Научно-издательский центр «Открытие» otkritieinfo ru Современная биология: вопросы и ответы материалы I международной научной конференции

Из изучаемых видов более широко распространен E.maracandica. Ареал его значительно более широко по сравнению с ареалом E.Wilkinsi. Северная граница распространения его достигает 35^о5' с.ш. и проходит через район г. Томска в западной Сибири. Далее граница проходит несколько южнее г. Омска, через районы Кустаная, Уральска и круто спускается по нижнему течению реки Урал к Гуриву, затем граница ареала E.maracandica идет по Европейскому берегу Каспийского моря (через Дагестан) до южных границ СНГ с Ираном.

К востоку от Томска граница ареала клопа в СНГ достигает г. Минусинка Красноярского края, восточнее этого пункта клоп не был обнаружен в пределах СНГ. Отсюда граница встречаемости клопа резко спускается к югу, захватывая Зайсанский район Восточно-Казахстанской области, заходит в Китайскую Народную республику на Ликчун (Синь-Цзинь), затем проходит через Алашань и достигает Ордоса, который является границей на востоке.

Нижняя граница распространения клопа проходит через 35^о5' с.ш., охватывая на западе районы Тегерана и Шахрида в Иране (Колл – ЗИН); далее граница заходит в Туркмении, захватывая окрестности г. Ашхабада (Мариц-Романова, 1927), районы г. Термеза Сурхандарьинской области Узбекистана и проходя по долине реки Пяндж, клоп достигает района Кундуз Северного Афганистана. Затем граница ареала идет через Северный Кашмир, заходит в Китайскую народную республику, в Кашгарию и, захватывая Цайдам, достигает Ордоса.

Распространенные вредители капусты, редьки, репы, рапса и других капустных (крестоцветных) культур.

Взрослые особи имеют длину тела от 5 до 10 мм, 3-х члениковые лапки, 5-члениковые усики, прикрепляющиеся на нижней поверхности головы. Тело клопов пестрое, с окраской, отличающейся в зависимости от вида клопов. У крестоцветного клопа (Eurydema oleracea L.) отчетливо обозначены пятна и полоски беловатого, оранжевого или красного цвета.

Зимуют взрослые клопы на огородах, в оврагах, зарослях сорняков, лесной подстилке. В конце апреля - начале мая клопы начинают питаться капустными сорняками и ранними капустными овощами - редисом, рассадой капусты и т.д. В начале лета самки откладывают яйца, из которых через 1-2 недели появляются личинки. Через месяц появляются взрослые клопы. В средней полосе России крестоцветные клопы дают одно поколение в год, на юге один из видов - разукрашенный клоп - может давать два поколения.

Вредят взрослые клопы и их личинки. Они наносят листьям капусты и других капустных растений механические повреждения, прокалывая их кожицу и высасывая сок. На листьях остается ранка, которая вскоре превращается в желтое пятно из-за выделяемой клопом слюны. В этой слюне содержатся ферменты, которые омертвляют клетки листа. Поэтому крестоцветные клопы могут наносить существенные повреждения растениям, особенно всходам и рассаде, которая при этом увядает, скручивается, а иногда и гибнет. У взрослых растений снижается продуктивность. Наносимый вред усиливается в условиях засухи.

У крестоцветных клопов имеются естественные враги - муха пестрая фазия, заражающая взрослых клопов, и триссолькус, паразитирующий на яйцах клопов.

Меры борьбы

Для предотвращения массового появления блошек на садовых участках и огородах нужно регулярно пропалывать сорняки из семейства Капустные: пастушью сумку, ярутку полевую, сурепицу, свербигу (которую любят в народе за вкусные молодые стебли), бурачок, жерушник и др. После уборки капустных культур нужно собирать и уничтожать растительные остатки (высушивать и сжигать их). Большое значение имеет ранняя высадка рассады капусты.

Применение химических препаратов (Актеллик, Фосбецид) в производственных условиях целесообразно при превышении экономического порога вредоностности: более 2 клопов на растении в период образования кочана. Для этого в поле в шахматном порядке осматривают 20 проб по 5 растений и подсчитывают вредителей.

1. 
   Ганиев М.М., Недорезков В.Д., Ганиев Р.М. Защита овощный культур. - Уфа: изд-во БГАУ, 2001. - 415 с.
   
2. 
   Кочаргин В.Н., Белолипецкий А.В. Защита сада и огорода от вредителей, болезней и сорняков: Справочник. - М.: Колос, 1993. - 318 с.
   
3. 
   Волков С.М., Зимин Л.С., Руденко Д.К., Тупеневич С.М. Альбом вредителей и болезней сельскохозяйственных культур Нечерноземной полосы европейской части СССР. - М.-Л.: СЕЛЬХОЗГИЗ, 1955. - 486 с.
   

В микобактериях трегалоза в свободном виде встречается в относительно малых количествах. Она находится в клеточной стенке в виде гликолипида димиколата трегалозы, названного «корд фактор» и содержащего трегалозу, связанную с двумя остатками миколовых кислот. Трегалоза является предшественником и других неотъемлимых липидов клеточной стенки микобактерий: диацилтрегалозы, полиацилтрегалозы, сульфолипидов. За счет анаболизма этих липидов микобактериальные клетки способны адаптироваться к окислительному стрессу как in vitro, так и in vivo [4]. При этом многие виды микобактерий способны к переходу в «некультивируемое» (НК) состояние, с которым связывают латентную форму такого распространенного инфекционного заболевания, как туберкулез. И в настоящее время нет данных о тенденции синтеза трегалозы микобактериями при образовании НК форм. Поэтому целью данного исследования стало выявление трегалозы в клетках M. smegmatis и сравнение ее уровня в in vitro модели НК состояния c содержанием в клетках, не испытывающих стрессовых воздействий.

В качестве объектов исследования были выбраны клетки на начальном этапе роста (26 ч, КОЕ/мл~10⁸) (рис.1), культивируемые в стандартных условиях (рост в среде Hartman’s-de-Bont (H-dB)), а также в стрессовых условиях, приводящих к образованию НК форм (рост клеток M. smegmatis mc²155 в модифицированной среде Hartman’s-de-Bont (mH-dB)). Главным отличием ростовой среды mH-dB от стандартной H-dB является отсутствие солей калия и наличие бычьего сывороточного альбумина (БСА), обладающей ограниченной связывающей способностью (~ 25%) по отношению к свободным жирным кислотам.


Рис. 1. Рост M. smegmatis в средах H-dB и mH-dB
Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием и высушили на роторном испарителе. Сухую биомассу экстрагировали дистиллированной водой в соотношении вода:биомасса 35:1 по массе в течение 4-х часов при температуре 95-97ºС. Определение количества внутриклеточной трегалозы проводили с помощью тонкослойной хроматографии в системе 1-пропанол:этилацетат:вода 6:1:3 с визуализацией 10% серной кислотой в этиловом спирте с прожиганием и последующей обработкой хроматограмм с использованием компьютерной программы денситометр «Sorbfil».

Для подтверждения химической структуры экстрагируемого вещества оно было выделено при помощи колоночной хроматографии и проанализировано методом ¹Н-ЯМР спектроскопии. В спектре присутствовали пики характерные для дисахарида трегалозы.

По данным, полученным в ходе работы, можно сделать вывод, что уровень трегалозы в клетках M. smegmatis, попадающих в неблагоприятные условия, выше в 2,7 раза по отношению к уровню в клетках, растущих в стандартных условиях уже на первые сутки роста (рис. 2). Полученный результат хорошо согласуется с данными, известными относительно других микроорганизмов и говорит о необходимости запасания трегалозы клетками микобактерий как вещества, позволяющего приспособиться к неблагоприятным условиям и образовывать формы, способные существовать в условиях стресса.

Рис. 2. Уровень внутриклеточной трегалозы в активных и НК клетках M. smegmatis на 26 час роста, % от 1 клетки

1. Van Dijck P., Vizza D. C., Smet P., Thevelein J. M. Differential importance of trehalose in stress resistance in fermenting and nonfermenting Saccharomyces cerevisiae cells. // Applied and environmental microbiology. 1995. V. 61. P. 109–115

2. Arguelles J. C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts: a comparative analysis. // Arch Microbiol. 2000. V. 174. P. 217–224

3. Galinski E.A., Herzog R.M. The role of trehalose as a substitute for nitrogen-containing compatible solutes (Ectothiorhodospira halochloris). // Arch Microbiol. 1990. V. 153. P. 607–613

4. Singh A., Crossman D.K., Mai D. Mycobacterium tuberculosis WhiB3 maintains redox homeostasis by regulating virulence lipid anabolism to modulate macrophage response. // PLoS Pathogens. 2009. V. 8. P. 1 – 13


АТФАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТЕРА, БЕЛКА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ MRP7

Е. В. Малофеева¹, А. Н. Фаттахова¹, E. Hopper-Borge<sup>2

1</sup>Казанский Федеральный (Приволжский) университет

Казань, ул. Университетская 18, Россия, 420111

Katrin537@yandex.ru

²Fox Chase Cancer Center, Dr. Hopper-Borge Laboratory W463,

333 Cottman Avenue Philadelphia, PA, 19111
В настоящее время множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), способность клеток становится нечувствительными к химиотерапии, является одной из немаловажных проблем в онкологии и биологии. Механизмов проявления МЛУ существует несколько, одним из таких является повышенная экспрессия генов, ответственных за кодирование АТФ-зависимых белков-транспортеров, которые так и принято называть – белки множественной лекарственной устойчивости. На данный момент основной задачей в этом направлении является поиск веществ, способных ингибировать активность данных белков.

MRP7 является седьмым членом данного семейства и остается наименее изученным белком. Основной целью данной работы является изучение биохимических особенностей MRP7 с целью использования этих данных для построения полной картины о механизме действия данного белка, что в дальнейшем станет основой для поиска веществ-ингибиторов активности MRP7.

Для изучения биохимической активности белка была использована мембранная фракция клеток насекомых HiFive с повышенной экспрессией MRP7, полученной при трансфекции с MRP7-бацилловирусом. С помощью АТФазного анализа нами было показано, что эстрадиол глюкуронид и лейкотриен C4, являющиеся субстратами для MRP1, оказывают стимулирующий эффект на MRP7 активность, увеличивая ее на 35% и 45%, соответственно. Также тамоксифен, использующийся в лечении рака молочной железы, мастопатии, рака почки и меланомы, стимулирует активность MRP7 на 37%. Однако глутатион, субстрат MRP1, ингибирует активность MRP7 при концентрации 7µM. Ранее, было установлено, что MRP7 in vitro придает устойчивость клеткам к некоторым противоопухолевым веществам и нуклеотидным аналогам. В данной работе мы показали, что MRP7- АТФазная активность возрастает на 24% для доцетаксела, на 31% для цитозин арабинозида, на 15% для паклитаксела и на 24% для эпотилона В, но для цисплатины активность уменьшается. С целью определения влияния комбинации субстрат-противоопухолевое вещество на активность MRP7 был поставлен опыт, в котором обнаружено, что лейкотриен стимулирующая MRP7-АТФазная активность синергически возрастает при добавлении эпотилона В, однако цисплатина и цитозин арабинозид снижают АТФазную активность при тех же условиях.

Таким образом, данный тест может быть использован в качестве быстрого скрининга модуляторов АТФазаной активности белка для поиска ингибиторов транспортеров MRP семейства.

Для изучения влияния ионов металлов на активность лектинов Kalanchoe Blossfeldiana мы применили два метода: внесение растворов солей металлов в среду выращивания растений и добавления растворов солей металлов различной концентрации непосредственно при проведении реакции гемагглютинации с эритроцитами. Первым методом мы исследовали влияние ионов металлов на биосинтез лектинов in vivo, а вторым – влияние ионов металлов на активность лектинов в РГА in vitro, то есть химическое взаимодействие металлов с лектинами.

Исследование влияние ионов металлов на синтез лектинов in vivo мы проводили с использованием введения в состав сред катионов металлов в виде солей. Использовались следующие соли: магния сульфат, кальция хлорид, дисульфид молибдена, сульфат меди, хлорид железа, нитрат серебра. Растворы разводили до 0,4мМ и поливали ими разные растения (по 5мл) один раз в день. Другая поливка растений полностью исключалась. Растительное сырьё брали через 3-5-7 дней и определяли в нём лектиновую активность, концентрацию белков методом Лоури.

Для выделения и очистки фитолектинов листья Kalanchoe Blossfeldiana суспензировались и заливались ацетатным буфером (рН 3,8), помещались в холод 4⁰С на 12 часов, а затем центрифугировались при 3000 об/мин – 15 мин. Далее использовался супернатант. Для постановки РГА использовались следующие соли металлов: магния сульфат, кальция хлорид, дисульфид молибдена, сульфат меди, хлорид железа, нитрат серебра. Растворы солей разводились дистиллированной водой до концентрации 0,2 мМ. РГА ставилась следующим образом: в каждую лунку вводилось по 0,05 мл раствора лектина, затем в первую лунку 0,05 мл раствора соли металла, который разбавлялся каждый раз в 2 раза до последней лунки. Инкубация соли металла с лектином составила 40 минут при температуре 40⁰С. После инкубации в каждую лунку вводилось 0,05мл суспензии эритроцитов. РГА отмечалась через 40 минут после инкубации 40⁰С. Анализ лектиновой активности проводился по реакции гемагглютинации с эритроцитами разной групповой принадлежности крови, взятой у практически здоровых волонтеров.

Для интерпретации результатов работы и достоверности исследований (каждый опыт проводился с 10 волонтёрами каждой группы крови – всего участвовало 40 волонтёров), была проведена статистическая обработка данных с помощью пакета программ «Statistika for Windows», для статистического анализа данных использовались методы, предусматривающие определение среднеарифметических параметров и ошибок по Боровику (2001).

Анализ результатов:

Изучая зависимость активности лектинов Kalanchoe Blossfeldiana от присутствия солей металлов в среде выращивания, мы установили, что одним из факторов, влияющих на эту активность, является присутствие в среде культивирования солей следующих металлов: магния, кальция, меди. Наибольшая активность лектинов проявлялась в среде с содержанием кальция.

Полученные данные для металлов, позволяют составить последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта Ме²⁺ на активность лектинов Kalanchoe Blossfeldiana: Ca > Mg > Cu > Fe > Mo> Ag.

При исследовании влияния ионов металлов на активность лектинов в РГА in vitro мы получили аналогичные данные.

Механизм биологического воздействия ионов металлов на увеличение количества и активности лектинов растений связан, вероятно, с влиянием на ферментативные системы растений, развитием окислительного стресса, а вследствие этого увеличения количества защитных белков. За счёт нескомпенсированных связей ионы металлов легко образуют комплексные соединения с органическими веществами, в результате чего синтезируются и активируются различные ферменты, влияющие на углеводный и азотный обмены, в том числе биосинтез лектинов, о чем свидетельствуют результаты наших исследований.

Механизм положительного влияния катионов металлов на лектиновую активность in vitro состоит в том, что они образуют смешаннолигандные комплексы с гидроксильными группами лектинов и гликоконъюгатов, способствуя обратимому связыванию гликоконъюгатов лектинами. Различия взаимодействия с разными металлами определяются термодинамикой реакций комплексообразования, прочностью связи металл - кислород.

1. Гараева Л. Д., Поздеева С. А., Тимофеева О. А., Хохлова Л. П. Лектины клеточной стенки при закаливании к холоду озимой пшеницы // Физиология растений. — 2006. — 53, № 6. — С. 845— 850.

2. Ковальчук Н.В., Мусатенко Л.I. Лектини при дозріванні насіння квасолі // Доп. НАН України. — 2000. — № 7. — С. 169—173.

3. Усачев С. А., Ямалеева А. А. Изучение гемагглютинирующей активности лектинов Kalanchoe blossfeldiana, Chelidonium majus и перспективы их применения в медицине // Материалы международной заочной научно-практической конференции «Естественные науки: актуальные вопросы и тенденции развития», Новосибирск, 2011

4. Шакирова Ф. М., Безрукова М. В., Шаяхметов И. Ф. Влияние теплового стресса на динамику накопления АБК и лектина в клетках каллуса пшеницы // Физиология растений. — 1995. — 42, № 5. — С. 700—702.

Секция 4. Генетика
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИНТЕРВАЛЬНЫХ ОЦЕНОК ИЗБЫТОЧНОСТИ СИНОНИМИЧНЫХ КОДОНОВ мРНК ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Д. Б. Корнев, А. В. Дмитриев

Елецкий государственный университет имени И.А. Бунина, г. Елец Липецкой области, Российская Федерация, a_v_dmitriev@mail.ru
Одна из особенностей генетического кода, в соответствии с которым информация, заключенная в ДНК, материализуется при посредничестве мРНК в функциональные белки, – его избыточность, которая заключается в том, что некоторые аминокислоты кодируются не одним, а несколькими синонимичными кодонами [1]. Начиная с 60-х годов прошлого века, когда был разгадан генетический кода, и по настоящее время, природа его избыточности остается загадкой.

С 1980 гг. и по настоящее время, результаты исследований избыточности синонимичных кодонов аминокислотами крайне ограничены. Авторами [2] показано, что родственные организмы имеют сходный тип предпочтения кодонов, т.е. частота использования одного кодона из серии синонимичных больше чем для других. Типы предпочтения кодонов для млекопитающих, некоторых бактерий и дрожжей оказались различными [2]. Было обнаружено, что предпочтение кодонов связано с количеством соответствующих кодону тРНК и со степенью экспрессии данного гена. Кроме того, многие тРНК способны опознавать не только «свой» кодон, но и некоторые другие. Как правило тРНК, распознающие более одного синонимичного кодона, опознают их разной эффективность. Все это также влияет на выбор кодонов.

Исходной информацией для нашего исследования являются последовательности оснований мРНК различных организмов, взятые из NCBI (National Center for Biotechnology Information). Для представления количественной информации по избыточности синонимичных кодонов в табличной форме удобной для статистического анализа, на языке программирования Java, нами написана компьютерная программа «RGC v1.0». Ее исходными данными служат пакетные файлы в формате «GenBank (full)», генерируемые на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov. «RGC v1.0» открывает полученные с сайта NCBI файлы, анализирует их: пересчитывает количество исследуемых объектов, рассчитывает избыточность для каждого из них. Результаты работы программы генерируются в файл, которые далее импортируются в табличный редактор MS Excel.

В качестве числовых характеристик избыточности, нами предложено использовать относительную избыточность синонимичного кодона (отношение числа данного кодона в последовательности к общему числу кодонов) и относительную избыточность аминокислоты (отношение числа кодонов в последовательности, которые кодируют данную аминокислоту, к максимально возможному числу кодонов для данной аминокислоты). Для установления закономерностей в таблицах избыточности мы рассчитывали выборочные средние значения избыточности и их доверительные интервалы при α=0.05 [4]. Нами исследованы избыточности мРНК следующих организмов – артроподов: комаров (V=98751) и белокрылок (V=131022); хордовых: окунеобразные (V=137204) и ланцетниковые (V=30663); человека (V=225636). Здесь, V – объем выборки.

Сравнением интервальных оценок средних значений избыточности, установлено, что родственные организмы, такие как комары и белокрылки, окунеобразные и ланцетниковые, имеют сходный тип предпочтения кодонов. Так, в хордовых и артроподах наиболее часто Ala кодируется GCC; Asn – AAC; Asp – GAC; Gln – CAG; Gly – GGA, GGC; His – CAC; Ile – AUC, Leu – CUG; Phe – UUC; Thr – ACC; Tyr – UAC; Val – GUG. Для аминокислот Arg, Cys, Glu, Lys, Pro и Ser частота использования синонимичных кодонов одинакова. Примечательно, что подобная схема выбора кодонов характерна и для человека. Кроме того, артроподы, хордовые и человек для кодирования аминокислот отдают предпочтение кодонам, содержащим G или C (частота 0.5); менее часто – A или U (частота 0.3). Возможно, объяснением этому является то, что, не смотря на случайность выбора, нами исследовались гены, расположенные в GC-богатых участках генома и, следовательно, в отличие от простых организмов, указанные предпочтения не связаны с оптимизацией белкового синтеза. Действительно, геном млекопитающих состоит из крупных блоков, и у каждого из них – свой нуклеотидный состав: одни обогащены AT-парами, другие – GC. В результате гены, расположенные в GC-богатых участках генома, содержат эти основания в относительно большом количестве.

Сравнительный анализ относительных избыточностей аминокислот для различных организмов показал, что избыточность всех аминокислот хордовых и артроподов практически совпадает, но несколько больше человека. Таким образом, мРНК хордовых и артроподов используют больший набор кодонов, из числа максимально возможных для данной аминокислоты, чем мРНК человека.

Полученные нами результаты могут быть использованы в изучении эволюции генетического кода [5], природы заболеваний, связанных с молчащими мутациями [1], и поиске новых способов их лечения.
Литература

1. Херст Л., Шамари Ж.-В. Цена молчащих мутаций // В мире науки. 2009. №8. С. 27-33.

2. Grantham R., Gautier C., Gouy M., Mercier R., Pavé A. Codon catalog usage and the genome hypothesis // Nucleic Acids Research. 1980. V.8. P. 49-62.

3. Sharp P., Cowe E., Higgins D., Shields D., Wright F. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity // Nucleic Acids Research. 1988. V.16. P. 8207-8211.

4. Дмитриев А.В. Теория вероятностей и математическая статистика: учебное пособие / Дмитриев А.В. - Липецк: Издательский дом «Липецкая газета», 2009. - 234 с.

5. Дмитриев А.В. Структурные и функциональные характеристики природных и хирально модифицированных модельных ионных каналов / Автореферат дисс. на соиск. уч. степени д-ра физ.-мат. наук. - М.: 2009. - 50 с.