Модуль биотехнологиядағЫ Қолданылатын физикалық ЖӘне биофизикалық Әдістер. ДӘріс № кіріспе
Модуль 2. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ГЕНЕТИКАЛЫҚ ИНЖЕНЕРИЯ ЖӘНЕ АҚПАРАТТЫҚ ӘДІСТЕРІ
жүктеу/скачать 219.5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- ДӘРІС № 7. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ИММУНОЛОГИЯЛЫҚ ӘДІСТЕР.
- ДӘРІС № 8. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ АҚПАРАТТЫҚ ӘДІСТЕР.
| Модуль 2. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ГЕНЕТИКАЛЫҚ ИНЖЕНЕРИЯ ЖӘНЕ АҚПАРАТТЫҚ ӘДІСТЕРІ.
ДӘРІС № 6. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ ӘДІСТЕРІ. Биологтар заманауи генетикалық әдістерді пайдаланып, бактерияларды ақуызды препараттар (мысалы, рестрицирлеуші эндонуклеаза), алуан түрлі химиялық қосылыстардың, аминқышқылдардың, антибиотиктердің және т.б. өндірісі бойынша өзіндік «биологиялық фабрикиаларға» айналдыруды үйренген. Олар спецификалық гендерді бактериалды клеткалардың ішінде клондау арқылы бірегей метаболиттерді алу биосинтезінің жаңа жолдарын шығарады. Үй хайуанаттары мен адамдардың ауруларын диагностикалауға арналған зонда ретінде аурутудырушы микроорганизмдердің клондалған генін қолданады, сонымен бірге қауіпсіз әрі эффектілі вакциналарды алуға арналған изолирленген гендерді қолданады. Гендік инженерияның әдістері көмегімен биологиялық процестердің спецификалық түрде жүруіне бактериялардың белгілі бір түрлерінің табиғи қабілеттілігін күшейтуге болады. Мысалы, қоршаған ортаны ластайтын токсикалық қалдықтарды эффективті түрде бұзатын бактерия штаммдары ауылшаруашылық культураларының қарқынды өсуіне себепші болады, целлюлозаны төменмолекулалы көміртек қосылыстарына дейін ыдыратып, зиянкес жәндіктерді жояды. Молекулярлы диагностика Заманауи медицинаның және ауыл шаруашылығының жетістіктері көптеген табиғи және экологиялық факторларға байланысты (бактерия, саңырауқұлақтарға, паразиттік микроорганизмдерге және т.б.). Көптеген диагностикалық процедураларды жүзеге асыру үшін алдымен потенциалды патогенді микроорганизмнің культурасын өсіріп барып оның физиологиялық қасиеттірін спектр арқылы анализдеу керек. Бұл тәсілдер әлдеқайда эффективті және спецификалы болғанымен ұзақ уақыт алады, шығынға әкеледі. Ол бактериялардың да, паразиттік микроорганизмдердің идентификациясына да қатысты (1-кесте). Кейбіреуі культивирлеуге келмейді мысалы, хламидиоз тудырушы Chlamydiatrachomatis және жыныс жолдары арқылы таралатын аурулар. Хламидиозды диагностикалау қиын. Сондықтан кейде дұрыс емдеу жүргізілмейді. 1-кесте. Паразиттік микроорганизмдерден туындаған инфекционды аурулардың диагностикасының кейбір әдістерінің салыстырмасы.
Кез келген патогенді микроорганизмдерді анықтау әдістері қарапайым әрі жоғары спецификалы және сезімтал болуы керек. Әдістің қарапайымдылығы осы әдісті рутинді қолдануда жеткілікті түрде продуктивті, эффективті және арзан болатындығын көрсетеді. ДӘРІС № 7. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ИММУНОЛОГИЯЛЫҚ ӘДІСТЕР. Детекцияның көптеген иммунологиялық жүйелері қарапайым бола тұра, жоғары сезімталдық пен спецификалылыққа ие. Олар дәрілік препараттарды тестілеуде, әртүрлі онкологиялық аурулардың мониторингін бағалауда, спецификалық метаболиттерді анықтауда, патогенді микроағзалардың идентификациясы мен бақылауында кең қолданылады, бірақ өзіндік кемшіліктері де бар. Егер молекула-нысан ақуыз болса, онда оның детерминирлейтін гендерінің экспрессиясын қамтамасыз ету және антиденемен байланысатын сайттың жасырынуы (маскирование) немесе бұғалуы болмайтын шарттарды қалыптастыру керек. Инфекция қоздырғыштарын диагностикалаудың дәстүрлі процедуралары патогенді микроорганизмнің сипаттамалар жиынына немесе оның бірегей, оңай ажыратылатын ерекшелігіне негізделеді. Клиникалық микробиологтар оның көмегімен патогенді микроағзаларды табуға және идентификациялауға кепіл болатын биологиялық сипаттамалардың минималды жиынын табуға тырысуда. Мысалы, кейбір қоздырғыштар биологиялық үлгіде анықтау қажет арнайы биохимиялық қосылыстарды түзеді. Көбінесе мұндай маркерлі молекуланы жоғарыспецификалық биохимиялық анализ көмегімен анықтауға болады. Бірақ бұл әрекет патогенді микроорганизмдердің детекциясының жекеленген (индивидуализированный) жүйелерінің санының көбеюіне әкелеп соғады. Анағұрлым қолайлы болып, кез келген маркерлі молекуланы оның химиялық табиғатына тәуелсіз анықтауға мүмкіндік беретін әмбебап әдіс саналады. Антиген-антидене кешенінің идентификациясына негізделген әдіс дәл сондай әдіс болып табылады. Ферментті иммуносорбентті анализ Антидененің антиген-нысанмен байланысқанын анықтауға мүмкіндік беретін түрлі жолдар бар. Олардың бірі – диагностикада көп қолданылатын ферментті иммуносорбентті анализ (ELISA). Процедура келесі этаптардан тұрады. 1. Спецификалық молекула немесе микроорганизмді анықтайтын үлгіні қатты төсемеге (подложка), мысалы 26 қуысы бар пластикалық микротитрлеуші кесіндіге бекітеді. 2. Бекітілген үлгіге маркерлі молекулаға сезімтал антиденені енгізеді, содан кейін бірінші антидененің байланыспаған молекулаларынан кетіру үшін, қуысты шаяды. 3. Бірінші антиденемен өзіндік (специфический) байланысатын және маркерлі молекуламен әрекеттеспейтін екінші антиденені енгізеді. Бұл антиденеге бояламаған субстраттың боялған өнімге айналуын катализдейтін фермент жалғанған (мысалы, сілтілік фосфатаза, пероксидаза немесе уреаза). Екінші антидене-фермент конъюгатының байланыспаған молекулаларын жою үшін қуысты жуады. 4. Боялмаған субстрат енгізеді. 5. Боялған өнімнің сапалық немесе сандық анықтауын жүргізеді. Егер бірінші антидене үлгі нысанымен байланыспаса, онда ол алғашқы рет шайғанда жойылады. Бұл жағдайда екінші антидене-фермент конъюгатының байланысатын заты жоқ болғандықтан, ол екінші рет жуғанда жойылады және үлгі боялмай қалады. Егер нысанмен байланысу жүрсе, онда екінші антидене біріншімен бірігеді, конъюгирленген фермент жеңіл тіркелетін боялған өнімнің қалыптасуын катализдейді. ELISA-ның негізгі қағидасы (принципі) – бірінші антидененің нысанмен спецификалық байланысуы. Егер молекула-нысан ақуыз болса, онда оның тазаланған препаратын берілген нысанды анықтауға көмектесетін антиденелерді алу үшін пайдаланады. Иммунизирленген жануардың (әдетте қоян) қанының сарысуында пайда болатын антиденелер, молекула-нысанның әртүрлі антигенді детерминанттарымен (эпитоп) байланысады. Антиденелердің мұндай қоспасын поликлональді препарат деп атайды. Поликлональді антиденелерді пайдаланудың екі кемшілігі бар: 1) поликлональді препараттағы жекеленген антиденелер бір партиядан екінші партияға түрленіп кетуі мүмкін; 2) егер екі ұқсас нысандарды ажырату керек болса, яғни патогенді (нысан) немесе патогенді емес (нысан емес) формалар бір ғана детерминанттымен айырмашылық жасағанда, поликлональді антиденелерді қолдануға болмайды. Дегенмен қазіргі кезде бір антигенді детерминантқа арнап шығарылған, яғни моноклональді антиденелер препаратын алуды үйренгеннен соң, бұл мәселелерді шешуге мүмкіндік туды. Моноклональді антиденелер Эволюция барысында сүтқоректілерде организмді токсикалық заттардан және инфекционды агенттерден қорғайтын жасушалар жүйесінің күрделі жиыны қалыптасты. Қорғаушы реакцияның құрамдас бөлігі болып бөтен заттармен (антиген) байланысатын және иммунды жүйенің басқа ақуыздарының көмегімен, комплемент жүйесін қоса есептегенде, олардың әсерін бейтараптайтын, спецификалық ақуыздардың лимфатикалық жүйесінің жасушалармен индуцирленген өндірілуі табылады. Иммунологиялық ынталануға (стимул) жауап ретінде әрбір антидене продуцирлеуші жасуша антиген молекуласының жеке бөлігін (эпитоп, антигенді детерминант) жоғары ұқсастықпен (сродство) танитын антидененің бір ғана түрін синтездейді және бөледі. Әдетте антиген молекуласында бірнеше әртүрлі эпитоптар болатындықтан, олардың әрқайсысына қарсы антиденелер иммунды жүйенің жеке жасушаларынан бөлінеді. Мұндай, берілген антигенмен әрекеттесетін әрбір антиденелер поликлональді деп аталады. Осы ғасырдың басында, антиденелердің поликлональділігі туралы ештеңе белгісіз болғанның өзінде, олардың ерекшелігін (специфичность) инфекцияны басуда қолдануға болатыны анық еді. Кейіннен антиденелерді клиникалық үлгілердегі токсикалық қосылыстарды анықтайтын диагностикалық құрал ретінде пайдалана бастады. Өкінішке орай, кейбір жағдайда иммунизациялаған кезде антидене продуцирлеуші жасушалар берілген антигеннің бір детерминанттарымен қаттырақ стимулденетіндіктен, басқа жағдайда иммунды жүйе сол антигеннің басқа эпитоптарына белсендірек жауап беретіндіктен, поликлональді антиденелердің препараттарының әсері бір партиядан екінші партияға түрленеді (варьирует). Жеке эпитоптар түрлі әсер ететіндіктен (ынталандырушы қабілет), бұл әр түрлі препараттардың антигендерді бейтараптау қабілетіне ықпал етуі мүмкін. Демек, поликлональді антиденелердің берілген партиясында негізгі эпитопқа қарсы бағытталған молекулалар аз болуы мүмкін, соның нәтижесінде оның әсері алдыңғыға қарағанда анағұрлым төмен болады. Антиденелерді диагностикалық құрал немесе терапиялық заттар компоненті ретінде тәжірибеде қолдану үшін, культурада өсетін және антиденелердің антиген-нысанға өте ұқсайтын бір ғана түрін продуцирлейтін жасушалар линиясын – моноклональді антиденелерді шығару керек болды. Мұндай жасушалық линия антиденелердің идентикалық молекулаларының таусылмас қоры бола алар еді. Өкінішке орай, антиденелерді синтездейтін B-лимфоциттер (В-жасушалар) культурада көбейе алмайды. Мәселенің шешімі гибридті жасушаны жасап шығаруда болды. В-жасушадан генетикалық бірлікті алғаннан кейін, ол антиденелерді шығарып, сәйкес жасуша түрінен бөліну қабілетіне ие болып, культурада өсе алатын еді. В-лимфоциттер кейде қайта пайда болып, культурада өсу қабілеті мен В-жасушалардың көптеген қасиеттерін сақтай отырып ісік (миеломды) клеткаларына айналатыны белгілі болды. Осылай миеломды клеткалар, бірінші кезекте антиденелерді бөлмейтіндер, антиденені продуцирлеуші В-жасушалармен бірігетін үміткерлерге айналды. 70-ші жылдардың ортасында бұл идеялар іске асты. Бір типті антиденелерді продуцирлейтін гибридті клеткалар линиясын алу процесіндегі алғашқы қадам болып тышқандарға антигендерді енгізу табылады. Бірнеше апта бойы жүргізілген иммунизациядан кейін, жануарларда иммунды жауаптың дамуы болғанын тексереді. Егер жауап болса, онда жануарларды өлтіреді, көк бауырын алып, оны жуады, ұсақтайды және ішінде антидене продуцирлеуші В-жасушалары бар жекелеген жасушалардың босатылуы үшін әлсіз сілкиді. Көк бауыр жасушаларының қоспасын гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазаға (HGPRT-) ақаулы миеломды жасушалар қоспасымен араластырады. Комбинирленген қоспаны бірнеше минут бойы 35%-дық полиэтиленгликольде инкубирлейді, сосын гипоксангин, аминоптерин және тимидин (ГАТ ортасы) бар ортаға ауыстырады. Полиэтиленгликольмен өңдеу жасушалардың бірігуін жеңілдетеді, дегенмен бірігу сирек болады және жеткілікті деңгейде кездейсоқ жағдай болып табылады. Қосапада миелома, көк бауыр жасушалары, сонымен бірге біріккен миелома – көкбауыр, миелома – миелома, көкбауыр – көкбауыр жасушалары бар. Алайда ГАТ ортасында тек миелома – көкбауырдың гибридті жасушалары ғана өседі, ал басқа типті жасушалар онда пролиферирлене (пролиферировать) алмайды. Көкбауыр және біріккен көкбауыр – көкбауыр жасушалары культурада мүлдем өспейді, ал HGPRT-дің миеломды жасушалары және біріккен миелома – миелома жасушалары гуанин және адениннің пуринді негіздерінің биосинтезі процесінде гипоксантинді алғызат ретінде пайдалана алмайды. Бірақ оларда пуриндер синтезінің басқа табиғи жолы бар – ол дигидрофолатрекдуктазаның қатысымен жүреді, сондықтан орта құрамына осы ферменттің белсенділігін ингибирлейтін аминоптерин қосылады. Осыған байланысты HGPRT-дің миеломды жасушалары және біріккен миелома – миелома жасушалары ГАТ ортасында пуриндерді синтездей алмайды және жойылады. Көкбауыр – миелома жасушалары ГАТ ортасында өседі, себебі: 1) көкбауыр жасушалары дигидрофолатредуктазаның қатысында пуриндер синтезінің аминоптеринмен бұғалуына қарамастан, ортаның экзогенді гипоксантинін утилиздей алатын функционалды HGPRT жеткізеді; 2) миелома жасушалары белсенді бөліне алады. Тимидин дигидрофолатредуктазаның ингибирленуімен шартталған пиримидин синтезінің бұғалуын болдырмауға қажет. ГАТ ортасында жасушалардың бірігуінен кейін, 10-14 тәуліктерде тек біріккен көкбауыр-миелома жасушалары қалады және дамиды. Сосын оларды пластикалыө микротитрлеуші кесінділердің қуыстарына (лунка) енгізеді және ГАТ-сыз толық культуралды ортада өсіреді. Енді иммунизирлейтін антигенге арналған антиденелерді өндіретін гибридті жасушаларды идентифицирлеу керек. Бұл үшін әдетте секреттелетін антиденелері бар культуралды орталардың скринингін жүргізеді. Дамушы жасушалары бар қуыстардан жасалған орталарды бөліп алады және қуыстарды басқа, алдын ала антиген-нысан молекуласының қабатымен қапталған микротитрлеуші кесіндіге ауыстырады. Егер культуралды ортада берілген антигеннің бір эпитопын танитын антидене (бірінші антидене) болса, онда ол антигенмен байланысады және қуыстарды жуған соң сонда қалады. Содан кейін қуыстарға тышқан антиденелеріне сезімтал (специфичный) екінші антиденені енгізеді. Ол антигенмен байланысқан кез келген бірінші антиденеге қосылады. Иммунды анализде қолданылатын екінші антиденеге боялмайтын субстратты боялған қосылысқа айналдыратын ферментті алдын ала қосады. Қуыстардың бірінде түстің өзгеруі бастапқы культуралды ортада берілген антигенге сезімтал антидененің болғанын білдіреді. Егер мұндай антидене ортада болмаған болса, онда екінші антиденеге байланысатын зат болмайды және ол екінші рет жуғанда шайылып кетеді. Мұндай қуыстардағы субстрат боялмаған күйде қалады. Оң иммунды жауап беретін (түстің өзгеруі) ортасы бар, бастапқы микротитрлеу кесіндісіндегі қуыстарда құйылған жасушалар қоспасы болуы мүмкін. Бір жасушадан дамыған линиялар алу үшін (клондар), осындай қуыстардан жасалған жасушалық суспензияны культуралды ортамен араластырады да, басқа қуыстарға отырғызады. Алынған клондарды культивирлегеннен соң орталарды қайта тексереді, антиген-нысанды танитын моноклональды антиденелерді қай жасушалық линия (гибридома) продуцирлейтінін анықтайды. Бірден көп өзіндік (специфичный) гибридомалар алған жағдайда, ары қарай түрлі клондардан өндірілетін антиденелер бір антигенді детерминантқа қарсы бағытталды ма, жоқ па екенін анықтайды. Моноклональды антидене продуцирлейтін әрбір клонды культурада шексіз ұстауға болады. Сондай-ақ, үлгілерді сұйық азотта қатырып, ары қарай оларды жасушалар көзі ретінде пайдалануға болады. Бір ғана, қатаң түрде анықталған антигенді сайтпен ғана байланысатындықтан, моноклональды антиденелерді қолдану ELISA әдісінің ерекшелігін арттырады. Қазіргі кезде әртүрлі қосылыстар мен патогенді микроорганизмдерді анықтауда қолдануға болатын бірқатар моноклональды антиденелер алынған. E. coli көмегімен антиген-нысанға қарсы бағытталған моноклональды антиденелер мен олардың бөліктерінің (Fv-фрагменттер) таңдалып алынуы және өндірілуі гибридомды жасушалар культурасынан моноклональды антиденелерді алудың альтернативі болуы мүмкін. ДӘРІС № 8. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ АҚПАРАТТЫҚ ӘДІСТЕР. Адамның өзіндік тұқымқуалайтын ауруларын генетикалық деңгейде диагностикалау зерттелетін индивидумдар немесе олардың ұрпақтары жоғары генетикалық қауіпті топқа жататыны немесе жатпайтыны туралы сұраққа жауап береді. ДНҚ-анализді тұқымқуалайтын аурулардың генін тасушыларды анықтауда, сонымен қатар қауіпті генетикалық ауытқулардың прентальды және пресимптомды диагностикасын жүргізуде пайдалануға болады. ДНҚ деңгейінде тестілеу арқылы спецификалық мутацияларды қатесіз анықтауға болады. Бұрын бұл үшін зерттелетін ген өнімін анықтауға негізделген биохимиялық әдістер қолданылған. ДНҚ-тесттер мутантты геннің экспрессиясын жүргізуді қажет етпейді, бұл барлық моногенді ауруларға арналған скрининг жүйесін ойлап табуға мүмкіндік жасайды. Орақ тәрізді клеткалы анемия Орақ тәрізді клеткалы анемия – кодондағы гемоглобин молекуласының -тізбегіндегі алтыншы амин қышқылына сәйкес келетін нуклеотидтің біреуінің алмасуымен сипатталатын генетикалық ауру. Мутантты гені (S/S) гомозиготалы науқастарда эритроциттері ерекше орақ тәріздес пішінге ие; бұл гемоглобин молекуласында валиннің глутамин қышқылына алмасуы салдарынан конформациясының бұрмалануына байланысты. Мутантты гемоглобин жеткілікті мөлшерде оттегін тасымалдай алмайды, осындай науқастарда жүрек, өкпе, ми, буындар үдемелі түрде зақымдалатын қауіпті анемия дамиды. Берілген гені бойынша гетерозиготалы (A/S) (генетикалық ауруды тасушылар) науқастарда эритроциттер қалыпты (нормальная) пішінге ие және аурудың белгілері тек экстремалды жағдайларда ғана байқалады (аса биік жерлерде немесе организмнің оттегімен қамтылуы төмендеген кездегі тым жоғары немесе төмен температураларда). Егер ата-ананың екеуі де гетерозиготалы болса (генотипі A/S), онда олардың балалары мутантты ген бойынша гомозиготалы (S/S) болу ықтималдығы 25%. Орақ тәрізді клеткалық анемияның гені жоғарғы жиілікпен афроамерикандықтар мен олардың ұрпақтарында, сонымен бірге латиноамерикандықтарда кездеседі. АҚШ-та орақ тәрізді анемия генін өзінің ұрпақтарына бере алатын тасушыларды анықтау мақсатында скрининг жүргізіледі. Осы үшін пайдаланылатын тесттердің біреуін қарастырып көрейік. Орақ тәрізді анемияға әкелетін -глобинді гендегі бір нуклеотидтің алмасуы рестицирлеуші CvnI. эндонуклеазаға арналған сайттың элиминациясымен сүйемелденеді (сопровождается). Бұл фермент CCTNAGG ретін таниды және ДНҚ молекуласын С және Т негіздері (N – төрт нуклеотидтің кез келгені) арасында ыдыратады. Қалыпты генде бұл рет мынандай түрге CCTGAGG, ал орақ тәрізді анемия генінде – ССТGTGG түріне ие. Берілген аурудың ДНҚ-диагностикасы осы айырмашылыққа негізделеді. CvnI сайтын фланкирлеуші праймерлерді қолдана отырып, ПЦР көмегімен тестіленетін ДНҚ-ның азғантай мөлшерін амплифицирлейді. Амплифицирленген фрагментті CvnI өңдейді, рестрикция өнімдерін гель-электрофорезбен бөледі және оларды бромды этидимен бояйды. Cvn1-сайты болған жағдайда электрофореграммада спецификалық жолақтардың жинағы пайда болады. Сипатталған әдіс арқылы гибридизация жүргізбей-ақ, зерттелетін заттың генетикалық статусын қиындықсыз және жылдам анықтауға болады. ПЦР/ЛОЗ әдісі Ақаулы гендердің пайда болуына әкелетін генетикалық бұзылулардың рестрикция сайтының жоғалуы немесе өзгеруімен барлығы (не все) сүйемелденбейді, сондықтан бір нуклеотидті ауыстырудың (замена) орнына басқаларды да қолданады. Олардың біреуінде ПЦР және олигонуклеотидті зондтардың (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ дотирлеуіне негізделген әдіс біріккен. Қалыпты геннің белгілі сайтында (мысалы, 106-шы орында) А-Т жұбы, ал мутантты геннің дәл сондай сайтында G-S жұбы бар делік. 106-шы нуклеотидті фланкирлейтін нуклеотидті реттілікті біле отырып, берілген сайтқа жабысқан және қарама-қарсы тізбектерге комплементарлы екі қысқа (20-нуклеотидті) фрагментті синтездеуге болады. Олигонуклеотидтердің бұл жұптарының негізгі ерекшелігі – біріншісінің З'-ұштық нуклеотиді (Х зонд) 106-шы орында қалыпты ретпен орналасқан негізге комплементарлы, ал екіншісінің 5'-ұштық нуклеотиді (Y зонд) 106-шы нуклеотидке жабысқан нуклеотидке комплементарлы. ДНҚ-нысанмен қалыпты реттілікке ие осы зондтарды жағу (отжиг) кезінде олардың толық гибридизациясы жүреді, ДНҚ-лигазасының реакционды қоспасын қосқан кезде, X және Y зондтары ковалентті тігіледі. Егер бұл зондтар мутантты ДНҚ-мен жағылған болса, онда оған комплементарлы емес X зондының 3'-ұштық нуклеотиді онымен жұп түзе алмайды. Y зонды бұрынғыдай толығымен гибридизацияланғанымен, ДНҚ-лигаза X және Y зондтарын тіге алмайды. Мутантты 106-шы нуклеотидтің реттілігіне толық сәйкес келетін басқа да олигонуклеотидті зондтарды синтездеуге болады. Зондтардың мұндай жиынында лигирлеу (лигирование) олардың мутантты ДНҚ-нысанымен жағылуы кезінде болады және қалыпты нысанмен жағылуы кезінде болмайды. Осыған орай, ПЦР/ЛОЗ әдісі екі жағдайды ажыратады: зондтарды лигирлеу және лигирлеудің болмауы. Лигирлеу жүргенін тексеру үшін X зондының 5'-ұшын биотинмен, ал Y зондының З'-ұшын сәйкес антиденемен байланысатын төменмолекулалы қосылыс – дигоксигенинмен белгілейді. Гибридизация мен лигирлеуден кейін гибридизацияланған зондты босату үшін ДНҚ денатурациясын жүргізеді және қоспаны стрептавидинмен қапталған кішірек пластикалық қуысқа ауыстырады. Стрептаввидинмен байланысқан биотинилирленген зондтан басқа барлық материалды жою үшін қуысты жуады. Сосын алдын ала сілтілі фосфатазамен байланысқан дигоксигенинге антиденені енгізеді. Байланыспаған конъюгаттың жойылуы болатын шаюдан кейін түссіз хромогенді субстратты қосады. Ерітіндідегі бояу дигоксигенинмен белгіленген (меченный) зонды бар дигоксигенин антиденемен байланысқанын, яғни зонд биотинмен белгіленген зондпен лигирленгенін білдіреді. Егер бояу болмаса, онда лигирлеу болмағаны. Екі жұп болғанда кез келген адамның генетикалық деңгейін анықтауға болады. Мысалы, гетерозиготалы тасушылардың ДНҚ-сы зондтардың екі жұбымен де, қалыпты геннің екі көшірмесі бар ДНҚ иелері тек қалыпты сайтқа комплементарлы нуклеотиді бар зондтар жиынымен, екі геннің өзгертілген көшірмелері бар индивидтер ДНҚ-сы тек мутантты сайтты детектирлейтін зондтар жұбымен ғана оң нәтиже береді. Анализге қажетті бастапқы ДНҚ мөлшерін минимизациялау үшін, гибридизация алдында тестіленетін сайтқа ие ДНҚ-нысан бөлігін ПЦР көмегімен амплифицирлейді. ПЦР/ЛОЗ жылдам, сезімтал және жоғарыспецификалық әдіс болып табылады. Оның барлық деңгейлері күніне 1200-ге дейін тест жүргізуге мүмкіндік беретіндей етіп роботизацияланған. ПЦР/ЛОЗ-дың біршама қарапайым әдісі болып лигазды тізбекті реакция табылады. Тестіленетін ДНҚ-ны термотұрықты ДНҚ-лигаза қатысында қалған екі индикаторлы зондпен араластырады. Лигирлеуді 65°С-та жүргізеді, сосын пайда болған зонд гибридтері – ДНҚ-нысанның денатурациясы жүруі үшін температураны 94°С-қа дейін көтереді, ДНҚ-нысаны бар бос лигирленбеген индикаторлы ЛОЗ-зондтарын гибридизациялау мақсатында температураны қайта 65°С-қа төмендетеді. Бұл циклды 20 рет қайталайды. Егер индикаторлы ЛОЗ-зондтар ДНҚ-нысанға толық комплементарлы болса, онда лигирлеу әр циклда болады және 20 циклдан кейін электрофорез немесе ELISA көмегімен анықталатындай жеткілікті лигирлеу өнімдері («тігілген» X және Y зондтары) жинақталады. Егер комплементарлық толық болмаса, лигирлеу болмайды және ешқандай өнімдер тіркелмейді. Флуоресцентті белгіленген ПЦР-праймерлерді қолдану арқылы генотипирлеу Колориметриялық генотипирлеу әртүрлі флуоресцентті бояғыштармен белгіленген ПЦР-праймерлерді пайдалануға негізделген. Мутантты ДНҚ мен жабайы типті ДНҚ-ны ажырату үшін, ПЦР-ді екі әр түрлі праймерлермен жүргізеді. Олардың бірі (P1) жабайы типті ДНҚ-мен комплементарлы және 5'-ұшында родаминмен (қызыл түс), екіншісі (P3) мутантты ДНҚ-ға комплементарлы және 5'-ұшында флуоресцеинмен (жасыл түс) белгіленген. Екі жағдайда да амплификацияны қарама-қарсы тізбекке комплементарлы, үшінші белгіленбеген праймер (P2) қатысында жүргізеді. ПЦР тек праймер ДНҚ-нысанға толық комплементарлы болған кезде ғана жүре алатындықтан, реакционды қоспада барлық үш праймер болғанда не жабайы типті ДНҚ, не мутантты ДНҚ, не болмаса матрица рөліндегі ДНҚ-нысанға байланысты олардың екеуі де амплифицирленеді. Егер жабайы типті ДНҚ бойынша индивид гомозиготалы болса, онда ПЦР жүргізген соң және артық праймерлерді жойғаннан кейін қызыл түсті флуоресценция байқалады, ал егер мутантты ДНҚ бойынша гомозиготалы болса – жасыл, егер мутантты ДНҚ да, жабайы типті ДНҚ да (яғни индивид гетерозиготалы) болса – сары. Бұл әдісті белгілі нуклеотидті реттілікке ие кез келген гендегі кез келген бірнуклеотидті сайт-нысанға сай автоматизациялауға және бейімдеуге болады. Бір геннің әр түрлі сайттарындағы мутациялар Барлық (не все) генетикалық аурулар гендегі бір ғана спецификалық өзгеріске негізделмейді. Көпшілік жағдайларда мутациялар бір геннің түрлі сайттарында жүреді, бірақ олар бір генетикалық ауруға әкеледі. Мысал ретінде -глобиннің белсенділігін жоғалтумен байланысты тұқым қуалайтын ауру – -талассемияны келтіруге болады. Гетерозиготалы тасушыларда бұл жағдайда аздаған анемия байқалады. Мүмкін болатын мутантты сайттардың кем дегенде сегізден бірі гомозиготалы болатын индивидтер тіршілігін сақтау үшін үнемі қан құю мен басқа емдерге мұқтаж. -глобинді геннің сегіз спецификалық сайтындағы кез келген мутация -талассемияға әкелетіндіктен, кем дегенде сегіз әртүрлі тест жүргізу қажет. Қымбат болса да, мұндай диагностика жасауға болады. Бір геннің әртүрлі сайтында пайда болатын мутациялар скринингі үшін, бір реакция жүргізуге негізделген ПЦР/гибридизация стратегиясы ойлап табылды. Ол үшін белгілі мутацияны тасушы ген-нысан фрагментіне әрқайсысы толық комплементарлы 20-нуклеотидті зондтардың спецификалық жиынын синтездейді. Әр зондтың 3'-ұшына ұзындығы шамамен 400 нуклеотидке тең poly (dT) гомополимері жалғанған, оның көмегімен ДНҚ-зонд найлонды фильтрде алдын ала белгіленген нүктемен байланысады, ал оның қалған бөлігі бос қалады және гибридизацияланады. Мүмкін болатын мутантты сайттардың біреуіне ие тестіленетін ДНҚ сегменттері ПЦР көмегімен бір уақытта амплифицирленеді, әр жұптың бір праймері 5'-ұшында биотиппен белгіленген. ДНҚ-нысанның амплифицирленген фрагменттері тек толық комплементарлы реттіліктердің гибридизациясын қамтамасыз ететін жағдайларда ғана фильтрге тігілген зондтармен гибридизацияланады. Гибридизациялық қоспаға сілтілі фосфатазамен (сонымен қатар хрен пероксидазасы мен уреазаны пайдалануға болады) байланысқан стрептавидин қосады. Гибридизациядан кейін фильтрді жуады және боялмаған субстратты енгізеді. ДНҚ-нысанның амплифицирленген сегменті мен спецификалық олигонуклеотидті зонд арасында толық сәйкестік болса, онда фильтрде түрлі түсті нүкте қалыптасады. Бір фильтрге әртүрлі спецификалық олигонуклеотидті зондтардың толық қатарына сай келетін бірнеше нүкте салуға болады. Осы түрлі түсті мозаиканы анализдеу арқылы көптеген мүмкін болатын мутация сайттарының біреуін идентификациялауға мүмкіндік бар. Молекулярлы диагностика – тез дамып келе жатқан бағыт. Оның негізгі принциптері қалыптасқанымен, жеке тесттердің техникалық бөлімдері (технические детали) айырмашылық жасайды. Қазіргі кезде ДНҚ-нысанның жеткілікті мөлшерін алу үшін ПЦР-ді тиімді пайдаланады. ПЦР мен спецификалық зондтарды қолдану тесттердің сезімталдыған жоғарылатады және радиоактивті емес хромогенді, хемилюминесцентті және флуоресцентті тіркеу жүйелерін пайдалануға мүмкіндік жасайды. Көбінесе мутацияны немесе инфекционды агенттің экзогенді ДНҚ-сын анықтау үшін өнімдерді келесілік электрофоретикалық бөлумен ПЦР жүргізу жеткілікті. ДНҚ-диагностикасы көмегімен көптеген, тіпті кең тараған генетикалық және инфекционды ауруларды, сонымен қатар жаңа туындағандардың барлығын дерлік анықтау мүмкіндігі күмән тудырмайды. жүктеу/скачать 219.5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|