а не проекты». В институте убеждены, что наука процветает тогда, когда выдающимся исследователям предоставляют как ресурсы, так и интеллектуальную свободу для выполнения смелых, передовых работ. В 1983 году в институте стартовали три инициативы: в областях нейробиологии, генетики и регуляции обмена веществ. Меня пригласили на должность старшего исследователя нейробиологической инициативы, и обеспеченные мне институтом возможности сыграли огромную роль как в моей научной карьере, как и в карьере Ричарда Акселя.

Новообразованный институт дал нам возможность нанять Тома Джесселла и Гэри Струла из Гарварда и убедить остаться Стивена Зигельбаума, который собирался уходить из Колумбийского университета. Это были чудесные кадры для нашей хьюзовской группы и Центра нейробиологических и поведенческих исследований. Джесселл вскоре стал ведущим специалистом по развитию нервной системы позвоночных. Серия проведенных им блестящих исследований позволила выявить гены, обеспечивающие индивидуальные особенности разных нейронов спинного мозга (тех самых, которыми занимались Шеррингтон и Экклс). Затем он показал, что эти гены также управляют вырастанием аксонов и образованием синапсов. Зигельбаум успешно использовал свои замечательные открытия, связанные с ионными каналами, для изучения того, как каналы управляют возбудимостью нейронов и силой синаптических связей и как то и другое модулируется в результате работы и под действием различных модуляторных нейромедиаторов. Струл разработал оригинальный генетический подход к работе с дрозофилой, позволяющий изучать, как в ходе развития этой плодовой мухи формируется строение ее тела.
Теперь, имея в распоряжении методы молекулярной биологии и финансирование Медицинского института Говарда Хьюза, мы могли заняться проблемами генов и памяти. Моя экспериментальная стратегия начиная с 1961 года состояла в том, чтобы улавливать простые формы памяти в наименьших возможных популяциях нейронов и использовать множество микроэлектродов для отслеживания активности задействованных клеток. Мы научились регистрировать сигналы отдельных сенсорных нейронов и мотонейронов в течение нескольких часов у интактного животного, что прекрасно подходило для исследования кратковременной памяти. Но для работы с долговременной памятью нам нужна была возможность регистрировать такие сигналы в течение дня или нескольких дней. Для этого требовался новый подход, и я обратился к тканевым культурам сенсорных нейронов и мотонейронов.

Сенсорные нейроны и мотонейроны нельзя просто так извлечь из взрослого организма и выращивать в лаборатории, потому что зрелые нейроны плохо выживают в культуре. Вместо этого нейроны нужно извлекать из нервной системы очень молодых животных и обеспечивать им среду, в которой они могут вырасти в зрелые клетки. Важнейший шаг в этом направлении сделал наш аспирант Арнольд Кригштейн. Перед самым переходом лаборатории в Колумбийский университет Кригштейн научился выращивать аплизий в лабораторных условиях от эмбриональной стадии, заключенной в яйце, до взрослого организма, чего биологам не удавалось добиться на протяжении почти ста лет.

Мы обнаружили, что непродолжительное однократное введение серотонина на несколько минут усиливает синаптическую связь сенсорного нейрона с мотонейроном, увеличивая выделение серотонина сенсорной клеткой. Как и у интактного животного, это кратковременное усиление синаптической связи представляет собой функциональное изменение и не требует синтеза новых белков. Пятикратное введение серотонина, имитирующее пятикратный удар током, напротив, усиливает синаптическую связь на несколько дней и приводит к отрастанию новых синаптических связей, то есть вызывает анатомические изменения, требующие синтеза новых белков (рис. 18–4). Этот результат показывал, что мы можем вызывать образование новых синапсов у сенсорного нейрона, растущего в культуре, но нам по-прежнему нужно было выяснить, какие белки задействованы в формировании долговременной памяти.

Жакоб и Моно высказали предположение, известное нам теперь как факт, что даже у сложных организмов, таких как человеческий, почти каждый ген, входящий в состав генома, присутствует в каждой клетке тела. У каждой клетки в ядре содержатся все хромосомы организма, а значит, и все гены, необходимые для развития этого организма. Из чего следовал принципиальный для биологии вопрос: почему гены не функционируют одинаково в каждой клетке тела? Жакоб и Моно выдвинули гипотезу, которая в итоге полностью подтвердилась, что клетка печени является клеткой печени, а клетка мозга — клеткой мозга потому, что в клетках каждого типа включены (экспрессируются) только некоторые из генов, а все остальные выключены (репрессированы). Поэтому клетки каждого типа содержат собственный неповторимый набор белков — подмножество всех белков, которые в принципе могут синтезировать клетки организма. Этот набор белков и позволяет клеткам выполнять особенные биологические функции.

Гены включаются и выключаются по мере надобности, обеспечивая оптимальную работу всей клетки. Некоторые остаются выключенными на протяжении большей части жизни организма, другие, например задействованные в выработке энергии, всегда включены, потому что кодируемые ими белки жизненно важны для клетки. Но в клетках каждого типа одни гены экспрессируются лишь в определенное время, а другие включаются и выключаются в ответ на сигналы, поступающие из самого организма или из окружающей среды. Из этих доводов у меня в голове однажды вечером родилась светлая мысль: что есть обучение, как не набор сенсорных сигналов, поступающих из окружающей среды, так что сенсорные сигналы разного типа (или поступающие в разной последовательности) обеспечивают разные формы обучения?

Какие сигналы регулируют работу генов? Каким образом гены включаются и выключаются? Жакоб и Моно установили, что у бактерий гены включаются и выключаются другими генами. В связи с этим они выделили две разновидности генов: структурные и регуляторные. Структурные гены кодируют функциональные белки, определяющие структуру и функции клетки, такие как ферменты и ионные каналы. Регуляторные гены кодируют так называемые регуляторные белки, которые включают и выключают структурные гены. Затем Жакоб и Моно задались вопросом, как регуляторные белки действуют на структурные гены. Они предположили, что на отрезке ДНК, где находится каждый структурный ген, имеется не только участок, который кодирует определенный белок, но и регуляторный участок — особое место, которое теперь называют промотором. Регуляторные белки связываются с промоторами структурных генов, тем самым определяя, будет ли данный структурный ген включен или выключен.

Чтобы структурный ген мог включиться, регуляторные белки должны собраться на его промоторе и помочь отделить друг от друга две цепочки ДНК. После этого информация с одной из этих цепочек копируется на информационную РНК. Этот процесс называют транскрипцией. Информационная РНК выносит содержащиеся в гене инструкции для синтеза белка из ядра в цитоплазму клетки, где структуры, называемые рибосомами, синтезируют белок согласно этим инструкциям, осуществляя так называемую трансляцию. После того как с гена считывается записанная в нем информация, две цепочки ДНК снова сцепляются, и ген остается выключенным, пока регуляторные белки снова не запустят его транскрипцию.

Жакоб и Моно не только разработали основы теории регуляции работы генов, но и открыли регуляторные гены, участвующие в этом процессе. Есть две разновидности таких генов: репрессоры, кодирующие регуляторные белки, которые выключают структурные гены, и, как показали последующие исследования, активаторы, кодирующие регуляторные белки, которые включают структурные гены. Путем блестящих рассуждений и остроумных генетических экспериментов Жакоб и Моно выяснили, что, когда в распоряжении обыкновенной бактерии кишечной палочки, живущей у нас в кишечнике, имеется богатый запас одного из источников ее пищи — сахара лактозы, у нее включается ген, который кодирует фермент, позволяющий переваривать лактозу. Когда же лактоза кончается, ген этого пищеварительного фермента внезапно выключается. Как это происходит?

Жакоб и Моно установили, что в отсутствие лактозы ген-репрессор кодирует белок, который связывается с промотором гена пищеварительного фермента, не давая информации считываться с ДНК этого гена. Когда же они вновь добавляли лактозу в среду, на которой выращивали этих бактерий, лактоза входила в клетки и связывалась с белком-репрессором, из-за чего он отпадал от промотора. В результате промотор оставался свободным и мог связываться с белками, кодируемыми геном-активатором. Белки-активаторы включали структурный ген и обеспечивали синтез фермента, позволяющего бактерии усваивать лактозу.

Результаты этих исследований свидетельствовали о том, что кишечная палочка способна подстраивать интенсивность транскрипции генов в соответствии с поступающими извне сигналами. Дальнейшие исследования показали, что, когда эта бактерия оказывается в среде с небольшим содержанием глюкозы, в ней начинается синтез циклического АМФ, который запускает процесс, позволяющий клетке переваривать в первую очередь именно этот, более питательный сахар.

Открытие того, что работа генов может регулироваться в соответствии с потребностями клетки и условиями среды за счет сигнальных молекул, поступающих извне (как молекулы разных сахаров), а также изнутри (как вторичные посредники, например циклический АМФ), произвело революцию в моих мыслях. Оно заставило меня переформулировать в молекулярных терминах вопрос о том, как кратковременная память преобразуется в долговременную. Теперь мой вопрос состоял в том, какова природа регуляторных генов, задействованных в определенных формах обучения, то есть реагирующих на сигналы, поступающие извне, а также в том, как эти регуляторные гены переводят кратковременные синаптические изменения, необходимые для кратковременной памяти, в долговременные синаптические изменения, необходимые для долговременной.

Наши эксперименты, поставленные на беспозвоночных, как и некоторые другие, поставленные на позвоночных, продемонстрировали, что долговременная память требует синтеза новых белков. Эти результаты указывали, что механизмы хранения памяти, судя по всему, похожи у всех животных. Кроме того, Крейг Бейли сделал замечательное открытие, что долговременная память у аплизии сохраняется потому, что сенсорные нейроны отращивают себе новые окончания аксонов, тем самым усиливая свои синаптические связи с мотонейронами. Но по-прежнему оставалось тайной, что именно позволяет переводить какие-то кратковременные воспоминания в долговременную память. Быть может, характер действия раздражителей, вызывающий долговременную сенсибилизацию, делает это за счет активации определенных регуляторных генов, и кодируемые ими белки заставляют структурные гены запустить механизм образования новых окончаний аксона?

Изучая живые сенсорные нейроны и мотонейроны в культуре, мы редуцировали исследуемую нами поведенческую систему в достаточной степени, чтобы заняться этими вопросами. Мы установили, что принципиальный компонент долговременной памяти заключен в синаптической связи между двумя клетками. Теперь мы могли использовать метод рекомбинантной ДНК, чтобы ответить на вопрос, отвечают ли за включение и поддержание долговременного усиления этой связи определенные регуляторные гены.

Примерно в это время мои исследования начали получать официальное признание. В 1983 году я разделил с Верионом Маунткаслом премию Ласкера за фундаментальные медицинские исследования — самую престижную из естественнонаучных премий, присуждаемых в Соединенных Штатах — и получил свою первую почетную степень от Иудейской теологической семинарии в Нью-Йорке. Меня поразило, что там вообще знали о моих исследованиях. Подозреваю, что они узнали о них от моего коллеги Мортимера Остоу — одного из тех психоаналитиков, благодаря которым я заинтересовался связью психоанализа и мозга.

К тому времени мой отец уже умер, но мама пришла на церемонию награждения, где ректор семинарии Герсон Коэн в своей вступительной речи упомянул, что я получил хорошее образование на иврите в Еврейской школе Флэтбуша, и это наполнило гордостью сердце моей мамы. Я думаю, что для нее, быть может, важнее было признание того, что ее отец, мой дедушка, хорошо научил меня ивриту, чем престижная премия Ласкера, которую я получил.

19. Диалог генов и синапсов

В 1985 году представления, к которым я пришел в ходе занятий ночной наукой — многомесячных раздумий о белках, регулирующих экспрессию генов, — наконец нашли применение в моей дневной работе, посвященной экспрессии генов и долговременной памяти. Эти представления стали отчетливее после того, как в Колумбийский университет пришел Филип Гелет, постдок, учившийся в Англии у Сиднея Бреннера в Лаборатории Медицинского исследовательского совета в Кембридже. Мы с Гелетом рассуждали следующим образом: долговременная память требует кодирования новой информации и консолидации, то есть перевода на более постоянное хранение. Установив, что для долговременной памяти требуется отрастание новых синаптических связей, мы получили некоторое представление о том, какую форму имеет это более постоянное хранение. Но мы по-прежнему не разобрались в промежуточных молекулярно-генетических этапах, то есть в самой природе консолидации памяти. Как мимолетные кратковременные воспоминания преобразуются в устойчивые долговременные?

Согласно модели Жакоба и Моно, сигналы из среды, окружающей клетку, могут активировать гены регуляторных белков, которые включают гены, кодирующие определенные структурные белки. Поэтому мы с Гелетом решили узнать, не задействованы ли в ключевом этапе перехода памяти из кратковременной в долговременную при сенсибилизации какие-то аналогичные сигналы и аналогичные регуляторные белки. Мы хотели знать, не потому ли для долговременной памяти при сенсибилизации важно повторение, что оно обеспечивает передачу сигналов в ядро, вызывая активацию генов, кодирующих регуляторные белки, которые, в свою очередь, включают структурные гены, необходимые для отрастания новых синаптических связей. Если так, то консолидационная фаза работы памяти могла оказаться тем интервалом, который требуется регуляторным белкам для включения структурных генов. Тем самым мы предлагали генетическое объяснение того, что блокировка синтеза новых белков на определенном критическом промежутке времени (во время и вскоре после обучения) блокирует и отрастание новых синаптических связей, и преобразование кратковременной памяти в долговременную. Мы предположили, что, блокируя синтез белков, мы препятствуем экспрессии генов, кодирующих белки, необходимые для роста синаптических связей и тем самым для формирования долговременной памяти.

Мы обобщили свои представления в теоретической обзорной статье «Вкратце о долговременной памяти», опубликованной в 1986 году в журнале Nature. В этой статье мы высказали предположение, что если для преобразования связанной с определенным синапсом кратковременной памяти в долговременную требуется экспрессия генов, то синапс в ходе обучения должен посылать в ядро клетки какой-то сигнал, вызывающий включение определенных регуляторных генов. При формировании кратковременной памяти в синапсах используются циклический АМФ и протеинкиназа А, действующие внутри клетки и передающие сигнал, который вызывает выделение большего количества нейромедиатора. Мы с Гелетом выдвинули гипотезу, что при формировании долговременной памяти эта киназа проходит путь от синапса до ядра, где каким-то образом активирует белки, регулирующие экспрессию генов.

Чтобы проверить гипотезу, нам нужно было определить, какой сигнал поступает от синапса в ядро, найти регуляторные гены, которые этот сигнал активирует, и затем определить, какие структурные гены включаются этими регуляторными генами, то есть какие гены отвечают за отрастание новых синапсов, лежащее в основе формирования долговременной памяти.
Упрощенные нейронные цепи, которые мы получили в тканевой культуре (единственный сенсорный нейрон, связанный с единственным мотонейроном), давали нам биологическую систему, вполне подходящую для проверки наших идей. В чашках с этой культурой мы использовали серотонин в качестве возбуждающего сигнала, поступающего на сенсорный нейрон при сенсибилизации. Однократное введение серотонина (соответствующее однократному удару током в ходе обучения) говорило клетке о том, что раздражитель имеет сиюминутное, кратковременное значение, а пятикратное введение (соответствующее пятикратному повторению удара в ходе обучения) предупреждало о длительном, долговременном значении раздражителя. Мы установили, что введение в сенсорный нейрон циклического АМФ в высокой концентрации вызывает не только кратковременное, но и долговременное повышение силы синапса. В нашей работе принял участие Роджер Цянь из Калифорнийского университета в Сан-Диего, и мы воспользовались разработанным им методом, который позволял увидеть, где в пределах нейрона сосредоточены циклический АМФ и протеинкиназа А. Мы обнаружили, что однократное введение серотонина повышает концентрацию циклического АМФ и протеинкиназы А преимущественно в районе синапса, а многократное приводит к еще более высоким концентрациям циклического АМФ, которые вызывают поступление протеинкиназы А в ядро, где она обеспечивает активацию генов. Последующие исследования показали, что активация генов осуществляется протеинкиназой А с помощью другой киназы, так называемой MAP-киназы ²⁸, которая тоже связана с ростом синапсов и тоже поступает в ядро.

Тем самым мы подтвердили нашу гипотезу: для того чтобы многократное обучение вызвало долговременную сенсибилизацию (показывающую, что повторение — мать учения), необходимо, чтобы в ядро поступили соответствующие сигналы в форме киназ. Что делают эти киназы, оказавшись в ядре? Из опубликованных незадолго до того работ, выполненных на клетках, не относящихся к нервной системе, мы знали, что протеинкиназа А может активировать регуляторный белок CREB (cyclic АМР response element-binding protein — белок, связывающий элемент, реагирующий на циклический АМФ), который связывается с промотором (элементом, реагирующим на циклический АМФ). Это заставило нас предположить, что CREB может быть ключевым компонентом переключения, переводящего кратковременное усиление синаптической связи в долговременное и обеспечивающего отрастание новых связей.

В 1990 году, после того как к нам присоединились два постдока, Прамод Даш и Бенджамин Хохнер, нам удалось установить, что CREB присутствует в сенсорных нейронах аплизии и действительно необходим для долговременного усиления синаптических связей, лежащих в основе долговременной сенсибилизации. Блокируя работу CREB в ядре сенсорного нейрона в культуре, мы препятствовали долговременному, но не кратковременному усилению связей. Это был поразительный результат: блокируя единственный регуляторный белок, мы блокировали весь процесс долговременных синаптических изменений! Впоследствии наш постдок Душан Барч, творческий человек и блестящий экспериментатор, обнаружил, что простого введения в ядро сенсорного нейрона CREB, фосфорилированного протеинкиназой А, достаточно для того, чтобы включить гены, производящие долговременное усиление этих связей.

Таким образом, хотя меня давно учили, что гены нервной системы управляют поведением и безраздельно властвуют над нашей судьбой, исследования показали, что в нервной системе, как и в клетках бактерий, гены подчиняются среде. Их работой управляют события, происходящие в окружающем мире. Внешний раздражитель, такой как удар тока в заднюю часть тела животного, вызывает активацию модуляторных интернейронов, выделяющих серотонин. Этот серотонин действует на сенсорные нейроны, повышая в них концентрацию циклического АМФ, в результате чего протеинкиназа А и MAP-киназа поступают в ядро и активируют белок CREB. Активация CREB, в свою очередь, вызывает экспрессию генов, которая меняет клетку в структурном и функциональном отношении.

В 1995 году Душан Барч обнаружил, что на самом деле в соответствии с предсказаниями, которые можно было бы сделать на основе модели Жакоба и Моно, существует две формы белка CREB: одна (CREB-1) активирует, а другая (CREB-2) подавляет экспрессию генов. Многократное действие раздражителя приводит к тому, что протеинкиназа А и MAP-киназа поступают в ядро, где протеинкиназа А активирует CREB-1, а MAP-киназа инактивирует CREB-2. Таким образом, для долговременного усиления синаптических связей требуется не только включение одних генов, но и выключение других (рис. 19–1).

19–1. Молекулярные механизмы кратковременного и долговременного привыкания.
После этих замечательных открытий, сделанных у нас в лаборатории, меня поразили две вещи. Во-первых, мы видели, что модель регуляции генов Жакоба и Моно применима к процессу формирования памяти. Во-вторых, что открытая Шеррингтоном интегративная деятельность нейронов доходит до уровня ядра. Меня изумила эта аналогия: на клеточном уровне на нейрон поступают возбуждающие и тормозные синаптические сигналы, в то время как на молекулярном один регуляторный белок CREB способствует экспрессии генов, а другой ее подавляет. Противоположное действие белков суммируется, обеспечивая работу механизма регуляции.

Более того, противоположное регуляторное действие двух форм белка CREB обеспечивает наличие определенного порога для формирования памяти, который, вероятно, гарантирует обучение только важному, полезному для жизни опыту. Многократные удары током — это важный опыт для аплизии, точно так же, как умение играть на фортепиано или спрягать французские глаголы может быть важным опытом для нас: повторение — мать учения, потому что оно необходимо для долговременной памяти. Но состояние эмоционального напряжения, например вызванного автомобильной катастрофой, в принципе может позволить обойти ограничения, обычно наложенные на долговременную память. В подобной ситуации в ядро может сразу поступить достаточное количество MAP-киназы, чтобы инактивировать все молекулы CREB-2, тем самым облегчая работу CREB-1, активируемого протеинкиназой А, и опыт запишется в долговременную память. Возможно, именно этим объясняются так называемые мнемические фотовспышки (flashbulb memories) — яркие воспоминания о вызвавших сильные эмоции событиях, которые человек может восстановить в памяти во всех подробностях (как я могу вспомнить то, что произошло между мной и Митци), как будто вся картина события мгновенно и глубоко отпечаталась в мозгу.

Необычайно хорошая память, которую демонстрируют некоторые люди, может, в свою очередь, быть связана с определяемыми генетически особенностями работы белка CREB-2, ограничивающего активность белка-репрессора, активируемого CREB-1. Хотя обычно для долговременной памяти требуются многократные повторения обучения, разделенные периодами отдыха, иногда она может возникать и после однократного события, не связанного с эмоциональным напряжением. Способность к обучению с первого раза была особенно хорошо развита у знаменитого российского мнемониста Соломона Вениаминовича Шерешевского, который, казалось, никогда, даже после десяти с лишним лет, не забывал ничего, что запомнил с первого раза. Большинство мнемонистов обладает более узкими способностями: они могут очень хорошо запоминать только какие-то определенные разновидности опыта. Некоторые люди обладают поразительной памятью на зрительные образы, партитуры, шахматные партии, стихи или лица. Некоторые знатоки Талмуда из Польши могут воспроизвести в зрительной памяти каждое слово на каждой странице двенадцатитомного Вавилонского Талмуда, как будто эта страница (одна из нескольких тысяч) находится у них перед глазами.

Для возрастной потери памяти (доброкачественной старческой забывчивости), напротив, характерна пониженная способность к консолидации долговременных воспоминаний. Этот возрастной дефект может быть связан не только с ослаблением способности активировать CREB-1, но и с недостаточной силой сигналов для снятия тормозящего действия CREB-2 на консолидацию памяти.

Впоследствии было доказано, что обеспечиваемый CREB-белками перевод кратковременной памяти в долговременную работает одинаково у нескольких разных видов животных, что свидетельствует об эволюционной консервативности этого механизма. В 1993 году Тим Талли, специалист по генетике поведения из лаборатории в Колд-Спринг-Харбор на Лонг-Айленде в штате Нью-Йорк, разработал изящный метод изучения долговременной памяти, которая обеспечивает формирование приобретенного страха у мух. В 1995 году с Талли стал сотрудничать специалист по молекулярной генетике Джерри Инь, и вместе они установили, что для долговременной памяти дрозофилы необходимы CREB-белки. Как и у аплизии, CREB-активаторы и CREB-репрессоры играют в этом процессе ключевую роль. CREB-репрессор блокирует преобразование кратковременной памяти в долговременную. Что еще поразительнее, у специально выведенных мух-мутантов, производивших CREB-активатор в избыточном количестве, наблюдались аналоги мнемических фотовспышек. После нескольких повторов процедуры обучения, в ходе которой определенный запах сопровождался электрическим ударом, у нормальных мух вырабатывалась только кратковременная память, вызывающая страх перед этим запахом, а у мух-мутантов такое же количество повторов обеспечивало формирование долговременной памяти. Со временем выяснилось, что тот же механизм, обеспечиваемый CREB-белками, играет важную роль во многих формах имплицитной памяти у множества других видов, от пчел до мышей и людей.

Таким образом, совмещая анализ поведения вначале с клеточной нейробиологией, а затем с молекулярной биологией, мы смогли общими усилиями поучаствовать в закладке фундамента молекулярной биологии элементарных психических процессов.

Мы с Гелетом немало размышляли над этим вопросом и в 1986 году в своей обзорной статье в Nature предложили схему, которая стала известна под названием синаптической маркировки. Мы предположили, что мимолетные изменения в определенном синапсе, обеспечивающие кратковременную память, каким-то образом маркируют его, и эта маркировка позволяет распознавать и задерживать белки в районе данного синапса.

Вопрос о том, как клетка направляет белки к определенным синапсам, как нельзя лучше подходил для Келси Мартин — необычайно одаренной специалистки по клеточной биологии, получившей двойную степень доктора медицины и доктора философии в Йельском университете. После окончания Гарвардского колледжа Келси и ее муж работали в Африке по программе Корпуса мира ²⁹. Когда они начали исследования в Колумбийском университете, у них уже был сын Бен. В период работы Келси в нашей лаборатории у них родилась дочь Майя. Присутствие Келси придавало жизни нашей лаборатории особый дух — не только потому, что она с редким мастерством занималась наукой самого высокого уровня, но и потому, что у всех нас поднималось настроение, когда она с 16:00 до 18:00 превращала наш небольшой конференц-зал — столовую в веселый детский сад для одаренных детей.

Отследив поступление протеинкиназы А в ядро и обнаружив в нем CREB-белки, мы прошли по пути внутриклеточных реакций от синапса до ядра. Теперь нам предстояло пойти в обратном направлении. Нам с Келси нужно было выяснить, чем синапс сенсорного нейрона, обрабатываемый серотонином и претерпевающий долговременные структурные изменения, отличается от необработанных синапсов того же нейрона. Мы это сделали в культуре клеток с помощью полученной нами новой экспериментальной системы.

Мы выращивали отдельный сенсорный нейрон с разветвленным аксоном, образовывавшим синаптические связи с двумя разными мотонейронами. Затем мы имитировали поведенческое обучение, как и раньше, вводя в область синапсов серотонин, но при этом обрабатывая только синапсы, связывающие сенсорный нейрон с одним из двух моторных. Однократное введение серотонина, как и ожидалось, приводило к кратковременному усилению связи только в этих синапсах. Но и пятикратное введение серотонина вызывало долговременное усиление связи и отрастание новых синаптических окончаний только в тех синапсах, которые мы обрабатывали. Результат был удивителен тем, что для долговременного усиления связей и отрастания новых окончаний требуется активация генов CREB-белком, которая происходит в ядре клетки и должна, казалось бы, действовать на все ее синапсы. Когда Келси блокировала работу CREB-белка в ядре, это подавляло усиление связи и рост новых окончаний в области обрабатываемых синапсов (рис. 19–2).

19–2. Экспериментальная система для изучения роли серотонина в синаптических изменениях. Сенсорный нейрон (обозначенный CH на фото вверху) с разветвленным аксоном образует синапсы с двумя мотонейронами (МН). Только на один из этих синапсов воздействуют серотонином. В результате только в этом синапсе происходят кратковременные и долговременные изменения. (Фото любезно предоставила Келси Мартин).
Открытие продемонстрировало нам одно важное свойство вычислительных способностей нервной системы. Оно показало, что, хотя нейрон может образовывать тысячу или больше синаптических связей с разными клетками-мишенями, отдельные синапсы могут видоизменяться независимо при формировании как кратковременной, так и долговременной памяти. Независимость долговременной деятельности синапсов дает нейрону необычайную вычислительную пластичность.

Но чем обеспечивается эта поразительная избирательность? Мы рассмотрели два возможных ответа: что нейрон направляет информационную РНК и белки только к тем синапсам, которые маркированы для формирования долговременной памяти, и что информационная РНК и белки поступают ко всем синапсам нейрона, но только маркированные синапсы могут использовать их для отращивания новых окончаний. Начали мы со второй гипотезы, потому что ее было проще проверить.

Что же позволяет осуществлять эту «маркировку для роста»? Келси установила, что в маркированном синапсе должны происходить две вещи. Первая — просто активация протеинкиназы А. Если в области синапса не активируется протеинкиназа А, никакого усиления связи вообще не происходит. Вторая — активация механизма, управляющего локальным синтезом белков. Это было совершенно неожиданное открытие, позволившее по-новому взглянуть на одну замечательную область клеточной нейробиологии, которую до того недооценивали и поэтому не обращали на нее особого внимания. В начале восьмидесятых годов Освальд Стьюард, теперь работающий в Калифорнийском университете в Ирвайне, обнаружил: несмотря на то что в подавляющем большинстве случаев синтез белков в нейронах происходит в теле клетки, некоторые белки синтезируются локально, непосредственно в синапсах.

Наше новое открытие указывало на то, что одна из функций локального синтеза белков состоит в поддержании долговременного усиления синаптических связей. Когда мы подавляли локальный синтез белка в области определенного синапса, процесс долговременного усиления все же запускался, и в этой области начинался рост новых окончаний с использованием белков, поступающих от тела клетки. Однако этот рост не поддерживался и через день обращался вспять. Таким образом, белков, синтезируемых в теле клетки и поступающих к окончаниям, достаточно для запускания синаптического роста, но для его поддержания необходимы белки, синтезируемые локально (рис. 19–3).

Диссертации Каусика на соискание степени доктора философии была посвящена синтезу белков у дрожжей, а в Колумбийском университете он занялся проблемой локального синтеза белков в нейронах аплизии. Мы знали, что молекулы информационной РНК синтезируются в ядре, а затем в определенных синапсах на их матрице происходит синтез белков. В связи с этим нужно было ответить на вопрос, поступает ли информационная РНК в окончания в активном состоянии или в неактивном, как спящая красавица, в ожидании того, что в области маркированных синапсов ее поцелует какой-то молекулярный прекрасный принц.

Каусик склонялся к гипотезе спящей красавицы. Он доказывал, что неактивные молекулы информационной РНК активируются только в том случае, если достигают соответствующим образом маркированного синапса и встречаются там с определенным сигналом. Он проводил параллель с интересным примером такой регуляции, который наблюдается в развитии лягушек. В ходе оплодотворения и созревания яйцеклетки лягушки неактивные молекулы информационной РНК пробуждаются и активируются под действием недавно открытого белка, регулирующего локальный синтез других белков. Этот белок называется CPEB (cytoplasmic polyadenylation element-binding protein — белок, связывающий элемент цитоплазматического полиаденилирования).

Мы проникали в лабиринты молекулярных механизмов памяти все глубже, и Каусику удалось выяснить, что неизвестная ранее форма CPEB-белка в нейронах аплизии и есть тот прекрасный принц, которого мы искали. Этот белок присутствует только в нервной системе, локализуется во всех синапсах нейрона, активируется серотонином, и его наличие в активированных синапсах требуется для поддержания синтеза белка и отрастания новых синаптических окончаний. Однако открытие Каусика отвечало на один вопрос, но задавало другой. Большинство белков в клетке распадается и разрушается в течение нескольких часов. Что же поддерживает рост синаптических окончаний в течение более длительного времени? Какой принципиальный механизм мог поддерживать мои воспоминания о Митци в течение всей жизни?

Внимательно изучая последовательность аминокислот нового CPEB-белка, Каусик обнаружил весьма примечательную вещь. Один из концов цепочки этого белка обладал всеми признаками приона.

Прионы — это, наверное, самые странные из белков, известных современной биологии. Их открыл Стэнли Прузинер из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Это были факторы, вызывающие несколько загадочных нейродегенеративных заболеваний, таких как коровье бешенство (губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота) и болезнь Кройцфельдта — Якоба у людей (именно эта болезнь стала причиной трагической смерти Ирвинга Купфермана в 2002 году — на пике его научной карьеры). Прионы отличаются от других белков тем, что их цепочки могут сворачиваться двояко, образуя две функционально различные формы или конформации: доминантную и рецессивную. Экспрессия генов, кодирующих прионы, приводит к синтезу рецессивной формы, но рёцессивная форма может превращаться в доминантную или по чистой случайности, как это, вероятно, произошло у Ирвинга, или в связи с употреблением в пищу продуктов, содержащих доминантную форму этого белка. В доминантной форме прионы могут убивать клетки собственного организма. Еще одно отличие прионов от других белков состоит в том, что их доминантная форма способна самоподдерживаться. Под действием доминантной формы рецессивная меняет конформацию и тоже превращается в доминантную, получая способность к самоподдержанию (рис. 19–4).

Безумная идея! Но если правда, это позволило бы объяснить, как долгосрочная память может неограниченно долго поддерживаться в синапсах, несмотря на постоянный распад и обновление белков. Самоподдерживающееся вещество вполне может сохраняться в области синапса неограниченно долго, регулируя локальный синтез белков, необходимых для поддержания новообразованных синаптических окончаний.

В ходе моих ночных раздумий о долговременной памяти однажды ненадолго уже приходила в голову мысль, что прионы могут быть каким-то образом задействованы в хранении этой памяти. К тому же я был знаком с новаторскими работами Прузинера, посвященными прионам и прионным заболеваниям, за исследование которых он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1997 года. Поэтому, хотя я никак не ожидал, что недавно открытая разновидность CPEB-белка может оказаться прионом, я сразу воспринял идеи Каусика с энтузиазмом.

Прионы особенно активно изучали у дрожжей, но никому еще не удавалось выяснить, какую функцию эти белки играют в норме, пока Каусик не открыл новую форму CPEB-белка, выделенную из нейронов. Поэтому его открытие было не только серьезным шагом вперед в исследовании обучения и памяти, но и новым словом для биологии в целом. Вскоре мм установили, что в сенсорных нейронах, участвующих в рефлексе втягивания жабр, превращением CPEB-белка из неактивной неразмножающейся формы в активную и размножающуюся управляет серотонин — нейромедиатор, необходимый для превращения кратковременной памяти в долговременную (рис. 19–4). В этой самоподдерживающейся форме CPEB обеспечивает также поддержание локального синтеза белков. Кроме того, обратить вспять переход в это самоподдерживающееся состояние сравнительно непросто.

Благодаря этим двум свойствам новая разновидность прионов как нельзя лучше подходит для хранения памяти. Самоподдержание, необходимое для локального синтеза белков, позволяет надолго избирательно сохранять информацию в одних синапсах, но, как вскоре установил Каусик, не влияет на множество других синапсов того же нейрона.

Помимо открытия роли нового приона в длительном сохранении памяти и в работе нервной системы в целом мы с Каусиком также обнаружили два неизвестных ранее биологических свойства прионов. Во-первых, нормальный физиологический сигнал (серотонин) обеспечивает превращение CPEB-белка из одной формы в другую. Во-вторых, новый CPEB-белок был первой самоподдерживающейся формой приона, для которой удалось установить физиологическую функцию — в данном случае поддержание усиления синаптической связи и хранение памяти. Во всех других исследованных ранее случаях самоподдерживающаяся форма приона или вызывала болезнь и смерть, убивая нервные клетки, или, реже, была неактивна.

Мы пришли к убеждению, что открытие Каусика может быть лишь надводной частью нового биологического айсберга. Такой механизм (активация ненаследуемых, самоподдерживающихся изменений белка) вполне мог быть задействован и во многих других биологических процессах, в том числе в развитии и транскрипции генов.

Это замечательное открытие, сделанное в моей лаборатории, может служить примером того, как похожа бывает фундаментальная наука на детективный роман с неожиданными поворотами сюжета: какие-то новые удивительные процессы таятся в неизведанных уголках жизни, и впоследствии выясняется, что они играют важную роль во многих событиях. Наше открытие было необычно тем, что молекулярные процессы, лежащие в основе ряда редких заболеваний мозга, помогли разобраться в одном из механизмов долговременной памяти — неотъемлемой функции здорового мозга. Хотя обычно как раз фундаментальная биология помогает разобраться в тех или иных заболеваниях, а не наоборот.

Наконец, длительное сохранение памяти обеспечивается ростом и поддержанием новых синаптических окончаний. Так что, если вы запомните что-то из этой книги, так произойдет потому, что ваш мозг будет немного другим после ее прочтения. Эта способность отращивать новые синаптические связи под действием опыта, судя по всему, крайне консервативна в эволюционном плане. Один из примеров такого консерватизма состоит в том, что и у людей, и у намного проще устроенных животных карты тела в коре головного мозга постоянно видоизменяются в ответ на изменения сигналов, поступающих по сенсорным проводящим путям.