Микроскопия микроскоптың көмегімен объектілерді зерттеу. ХҒС бірнеше түрге бөлінеді
жүктеу/скачать 25.59 Kb.
|
1 2
Микроскопия каз| 1.1 Жарық микроскопиясы
Жарық микроскопиясы 2-3 мың есеге дейін үлкейтуді, тірі заттың түсті және қозғалмалы бейнесін, микрофильмге түсіру және сол объектіні ұзақ уақыт бақылау мүмкіндігін, оның динамикасы мен химиясын бағалауды қамтамасыз етеді. Кез келген микроскоптың негізгі сипаттамалары ажыратымдылық пен контраст болып табылады. Ажыратымдылық - бұл микроскоппен бөлек көрсетілген екі нүкте орналасқан ең аз қашықтық. Ең жақсы көру режимінде адам көзінің ажыратымдылығы 0,2 мм. Кескіннің контрасты – кескін мен фон арасындағы жарықтық айырмашылығы. Егер бұл айырмашылық 3–4%-дан аз болса, онда оны көзбен де, фотопластинкамен де анықтау мүмкін емес; онда микроскоп оның бөлшектерін шешсе де кескін көрінбейтін болып қалады. Контрастқа фонмен салыстырғанда жарық ағынын өзгертетін объектінің қасиеттері де, сәуленің қасиеттеріндегі нәтижелік айырмашылықтарды оптиканың түсіру қабілеті де әсер етеді. Жарық микроскопының мүмкіндіктері жарықтың толқындық табиғатымен шектеледі. Жарықтың физикалық қасиеттері – түсі (толқын ұзындығы), жарықтығы (толқын амплитудасы), фазасы , тығыздығы және толқынның таралу бағыты объектінің қасиеттеріне байланысты өзгереді. Бұл айырмашылықтар қазіргі микроскоптарда контраст жасау үшін қолданылады. Микроскоптың үлкейтуі объективті үлкейту мен окулярдың үлкейтуінің көбейтіндісі ретінде анықталады. Типтік зерттеу микроскоптарының окулярының ұлғаюы 10, объективті үлкейтуі 10, 45 және 100. Тиісінше, мұндай микроскоптың үлкейтуі 100-ден 1000-ға дейін. Кейбір микроскоптардың үлкейтуі 2000-ға дейін. Одан да жоғары үлкейту болмайды. мағынасы бар, өйткені ажыратымдылық жақсармайды. Керісінше, сурет сапасы нашарлайды. Сандық апертура оптикалық жүйенің ажырату қабілетін немесе линзаның апертура қатынасын көрсету үшін қолданылады. Объектив апертурасы - кескіннің бірлігіне шаққанда жарықтың қарқындылығы, шамамен NA квадратына тең. Жақсы линза үшін NA мәні шамамен 0,95 құрайды. Микроскоп әдетте оның жалпы үлкейтуі шамамен 1000 НА болатындай өлшемде болады. Объект пен үлгі арасына сұйықтық (май немесе сирек дистилденген су) енгізілсе, NA мәні 1,4-ке дейін жоғары және ажыратымдылықтың сәйкес жақсаруы бар «батыру» объектісі алынады. Жарық микроскопиясының әдістері (жарықтандыру және бақылау) зерттелетін объектілердің табиғаты мен қасиеттеріне байланысты таңдалады (және конструктивті түрде қамтамасыз етіледі), өйткені соңғысы, жоғарыда айтылғандай, кескіннің контрастына әсер етеді. Өткізілетін жарықтағы жарқын өріс әдісі жұтатын (жарық сіңіретін) бөлшектері және олардың құрамына кіретін бөліктері бар мөлдір препараттарды зерттеу үшін қолданылады. Бұл, мысалы, жануарлар мен өсімдік ұлпаларының жұқа түсті кесінділері, минералдардың жұқа кесінділері және т.б. болуы мүмкін. Препарат жоқ болған кезде конденсатордан линзадан өтетін жарық шоғы линзаның жанында біркелкі жарықтандырылған өрісті тудырады. окулярдың фокус жазықтығы. Дайындықта сіңіргіш элемент болса, оған түскен жарықтың ішінара сіңірілуі және ішінара шашырауы орын алады, бұл кескіннің пайда болуын тудырады. Сондай-ақ әдісті сіңірмейтін заттарды бақылау кезінде қолдануға болады, бірақ олар жарықтандырғыш сәулені оның айтарлықтай бөлігі линзаға түспейтіндей күшті шашыратқанда ғана. Көлбеу жарықтандыру әдісі алдыңғы әдістің вариациясы болып табылады. Олардың арасындағы айырмашылық мынада: жарық объектіге бақылау бағытына үлкен бұрышпен бағытталған. Кейде бұл көлеңкелердің пайда болуына байланысты объектінің «рельефін» ашуға көмектеседі. Шағылысқан жарықтағы жарқын өріс әдісі жарықты көрсететін мөлдір емес объектілерді, мысалы, металдардың немесе кендердің жылтыратылған бөліктерін зерттеу кезінде қолданылады. Препарат жоғарыдан жарықтандырылады (сәулелендіру құралы мен мөлдір айнадан), бір уақытта конденсатор рөлін атқаратын линза арқылы. Түтік линзасымен бірге линзаның жазықтықта жасалған суретте оның элементтерінің шағылыстыру қабілетінің айырмашылығына байланысты препараттың құрылымы көрінеді; Жарық далада оларға түскен жарықты шашыратып жіберетін біртекті еместіктер де көзге түседі. Қараңғы өріс әдісі және оның сорттары: Берілген ашық қараңғы өріс ашық өрісті пайдалану арқылы көрінбейтін мөлдір, сіңірмейтін объектілердің кескіндерін алу үшін қолданылады. Көбінесе бұл биологиялық объектілер. Сәулелендіру құралы мен айнадан түсетін жарық препаратқа арнайы жасалған конденсатор деп аталады. қараңғы өріс конденсаторы. Конденсатордан шыққан кезде мөлдір препараттан өткенде бағытын өзгертпеген жарық сәулелерінің негізгі бөлігі қуыс конус түріндегі сәулені құрайды және линзаға түспейді (осы конустың ішінде орналасқан) . Микроскоптағы сурет слайдта орналасқан препараттың микробөлшектерімен шашыраған сәулелердің конусқа өтіп, линзадан өтетін аз ғана бөлігі арқылы жасалады. Қараңғы өріс микроскопиясы Тиндалл эффектісіне негізделген, оның әйгілі мысалы күн сәулесінің тар сәулесімен жарықтандырылған ауадағы шаң бөлшектерін анықтау болып табылады. Қараңғы фонда көру аймағында препараттың құрылымдық элементтерінің жарық суреттері көрінеді, олар қоршаған ортадан олардың сыну көрсеткішімен ерекшеленеді. Үлкен бөлшектердің жарық сәулелерін шашыратып жіберетін жарқыраған шеттері ғана болады. Бұл әдісті қолдана отырып, кескіннің сыртқы түрінен бөлшектердің мөлдір немесе мөлдір еместігін немесе қоршаған ортамен салыстырғанда олардың сыну көрсеткішінің жоғары немесе төмен екенін анықтау мүмкін емес. Қараңғы далалық зерттеуді жүргізу: сырғытпалардың қалыңдығы 1,1 - 1,2 мм-ден аспауы керек, төсеніштердің қалыңдығы 0,17 мм, сызаттар немесе ластануларсыз. Препаратты дайындау кезінде көпіршіктердің және үлкен бөлшектердің болуына жол бермеу керек. Бұл ақаулар жарқыраған болып көрінеді және үлгіні байқауға мүмкіндік бермейді. Қараңғы өріс микроскопиясы үшін неғұрлым қуатты жарықтандырғыштар және шамның максималды қарқындылығы қолданылады. Қараңғы өрісті жарықтандыруды орнату негізінен келесідей: 1) Келер бойынша жарықты орнату; 2) жарық өрісті конденсаторды қараңғы өріске ауыстыру; 3) конденсатордың жоғарғы линзасына батыру майы немесе тазартылған су жағылады; 4) конденсаторды сырғытпаның төменгі бетіне тигенше көтеру; 5) төмен үлкейтетін линза дайындыққа бағытталған; 6) орталықтандыру бұрандаларының көмегімен жарық нүктесі (кейде күңгірттенген орталық аймағы бар) көру аймағының ортасына ауыстырылады; 7) конденсаторды көтеру және түсіру арқылы қараңғыланған орталық аймақ жоғалады және біркелкі жарықтандырылған жарық нүктесі алынады. Егер мұны істеу мүмкін болмаса, заттық шынының қалыңдығын тексеру керек (бұл құбылыс әдетте тым қалың заттық шыны қолданғанда байқалады - жарық әйнектің қалыңдығына бағытталған). Жарықты дұрыс орнатқаннан кейін қалаған линзаны орнатып, препаратты зерттейді. Ультрамикроскопиялық әдіс те жоғарыдағы принципке негізделген - препараттар ультрамикроскоптар бақылау бағытына перпендикуляр жарықтандырылады. Бұл әдіс арқылы өлшемдері ең қуатты микроскоптардың рұқсатынан әлдеқайда жоғары болатын өте кішкентай бөлшектерді анықтауға болады. Иммерсиялық ультрамикроскоптардың көмегімен препаратта 2х10 - 9 м дейінгі бөлшектердің болуын тіркеуге болады. Бірақ олардың пішіні мен нақты өлшемдерін бұл әдіспен анықтау мүмкін емес. Олардың кескіндері бақылаушыға дифракциялық дақтар түрінде көрінеді, олардың өлшемдері бөлшектердің өздерінің өлшемі мен пішініне емес, линзаның апертурасына және микроскоптың үлкейтуіне байланысты. Мұндай бөлшектер өте аз жарық шашатындықтан, оларды жарықтандыру үшін көміртегі электр доғасы сияқты өте күшті жарық көздері қажет. Ультрамикроскоптар негізінен коллоидты химияда қолданылады. Ультрамикроскоптың көмегімен сыртқы біртекті ерітіндіде кәдімгі молекулалардан үлкен бөлшектердің болатынын көрсетуге болады; Сонымен қатар, коллоидты бөлшектерді ерітіндінің белгілі көлемінде санау арқылы олардың орташа өлшемдерін шамамен анықтауға болады. Бірақ бөлшектердің мөлшері мен пішінін тікелей айта алмайсыз, өйткені бөлшектер іс жүзінде көрінбейді — олар микроскоппен көруге тым кішкентай. Микроскоптың көрсету қабілеті қолданылатын жарықтың толқын ұзындығымен шектеледі, ең аз ажырату қашықтығы жарық толқын ұзындығының жартысына тең. Фазалық контраст әдісі (аноптральды контраст әдісі) жарық өрісі әдісін қолдану арқылы бақылау кезінде көрінбейтін мөлдір және түссіз заттардың кескіндерін алуға арналған. Оларға, мысалы, тірі боялмаған жануарлар ұлпалары жатады. Әдістің мәні мынада: препараттың әртүрлі элементтерінің сыну көрсеткіштеріндегі өте аз айырмашылықтардың өзінде олар арқылы өтетін жарық толқыны фаза бойынша әртүрлі өзгерістерге ұшырайды (фазалық рельеф деген атауға ие болады). Көзбен де, фотопластинкамен де тікелей қабылданбайтын бұл фазалық өзгерістер арнайы оптикалық құрылғының көмегімен жарық толқынының амплитудасының өзгеруіне, яғни жарықтық өзгерістеріне («амплитудалық рельеф») түрленеді. Басқаша айтқанда, алынған кескінде көрінетін жарықтылықтың (амплитуданың) таралуынан фазалық рельеф туындайды. Осылайша алынған кескін фазалық контраст деп аталады. Фазалық контраст құрылғысын кез келген жарық микроскотына орнатуға болады және мыналардан тұрады : 1)арнайы фазалық пластиналары бар объективтір жиынтығы ; 2) айналмалы дискісі бар конденсатордан тұрады, онда әрбір объективтегі фазалық пластинкаларға сәйкес сақиналы диафрагмалар бар 3) фазалық контрастты реттеуге арналған көмекші телескоптан тұрады. Фазалық контраст құрылғысының жүмыс жасау реттілігі келесідей: 1) микроскоптың линзалары мен конденсаторын фазалық линзалармен ауыстырыңыз (Ph әріптерімен белгіленген); 2) төмен үлкейтетін линзаны орнатыңыз. Конденсатор дискісінің тесігі сақиналы диафрагмасыз болуы керек («0» санымен белгіленген); 3) Келер бойынша жарықты реттеу; 4) сәйкес үлкейтетін фазалық объективті таңдап, оны үлгіге бағыттаңыз; 5) конденсатор дискісін айналдыру және линзаға сәйкес сақиналы диафрагманы орнату; 6) түтіктен окулярды алып, оның орнына көмекші телескопты салу. Оны фазалық тақта (қараңғы сақина түрінде) және сақиналы диафрагма (бір диаметрдегі жеңіл сақина түрінде) анық көрінетіндей етіп реттеңіз. Конденсатордағы реттеу бұрандаларының көмегімен бұл сақиналар тураланады. Көмекші телескопты алып тастап, окулярды қайта орнатыңыз. Микроскопияның осы әдісін қолданудың арқасында боялмаған тірі микроорганизмдердің контрасты күрт артады және олар ашық фонда күңгірт (оң фазалық контраст) немесе күңгірт фонда ашық (теріс фазалық контраст) болып көрінеді. Сонымен қатар фазалық контрастты микроскопия ұлпа культурасының жасушаларын зерттеу, жасушаларға әртүрлі вирустардың әсерін бақылау және т.б. үшін қолданылады. Бұл жағдайларда кері оптикасы бар биологиялық микроскоптар - инвертивті микроскоптар жиі қолданылады. Мұндай микроскоптарда объективтер төменгі жағында, ал конденсатор жоғарыда орналасады. Поляризациялық микроскопия – құрамында оптикалық анизотропты элементтері бар (немесе толығымен осындай элементтерден тұратын) препараттарды микроскопиялық зерттеуге арналған поляризацияланған жарықта бақылау әдісі. Бұл көптеген минералдар, қорытпалардың жұқа кесінділеріндегі дәндер, кейбір жануарлар мен өсімдіктер ұлпалары және т.б. бақылауға мүмкіндік береді. Анизотропты микрообъектілердің оптикалық қасиеттері әр түрлі бағытта әр түрлі және бұл объектілердің бақылау бағытына және оларға түсетін жарықтың поляризация жазықтығы қатысты бағытына байланысты әртүрлі түрде көрінеді. Бақылауды өткен және шағылған жарықта жүргізуге болады. Сәулелендіру құралы шығаратын жарық поляризатор арқылы өтеді. Оған берілген поляризация жарықтың препарат арқылы (немесе одан шағылысу) кейінгі өтуімен өзгереді. Бұл өзгерістер анализатордың және әртүрлі оптикалық компенсаторлардың көмегімен зерттеледі. Осындай өзгерістерді талдай отырып, анизотропты микрообъектілердің негізгі оптикалық сипаттамаларын бағалауға болады: қос сыну күші, оптикалық осьтер саны және олардың бағыты, поляризация жазықтығының айналуы және дихризм. Интерференциялық контраст әдісі (интерференциялық микроскопия) әрбір сәулені микроскопқа кірген кезде бөлуден тұрады. Алынған сәулелердің бірі байқалатын бөлшек арқылы бағытталады, екіншісі - микроскоптың сол немесе қосымша оптикалық тармағының бойымен өтеді. Микроскоптың окуляр бөлігінде екі сәуле қайтадан қосылып, бір-біріне кедергі жасайды. Нысан арқылы өтетін сәулелердің бірі фаза бойынша кешіктіріледі (екінші сәулемен салыстырғанда жол айырмашылығын алады). Бұл кідірістің шамасы компенсатормен өлшенеді. Интерференциялық контраст әдісі фазалық контраст әдісіне ұқсас деп айта аламыз - олардың екеуі де микробөлшектен өткен және өткен сәулелердің интерференциясына негізделген. Фазалық контрастты микроскопия сияқты, бұл әдіс мөлдір және түссіз объектілерді байқауға мүмкіндік береді, бірақ олардың кескіндері де көп түсті болуы мүмкін (интерференциялық түстер). Екі әдіс те тірі ұлпалар мен жасушаларды зерттеуге жарамды және көп жағдайда осы мақсатта қолданылады. Интерференциялық микроскопияның фазалық контраст әдісінің негізгі айырмашылығы - микрообъектілер енгізген жол айырмашылықтарын өлшеу мүмкіндігі. Интерференциялық контраст әдісі көбінесе басқа микроскопиялық әдістермен, атап айтқанда поляризацияланған жарықта бақылаумен бірге қолданылады. Оны ультракүлгін микроскопиямен бірге қолдану, мысалы, объектінің жалпы құрғақ массасындағы нуклеин қышқылдарының құрамын анықтауға мүмкіндік береді. Интерференциялық микроскопия микроинтерферометрлерді қолдану әдістерін де қамтиды. Люминесценция жарығында зерттеу әдісі (люминесценциялық микроскопия немесе флуоресцентті микроскопия, микро-объектілердің көк-күлгін сәулемен немесе көзге көрінбейтін ультракүлгін сәулелермен жарықтандырылған кезде пайда болатын жасыл-қызғылт сары жарқылын микроскоппен бақылаудан тұрады. Микроскоптың оптикалық тізбегіне екі жарық сүзгілері енгізіледі.Олардың бірі конденсатордың алдына қойылады, ол сәулелендіргіш көзден не объектінің люминесценциясын қоздыратын толқын ұзындығын ғана береді (ішкі люминесценция) немесе енгізілген арнайы бояғыштар. препаратқа түседі және оның бөлшектерімен сіңеді (екінші люминесценция). Объективтен кейін орнатылған екінші сүзгі бақылаушының көзіне (немесе фотосезімтал қабатқа) тек люминесцентті сәулені жібереді. Флуоресцентті микроскопия препараттарды жоғарыдан (бұл жағдайда конденсатор ретінде де қызмет ететін линза арқылы) және төменнен кәдімгі конденсатор арқылы жарықтандыруды пайдаланады. Жоғарыдан жарықтандыру кезінде бақылау кейде «шағылған жарық люминесценция микроскопиясы» деп аталады (бұл термин шартты - препараттың люминесценциясының қозуы жарықтың қарапайым шағылысуы емес). Ол жиі өтетін жарықта фазалық контраст әдісін қолданып бақылаумен бірге қолданылады. Әдіс микробиологияда, вирусологияда, гистологияда, цитологияда, тамақ өнеркәсібінде, топырақты зерттеуде, микрохимиялық талдауда және ақауларды анықтауда кеңінен қолданылды. Қолданулардың бұл әртүрлілігі көздің өте жоғары түс сезімталдығымен және күңгірт люминесцентті емес фонда өздігінен жарқыраған объектінің кескінінің жоғары контрастымен түсіндіріледі. Сонымен қатар зерттелетін заттардың құрамы мен қасиеттері туралы, олардың люминесценттік сәулеленуінің қарқындылығы мен спектрлік құрамын білу арқылы алуға болатын мәліметтердің маңызы зор. жүктеу/скачать 25.59 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|
1 2