Ферменттер белсенділігін анықтаудың жалпы әдістері

Ферменттер белсенділігінің жылдам өзгеруі өте маңызды. Олда құрғақ
қалдық немесе ақуыз мөлшерін өлшеуге кіреді. 
Осыны 280 нм кезіндегі жұтылу шамасын өлшеу жолымен ақуызды
анықтаудың жылдам әдісі деп атауға болады. Бастапқы материалда
болатын ақуыз қоспасының жылыуының орташа жылдамдығынан кейде
едәуір ерекшеленетін бөлінуші ақуыздың меншікті жұтылу есебінен
ұтылған маңыздырақ.
Зерттелуші ұлпалық субстраттағы ферменттер белсенділігін анықтауға
кіріспестен бұрын:
1. рН-қа белсенділік тәуелділігін анықтау және зерттеуші фермент
белсенділігін айқындау үшін ортаның оптикалды реакциясын таңдап
алу;
2. Субстратпен оның инкубациялану (көбею) уақытына фермент
белсенділігінің тәуелділік графигін құрау және ферменттің инкубация
(көбею) уақыты мен оның белсенділігі шамалары арасындағы
сызықтық тәуелділік сақталатын, көбею мерзіміндегі жұмыстар үшін
таңдау;
3. Сынамадағы ақуыз концентрациясына белсенділік шамасының
тәуелділігін анықтау. Фермент концентрациясына оның белсенділік
шамасы пропорционалды (баламасы) болғандығы фермент
концентрациясы төмендейді, ал протелиттікте – жоғарылайды.
«Апсырау факторын » анықтай отырып, протеолиттік беленділікті
анықтау үшін оптималдық жағдайларды таңдаумен сол мезгілде
ингибиттардың (басытқының) бар екендігін анықтауға болады.
4. Фермент белсенділігін анықтау кезінде ферментативті реакцияның
максималды жылдамдығы деп аталатын ферменттің субстратын толық
қанығуы кезіндегі ферменттативті реакцияның тұрақты жылдамдығы
кезінде жұмыс істеу қажет. Жекелеген әрбір жағдайда максималды
жылдамдықты ақуыздың тұрақты консетрациясы кезінде препарат
белсенділігін өлшеп, тәжірибелік түрде табу керек.
Ақуыздық субстрат бойынша протеиназ белсенділігін
анықтау.Сәйкесінше буферлік 0,5 мл субстратқа құрамында фермент
(экстракт(сығынды), биологиялық сұйықтық) бар 0,5мл сынаманы қосып,
сынамадағы ақуыздар 10%-дың 5мл үшхлорсірке қышқылмен
тұндырылғаннан кейін, уақыттық анықталған тәжірибелік жолмен
инкубациялайды (көбейеді). Тұнбаны центрифугамен бөліп алып, ал
тұнбаастылық сұйықтықты (ҮХС-центрифугат) ары қарайғы өңдеуге
жібереді.
Қайтымды түрде реактив қосылған бақылау сынамасы: 10%-дың 3мл
ҮХС ертіндісіне құрамында фермент пен 0,5мл субстрат бар 0,5мл
ертінді қосады.Сынаманы субстрат автолизіне қоюға кеңес береді: 0,5мл
субстратқа құрамында фермент бар 0,5мл қайнаған ертінді қосылып,
ҮХС-мен тұндырылған тәжірибелік сынамамен бірге инкубацияланады
(көбейтіледі).

Модификацияланған Сакагучи реакциясы бойынша ҮХС-
центрифугантында аргинин құрамын анықтау. 0,5мл ҮХС-
центрифугантына 0,5мл 2,5м CuSO
4
ертіндісін, 0,5мл 5 H KOH ертіндісі
мен 0,5мл ДХН (2,4-дихлор 1-нафтол) ертінділерін қосады. Ертінді
шайқалып, 0,5мл натрий гипобролиті қосылғанда бір мезетте ашық-
қызыл реңге енеді. Ертіндіні шайқап, 20-30 секунд өткеннен кейін
(боялған өнімнің натрий гипобролитінің артық мөлшерінен бұзылып
кетпеуінің алдын алу үшін) 0,2мл 2-тиодигликолды қосқаннан кейін
тәжірибедей, бақылау сынамасында ҮХС артық мөлшері мен натри
гипобролиті арасындағы реакцияның қосалқы қосалқы өнімнің
есебінен сарғыш түске енеді. Қосымша өнім сондай-ақ 2-тиодигликолмен
тұрақтандырылады. Сынаманың оптикалық тығыздығының қалыңдығы
1см кюветадағы 520нм кезіндей спектрофотометрмен өлшенеді.
Фолин реактиві реакция бойынша протеиназ белсенділігін анықтау. Сол
0,5мл ҮХС-центрифугантқа 0,5мл 2,5 М CuSO
4
ертіндісін, 4мл 0,5н
NaOH ертіндісі мен 1,5мл үш есе сұйытылған Фолин реактиві қосылады.
30минуттан соң 760нм кезіндей оптикалық тығыздықты
спектрофотометрде өлшейді.
Тотыққан лизоцимнің пепсиндік гидролизаты бойынша калибрлік
қисықтар.30мл тотыққан лизоцимді 50мл қышқылдандырылған суда
ерітеді (40мл H
2
O+10мл 0,3н HCl ертіндісі мен алынған ертіндіг 0,5мл
пепсин қосамыз). Қоспаны бөлме температурасында тәулік бойына
қалдырамыз. Осы көбею мерзімі өту кезінде препарат ҮХС тұнбасын
береді. Бұл препаратты калибрлік қисықтарды құрау үшін стандарт
ретінде аргенин және тиразин ертінділері мен бірге пайдаланады.
Бастапқы лизоцимнің 60-тан 600мк
2
/мл-ға дейін құрамды бөліп алуды
дайындайды. Сынамаға сәйкесінше концентрациялы 0,04-тен 0,25 мк
моль/мл-ге дейінгі бос аргенин мен тиразин ертінділері дайындалады.
Әрбір сынамадан Фолин бойынша аргенин мен тиразин құрамын
анықтау үшін 0,5мл-ден (үш параллель сынамада) алынады.
Аминқышқылдарының мөлшері балашалы концентрациядан тиразин
індегі немесе 1мл наномоль гидролизаттағы оның қалдығы. 3 қисығы бос
аргинин секілді, лизацим пепсинді гидролизат пепсидінің құрамында
болатын оның қалдығымен Сакалучи реакциясының нәтижесінде
алынады. Түзу бойынша тәжірибелік нүктелердің орналасуы ҮХС-мен
тұндырылған гидролизатта бүкіл аргинин толықтай Сакалучи
реактивімен әрекеттесетіндігін көрсетеді.
Фолиннің тирозинге әсер етуі спецификалық емес. Пепситтен
терозиннен басқа осы реактивпен триптофан, цистеиндер әрекеттеседі.
Тетропептинді және полипентидті мыстан түзелген бидрет кешені
мұндай өзараәрекеттесуді жеңілдетеді. Бойынша және тиразиндік
балашалықтағы протеолиттік ферменттер белсенділігінің шамасы
кескіндеу, бұл кейде дұрыс болмай шығады.
Осылайша, біз биологиялық катализаторлар секілді ферменттер
ерекшеліктерін қарастырдық, ақуыздық емес катализаторлардан олардың

ерекшелігі, ұсынылған пепсин және папин ферменттерінің белсенділігін
өлшеу тәсілдері көрсетілді. Өкінішке орай, бұл сәт папаинды зерттеу
бойынша жариаланған мақалалардың едәуір аз мөлшеріне ие.

жүктеу/скачать 71.51 Kb.

Достарыңызбен бөлісу: