Катлинский, Сазыкин. Курс лекций по биотехнологии
жүктеу/скачать 2.51 Mb. Pdf көрінісі
|
| Рис.9.
2. Обработка клеточных стенок ферментами. 3. Стабилизация протопластов Гипертонический раствор, состоящий из 10%-ных маннита, сахарозы, хлорида натрия. Ионная сила раствора такова, что клетка находится в состоянии тургора, но не лопается, при этом раствором также производится отмывание фермента. 4. Слияние протопластов. Слияние протопластов производится в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, который нарушает клеточную цитоплазму и ДНК двух протопластов объединяются. Этот процесс происходит постепенно. Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку необходимо сделать компетентной. Для этого: 1. обрабатывают клетку тяжелыми металлами 2. производят быструю заморозку и оттаивание клеток 3. обрабатывают клетки ферментами. 37 При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом – диплоидный набор (при образовании гибрида происходит рекомбинация ДНК). 5. Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта. Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для прокариот и эукариот. При этом происходит восстановление клеточной оболочки. Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на уровне 4-ой стадии включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер – это участок гена, образующий какой- либо фермент, заявляющий о себе своеобразным путем при высеве на питательную среду. В данном случае маркером является β-лактамаза. В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат β-лактамазу, расщепляю- щую его. А так как β-лактамазу содержат только клетки гиб- риды, то на среде и вы растают только гибриды. 6. Хранение гибридов, новых продуцентов. ( См. общие способы хранения продуцентов.) Техника протопластирования может дать как положительные так и отрицательные варианты. При протопластировании наблюдается явление активации молчащих генов. Протопластирование ведет к изменению микроорганизмов, с помощью чего можно достичь совершенствования биообъектов. Техника клеточной генной инженерии 1-ый метод. Метод перегруппировки генов |